三种失眠小鼠模型制备方法的比较与评价

doi:10.12307/2026.749

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (18): 4685-4693.doi: 10.12307/2026.749

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三种失眠小鼠模型制备方法的比较与评价

李非凡，张怡博，王静，朱金墙，郑文科

天津中医药大学中医药研究院，天津市 301617

收稿日期:2025-07-01 接受日期:2025-09-24 出版日期:2026-06-28 发布日期:2025-12-06
通讯作者: 朱金墙，博士，副研究员，天津中医药大学中医药研究院，天津市 301617 通讯作者：郑文科，博士，研究员，天津中医药大学中医药研究院，天津市 301617
作者简介:李非凡，女，2000年生，辽宁省昌图县人，汉族，天津中医药大学在读硕士，主要从事中药药理学的研究。
基金资助:
天津市卫生健康委员会中医中西医结合科研课题(2023079)，项目负责人：朱金墙；黑龙江省“揭榜挂帅”科技攻关(2023ZXJ02C01)，项目负责人：郑文科

Comparison and evaluation of three methods for preparing insomnia mouse models

Li Feifan, Zhang Yibo, Wang Jing, Zhu Jinqiang, Zheng Wenke

Institute of Traditional Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China

Received:2025-07-01 Accepted:2025-09-24 Online:2026-06-28 Published:2025-12-06
Contact: Zhu Jinqiang, PhD, Associate researcher, Institute of Traditional Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China Co-corresponding author: Zheng Wenke, PhD, Researcher, Institute of Traditional Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China
About author:Li Feifan, MS candidate, Institute of Traditional Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China
Supported by:
Tianjin Municipal Health Commission Research Project on Traditional Chinese Medicine and Integrated Traditional and Western Medicine, No. 2023079 (to ZJQ); Heilongjiang Province “Best Candidate” Scientific Research Project, No. 2023ZXJ02C01 (to ZWK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
对氯苯丙氨酸(p-chlorophenylalanine，PCPA)：是一种选择性、不可逆的5-羟色胺合成抑制剂，通过抑制色氨酸羟化酶阻断5-羟色胺的生成，从而降低中枢神经系统内5-羟色胺水平。
水环境睡眠剥夺法：是一种通过物理手段干扰实验动物睡眠的建模方法，利用水平台技术迫使动物处于持续觉醒状态，从而模拟人类失眠症状。

背景：稳定的动物失眠模型是研究失眠机制和抗失眠药物研发的重要工具。化学法结合物理方法构建失眠模型为动物失眠模型提供了良好的造模方法。
目的：比较化学方法(对氯苯丙氨酸法)、物理方法(水环境睡眠剥夺法)和化学联合物理方法(对氯苯丙氨酸联合水环境睡眠剥夺法)构建小鼠失眠模型，探索最佳的造模方法。
方法：将C57小鼠分别按照雄、雌性别随机分成空白组(不做处理)、对氯苯丙氨酸组、水平台组、对氯苯丙氨酸+水平台组，每组12只(雌、雄各半)。对氯苯丙氨酸组小鼠每天腹腔注射400 mg/kg对氯苯丙氨酸混悬液，连续3 d；水平台组小鼠连续3 d放入水环境睡眠剥夺平台中；对氯苯丙氨酸+水平台组小鼠放入睡眠剥夺平台中，且连续3 d腹腔注射400 mg/kg 对氯苯丙氨酸混悬液。造模3 d后，对小鼠进行旷场实验、尼氏染色观察下丘脑及海马区神经元数量，酶联免疫吸附法检测血清中5-羟色胺、γ-氨基丁酸、多巴胺水平。
结果与结论：①与空白组小鼠比较，3种模型组雄性小鼠的总路程、中心进入次数、平均速度和站立次数均呈上升趋势，其中对氯苯丙氨酸+水平台组变化最为明显(P < 0.05或P < 0.01)；3种模型组雌性小鼠总路程、中心进入次数、平均速度和站立次数均呈上升趋势；②3种造模方法都可以减少小鼠下丘脑、海马区神经元数量，其中对氯苯丙氨酸+水平台组雌性小鼠神经元数量减少最为明显，神经元损伤最为严重；③与空白组相应性别小鼠比较，对氯苯丙氨酸+水平台组雌性小鼠血清3项指标变化更显著，5-羟色胺、γ-氨基丁酸显著降低(P < 0.05)，多巴胺水平显著升高(P < 0.01)。结果说明：对氯苯丙氨酸联合水平台环境法建立的失眠模型对雌性小鼠相对更可靠、稳定，能为失眠研究提供较为理想的动物模型。
https://orcid.org/0009-0004-9552-3310(李非凡)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 失眠, 动物模型, 对氯苯丙氨酸, 水环境睡眠剥夺, 多巴胺, 小鼠

Abstract: BACKGROUND: Stable animal insomnia models serve as crucial tools for investigating insomnia mechanisms and developing anti-insomnia drugs. The combination of chemical and physical methods provides an effective approach for establishing animal insomnia models.
OBJECTIVE: To compare chemical methods (p-chlorophenylalanine), physical methods (water environment sleep deprivation method), and combined methods (p-chlorophenylalanine combined with water environment sleep deprivation method) for constructing insomnia mouse models, thereby exploring the optimal modeling method.
METHODS: C57 mice were randomly divided by sex into the following groups: control (untreated), p-chlorophenylalanine, water platform, and p-chlorophenylalanine+water platform, with 12 mice per group (equal numbers of males and females). Mice in the p-chlorophenylalanine group received intraperitoneal injections of 400 mg/kg p-chlorophenylalanine suspension daily for 3 consecutive days; those in the water platform group were placed in a water environment sleep deprivation platform for 3 consecutive days; and those in the p-chlorophenylalanine+water platform group were placed in the sleep deprivation platform and received intraperitoneal injections of 400 mg/kg p-chlorophenylalanine suspension for 3 consecutive days. After 3 days of modeling, mice were subjected to the open field test, and the number of neurons in the hypothalamus and hippocampus was examined via Nissl staining. Serum levels of 5-hydroxytryptamine, gamma-aminobutyric acid, and dopamine were measured using enzyme-linked immunosorbent assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, male mice in the three model groups exhibited an upward trend in total distance, number of entries into the central area, average speed, and number of stand-up episodes. The most pronounced changes were observed in the p-chlorophenylalanine+water platform group (P < 0.05 or P < 0.01). Female mice in the three model groups also showed an upward trend in total distance, number of entries into the central area, average speed, and number of stand-up episodes. (2) All three modeling methods could reduce the number of neurons in the mouse hypothalamus and hippocampus, with the highest reduction and most severe neuronal damage observed in female mice in the p-chlorophenylalanine+water platform group. (3) Compared with female mice in the control group, changes in three serum indicators were more pronounced in the female mice in the p-chlorophenylalanine+water platform group. 5-Hydroxytryptamine and gamma-aminobutyric acid levels were significantly reduced
(P < 0.05), while dopamine levels were significantly elevated (P < 0.01). To conclude, the insomnia model established in female mice using p-chlorophenylalanine combined with the water platform is relatively more reliable and stable, providing an ideal animal model for insomnia research.

Key words: insomnia, animal model, p-chlorophenylalanine, water environment sleep deprivation, dopamine, mouse

中图分类号:

李非凡, 张怡博, 王静, 朱金墙, 郑文科. 三种失眠小鼠模型制备方法的比较与评价[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(18): 4685-4693.

Li Feifan, Zhang Yibo, Wang Jing, Zhu Jinqiang, Zheng Wenke. Comparison and evaluation of three methods for preparing insomnia mouse models[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(18): 4685-4693.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析参与实验的各组小鼠在实验过程中均无死亡，全部进入结果分析。
2.2 小鼠一般情况观察实验过程中，空白组雄、雌小鼠精神状态均良好，毛发鲜亮柔顺有光泽，活动灵敏，体质量无明显变化。PCPA组雄、雌小鼠活动均增加，昼夜节律紊乱；与空白组相同性别小鼠相比，PCPA组雄性小鼠体质量在造模第1天显著增加(P < 0.05)，雌性小鼠体质量在造模第1天显著降低(P < 0.01)。与空白组相同性别小鼠相比，水平台组雄性小鼠毛发略欠光泽，精神兴奋，易怒，体质量在造模第1天无显著性变化，造模第2，3天显著降低(P < 0.01)；水平台组雌性小鼠毛发略显粗糙，精神兴奋，易怒，体质量在造模第1天无显著性变化，造模第2，3天显著降低(P < 0.01)。与空白组相同性别小鼠相比，PCPA+水平台组雄性小鼠毛发粗糙，造模第1天表现出精神亢奋，易受惊；造模第2，3天小鼠精神不振，食欲减退，体质量显著降低(P < 0.01)；PCPA+水平台组雌性小鼠毛发粗糙，随着剥夺天数增加，小鼠逐渐从亢奋状态转为萎靡状态，活动减少，低头站立且四肢蜷缩，常因短暂睡眠而落入水中，惊醒后爬上平台；造模第2，3天体质量显著降低(P < 0.01)，见图1。
2.3 小鼠旷场实验结果采用SuperMaze动物行为分析软件，分析并生成雄、雌小鼠旷场实验运动轨迹，见图2。与空白组雄性小鼠相比，PCPA组雄性小鼠的运动总路程、中心进入次数、平均速度和站立次数的变化趋势有所增加但无显著差异；水平台组和PCPA+水平台组雄性小鼠的运动总路程、中心进入次数显著增加(P < 0.05)，平均速度和站立次数显著增加(P < 0.01)；与PCPA组雄性小鼠相比，水平台组和PCPA+水平台组雄性小鼠中心进入次数显著增加(P < 0.05)。与空白组雌性小鼠相比，3种模型各组雌性小鼠的总路程、中心进入次数、平均速度和站立次数的变化趋势有所增加，但差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1，2。
2.4 小鼠下丘脑尼氏染色结果尼氏染色结果见图3。空白组雄性小鼠下丘脑的神经细胞清晰、完整，

细胞核清晰可见，尼氏小体均匀分布，神经细胞数量正常。与空白组雄性小鼠相比，PCPA组雄性小鼠下丘脑的神经细胞轮廓、细胞核较为清晰，尼氏小体数量减少，排列松散；水平台组雄性小鼠下丘脑的神经细胞轮廓模糊，细胞间隙增大，尼氏小体分布不均匀；PCPA+水平台组雄性小鼠下丘脑的神经细胞轮廓较为模糊，细胞核皱缩，细胞明显水肿，尼氏小体固缩、核模糊，且分布不均匀，数量明显减少；空白组雌性小鼠下丘脑的神经细胞和细胞核清晰、完整，尼氏小体分布均匀，神经细胞数量正常。与空白组雌性小鼠下丘脑相比，PCPA组雌性小鼠下丘脑细胞皱缩，出现水肿，尼氏小体分布不均匀，数量减少；水平台组雌性小鼠下丘脑的神经细胞轮廓模糊，细胞间隙增大，细胞密度降低，尼氏小体数量减少且分布不均；PCPA+水平台组雌性小鼠下丘脑神经细胞轮廓模糊，细胞间隙增大，尼氏小体固缩、核模糊且分布不均匀，数量明显减少。
2.5 小鼠海马尼氏染色结果见图3。空白组雄性小鼠海马区神经元细胞结构完整、排列紧密，尼氏小体分布均匀、染色清晰。与空白组雄性小鼠相比，PCPA组雄性小鼠的海马区神经元细胞排列略显紊乱，部分神经细胞出现固缩；水平台组雄性小鼠的神经元细胞排列稀疏，出现神经元丢失、细胞间隙增宽的现象，尼氏小体数量降低，部分细胞呈不规则形状；PCPA+水平台组雄性小鼠神经元细胞排列紊乱，神经元细胞数量显著减少，出现神经元丢失、细胞间隙增宽、细胞固缩、细胞轮廓不清的现象。空白组雌性小鼠海马区神经元结构完整、排列紧密，神经元数量正常，神经元细胞大且圆，无皱缩，尼氏小体分布均匀、染色清晰。与空白组雌性小鼠海马区相比，PCPA组雌性小鼠的神经元细胞排列稀疏，出现尼氏小体丢失、细胞间隙增宽的现象；水平台组雌性小鼠的神经元细胞排列稀疏，细胞间隙增宽，部分神经元细胞皱缩、轮廓不清；PCPA+水平台组雌性小鼠的神经元细胞排列紊乱，神经元细胞数量显著减少，出现神经元丢失、细胞间隙增宽、细胞固缩、细胞轮廓不清和尼氏小体着色变浅的现象。
2.6 小鼠血清中5-羟色胺、γ-氨基丁酸、多巴胺水平与空白组雄性小鼠相比，PCPA组雄性小鼠血清中5-羟色胺、γ-氨基丁酸水平显著降低(P < 0.05，P < 0.01)，多巴胺水平升高但无显著性；水平台组雄性小鼠血清中多巴胺水平显著降低(P < 0.01)，5-羟色胺和γ-氨基丁酸水平降低但无显著性；PCPA+水平台组雄性小鼠血清中5-羟色胺、γ-氨基丁酸水平显著降低(P < 0.05，P < 0.01)，多巴胺水平升高但无显著性。与PCPA组雄性小鼠比较，水平台组雄性小鼠多巴胺水平显著升高(P < 0.05)。与水平台组雄性小鼠比较，PCPA+水平台组雄性小鼠5-羟色胺、γ-氨基丁酸水平显著降低(P < 0.05)。与空白组雌性小鼠相比，PCPA组雌性小鼠血清中5-羟色胺水平显著降低(P < 0.05)，多巴胺水平显著升高(P < 0.01)，γ-氨基丁酸水平有降低趋势但无显著性；水平台组雌性小鼠血清中5-羟色胺、γ-氨基丁酸水平显著降低(P < 0.05)，多巴胺水平显著升高(P < 0.01)；PCPA+水平台组雌性小鼠血清中5-羟色胺、γ-氨基丁酸水平显著降低(P < 0.01，P < 0.05)，多巴胺水平显著升高(P < 0.01)。与PCPA组雌性小鼠比较，水平台组雌性小鼠、PCPA+水平台组雌性小鼠多巴胺水平显著升高(P < 0.05，P < 0.01)，见表3，4。

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引言

失眠是指无法入睡或无法保持睡眠状态，导致睡眠不足，又称入睡和维持睡眠障碍，临床表现主要包括入睡困难、睡眠质量下降、睡眠时间减少、记忆力和注意力下降等[1-4]。随着生活节奏加快，人们工作、生活压力不断增大，加上随之而来的作息不规律、饮食快餐化等因素，导致失眠发病率日益增加，且呈年轻化趋势[5-6]。此外，失眠还是心脑血管疾病、阿尔茨海默病等多种疾病的关键诱发或加重因素[7-8]，严重危害人类健康。因此，探寻安全有效防治失眠的措施成为亟待解决的问题之一。为进一步研究失眠的病理机制及抗失眠药物研发，寻找理想的失眠动物模型极为重要。
失眠模型的制备方法主要分为化学法和物理法，此次研究课题组主要比较化学方法[对氯苯丙氨酸(p-chlorophenylalanine，PCPA)法]、物理方法(水环境睡眠剥夺法)和化学联合物理方法(PCPA联合水环境睡眠剥夺法)3种造模方法的优劣。PCPA模型通过5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)拮抗快速诱导失眠，操作简便但无法模拟快速眼球运动(rapid eye movement，REM)异常且易引发非特异性行为[9]；水平台模型特异性剥夺快速眼球运动睡眠但伴随显著下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)轴激活，可能导致应激反应[10-14]；联合模型整合二者优势，PCPA联合水平台睡眠剥夺的复合失眠模型在研究方法上展现出独特的创新价值，主要体现在多角度模拟临床失眠的复杂性，复刻神经递质紊乱与环境应激的共同致病机制；构建更全面的病理表型，可同时评估非快速眼球运动(non-rapid eye movement，NREM)/快速眼球运动睡眠失调、下丘脑-垂体-肾上腺轴激活及焦虑样行为等疾病[15-17]，但多重应激可能增加动物死亡率。因此，此项研究对3种模型进行构建与评价，为后期实验研究提供参考。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 3种方法构建小鼠失眠模型的比较。
1.2 时间及地点实验于2024年5-6月在天津中医药大学地点完成。
1.3 材料
1.3.1 实验药物 PCPA混悬液的配置：称取适量对PCPA粉末，加入0.9%氯化钠溶液配置成浓度为400 mg/kg的PCPA混悬液。同时将碳酸氢钠加入混悬液中，调试pH=7.0-8.0，搅拌均匀。根据PCPA溶解盐水程度，加入适量的吐温80进行助溶，最后超声2 h。
1.3.2 实验动物 SPF级8周龄雄、雌C57BL/6J小鼠各24只，体质量(20±2) g。动物均由维通利华公司提供，生产许可证号为：SCXK(京)2021-0006，饲养于天津中医药大学动物实验中心。每组分笼饲养，食水自由。该动物实验已取得天津中医药大学伦理委员会批准(批号：TCM-LAEC2024113f1128)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.3 试剂无水乙醇(货号：100092683)、二甲苯(货号：10023418)、冰醋酸(货号：10000218)、中性树胶(货号：10004160)购买于国药集团化学试剂有限公司；环保型脱蜡液(货号：G1128)、通用型组织固定液(货号：G1101)、尼氏染液(货号：G1036)购买于Servicebio；PCPA、三溴乙醇购买于美国Sigma公司(货号：C6506-25G、T48402)；小鼠5-羟色胺、多巴胺、γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)Elisa试剂盒购买于江苏晶美生物科技有限公司(批号：202409)；0.9%氯化钠注射液(批号：C23072404)购买于江西科伦药业；吐温80(批号20180119)购买于天津市美琳工贸有限公司。
1.3.4 仪器自制水环境睡眠剥夺系统；XR-XZ301旷场试验装置(上海欣软信息科技有限公司)；SuperMaze动物行为分析软件；Donatello脱水机(DIAPATH)；JB-P5包埋机(武汉俊杰电子有限公司)；RM2016病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)；JB-L5冻台(武汉俊杰电子有限公司)；KD-P组织摊片机；GFL-230烤箱(天津市莱玻瑞仪器设备有限公司)；CRYOSTAR冰冻切片机(赛默飞世尔科技有限公司)；黏附载玻片(Servicebio)；10212432C盖玻片(江苏世泰实验器材有限公司)；Nikon Eclipse E100正置光学显微镜(日本尼康)；Nikon DS-U3成像系统(日本尼康)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验动物分组 SPF级雄、雌C57BL/6J小鼠各24只，适应性喂养3 d，根据随机数字表法将同一性别的小鼠随机分为空白组、PCPA组、水平台组、PCPA+水平台组，每组雄、雌各6只。
1.4.2 模型制备
(1)多平台水环境睡眠剥夺系统：睡眠剥夺箱大小为79 cm×38 cm×26.5 cm，内设21个直径为3 cm、高6 cm的圆柱形平台，平台间隔约7.25 cm，箱中注入低于圆柱形平台约1.0 cm的水，平台上方5 cm处布置铁丝网，将水和食物置于铁丝网上，小鼠可在平台上自行摄食、饮水，且可在平台间自由活动。当小鼠睡眠时，全身肌肉放松，会出现低头触水、失足落水而惊醒，从而导致小鼠无法入睡，产生睡眠障碍[18]。
(2)造模预备阶段：适应性喂养3 d期间，水平台组、PCPA+水平台组的雄、雌小鼠连续3 d进入多平台水环境睡眠剥夺箱中训练，确保每只小鼠掉入水中可独立、主动游到圆柱形平台上站稳，降低实验小鼠死亡率。
(3)各组小鼠处理：①空白组小鼠食水自由，不予处理；②PCPA组小鼠每日8：00-9：30按照400 mg/kg的剂量腹腔注射PCPA混悬液，连续3 d；PCPA目前已被广泛用于建立失眠动物模型，研究中PCPA的使用剂量参考文献[19-20]报道的剂量给予；③水平台组小鼠放入多平台水环境睡眠剥夺系统中连续3 d，上午8：00-8：30、下午20：00-20：30观察其活动状态，防止溺水死亡；每日上午8：00、下午20：00对多平台水环境睡眠剥夺系统进行换水处理，确保睡眠剥夺箱的环境处于清洁状态，为小鼠提供良好造模环境；④PCPA+水平台组小鼠每日8：00-9：30按照400 mg/kg剂量腹腔注射PCPA混悬液连续3 d，腹腔注射后将小鼠放入多平台水环境睡眠剥夺系统中连续3 d，上午8：00-8：30、下午20：00-20：30观察小鼠活动状态，防止溺水死亡；每日上午8：00、下午20：00对多平台水环境睡眠剥夺系统进行换水处理，确保睡眠剥夺箱处于清洁状态，为小鼠提供良好造模环境。
1.4.3 一般情况观察从造模开始，观察各组小鼠状态、活动程度，记录小鼠体质量。
1.4.4 旷场实验造模完成后进行旷场实验。将小鼠放入50 cm×50 cm×50 cm的旷场实验装置的中心区域进行测试5 min，SuperMaze动物行为分析软件记录小鼠总路程、平均速度、中心进入次数和站立次数。房间需保持安静、昏暗，确保小鼠处于自然状态下进行测试。每只小鼠实验结束后，清理小鼠粪便及尿液，旷场箱体喷洒乙醇除去异味，以消除小鼠视觉及嗅觉残留。

1.4.5 取材与处理旷场实验结束后，小鼠禁食12 h，用7.5 %三溴乙醇麻醉后，对各组小鼠进行眼球取血，4 ℃环境下静置4 h，4 ℃离心机3 500 r/min离心15 min吸取上清液，将其放置于-80 ℃冰箱中保存备用。眼球取血后迅速脱颈处死小鼠，用生理盐水心脏灌注冲净组织中血液，迅速取出小鼠全脑，放入40 g/L多聚甲醛固定液中。

1.4.6 脑组织尼氏染色将小鼠脑组织放于40 g/L多聚甲醛固定液中，石蜡包埋、切片、脱蜡，脑组织切片放入染液2-5 min水洗。0.1%冰醋酸分化，水洗终止反应，将切片烘干，中性树胶封固后，在光学显微镜下对下丘脑、海马组织进行观察尼氏体数量并采集图像。
1.4.7 Elisa检测血清5-羟色胺、γ-氨基丁酸、多巴胺水平取各组小鼠血清，严格按照ELISA试剂盒说明书测定血清中5-羟色胺、γ-氨基丁酸和多巴胺水平。
1.5 主要观察指标小鼠一般情况观察，旷场实验结果，下丘脑、海马区神经元数量，血清中5-羟色胺、γ-氨基丁酸、多巴胺水平。
1.6 统计学分析用GraphPad Prism 8.0软件进行数据统计与分析，数据采用 x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，若P < 0.05，P < 0.01表示两组差异有显著性意义。文章统计学方法已经由天津中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

目前对于失眠的具体发病机制尚不清楚，因此建立合适、稳定的动物模型对于疾病的基础研究至关重要。制备失眠模型的动物选择较多，其中恒河猴被认为是非人类灵长类动物中最接近人类认知行为的测试动物[21]。由于恒河猴等大型哺乳动物科研经济成本高，操作方便程度低于小型哺乳动物，一般选用大、小鼠作为失眠的模型动物[19，22]。研究表明，雌性的睡眠时间比雄性的睡眠时间短、入睡效率低[23-24]，提示动物的睡眠质量与性别有关。在失眠的基础研究中，存在多种失眠模型的制备方法，主要分为化学法和物理法。化学法指PCPA[25]、咖啡因[26]、甲状腺素等化学药物诱导的失眠动物模型[27]；物理法指水平台法[28]、电刺激法[29]、换笼法[30]、湿笼法等物理方法诱导的失眠动物模型[31]，其中最常见的造模方法是腹腔注射PCPA混悬液[32]。此次实验选择雄、雌小鼠作为实验研究对象，比较3种失眠动物模型的优劣。
旷场实验是评价实验动物在环境中自主探究与紧张度的一种方法，通过记录小鼠总路程、中心进入次数、平均速度和站立次数，评价造模后小鼠的失眠情况。小鼠总路程、平均速度、中心进入次数和站立次数的增加，反映整体运动活性增强，提示中枢兴奋性增高[33]。此次研究结果显示，造模后雄性小鼠的总路程、中心进入次数、平均速度和站立次数均呈上升趋势，其中PCPA+水平台组变化最为明显；雌性小鼠总路程、中心进入次数、平均速度和站立次数均呈上升趋势，但无显著性差异。提示3种造模方法都可以使小鼠进入兴奋、激动的状态，且雄性小鼠的兴奋程度高于雌性小鼠。推测其原因是造模3 d后，雄性小鼠因失眠进入亢奋状态，导致旷场实验的总路程、中心进入次数、平均速度和站立次数呈上升趋势；但雌性小鼠因失眠从亢奋状态逐渐向抑郁状态转变，相关指标虽有上升趋势，但无显著性。
下丘脑是人类神经内分泌系统一个重要的组成部分，位于大脑底部，其包含的视交叉上核可调控人体昼夜节律。下丘脑组成的下丘脑-垂体-肾上腺轴对于调控人体睡眠-觉醒状态也发挥重要作用[34-35]。大脑海马区与动物学习、记忆等认知相关活动密切相关。研究表明，失眠会影响海马区正常功能，导致记忆力降低、注意力分散等症状[36-37]。此次研究通过尼氏染色观察下丘脑及海马区神经元的数量、形状[38]，探究失眠对小鼠神经元的受损情况，对失眠模型进一步评价，结果显示，3种造模方法都可以减少小鼠下丘脑、海马区神经元数量，其中PCPA+水平台组雌性小鼠神经元数量减少最为明显，神经元损伤最为严重。
5-羟色胺是一种单胺类神经递质，主要集中于脑干中缝核内。5-羟色胺可诱导睡眠，体内5-羟色胺水平降低，会导致失眠[39]。γ-氨基丁酸是一种抑制性神经递质，γ-氨基丁酸水平与睡眠密切相关，可平衡兴奋性神经递质的受体，如谷氨酸、去甲肾上腺素等[40-41]。多巴胺是一种脑内重要神经递质，过度分泌会使机体处于兴奋状态，导致睡眠障碍[42-43]。
3种神经递质系统在睡眠调节中发挥关键作用，此次研究通过Elisa检测小鼠血清中神经递质，结果显示，3种造模方法都能影响5-羟色胺、γ-氨基丁酸、多巴胺的水平，其中PCPA+水平台组雌性小鼠血清中5-羟色胺、γ-氨基丁酸和多巴胺水平较空白组相应指标变化更显著，多巴胺水平的显著升高(P < 0.01)，与失眠状态下的过度觉醒现象高度一致。
行为学分析显示，PCPA+水平台组雄性小鼠在旷场实验中表现出最显著的运动活性增强(总路程、中心进入次数、平均速度和站立次数均明显增加)，这一结果符合失眠状态下中枢神经系统兴奋性增高的特征；雌性小鼠虽无显著性差异，但呈现上升趋势，与神经递质检测结果相符合。尼氏染色结果发现，相比其余各组，PCPA+水平台组雌性小鼠在下丘脑和海马区表现出最显著的神经元数量减少和形态学损伤。综上所述，课题组发现PCPA联合水平台环境法的造模方法对于雌性小鼠相对可靠、稳定，能为失眠研究提供较为理想的动物模型。
3种失眠模型的构建方法分别为PCPA单药造模、水平台睡眠剥夺以及两者的联合造模，各自存在显著的优缺点和局限性，见表5。
PCPA单药造模通过化学干预，拮抗5-羟色胺，操作简便且机制明确，但难以反映快速眼球运动睡眠异常，同时5-羟色胺含量降低可能引发焦虑、过度活动等非特异性行为改变[20，44]。水平台睡眠剥夺能精准靶向快速眼球运动睡眠缺失，模拟应激导致的失眠，但水环境带来的物理应激会显著激活下丘脑-垂体-肾上腺轴，导致睡眠剥夺状态与应激反应难以区分，且长期实验可能引发动物严重生理紊乱[14，45]。PCPA联合水平台睡眠剥夺模型理论上能更全面地模拟临床失眠特征，同时破坏快速眼球运动睡眠，但实际操作中化学与物理应激的叠加，可能使动物耐受性下降，导致实验死亡率增加[17，46]。3种方法共同面临的挑战在于临床转化价值的局限性：PCPA模型与人类失眠的病理生理差异较大，水平台模型的强制剥夺方式不符合自然发生的失眠过程[13，47]，而PCPA联合水平台睡眠剥夺模型虽表型更丰富，但其极端干预条件反而可能偏离真实病理状态[48]。此外，这些模型在技术层面也各有限制，PCPA的剂量效应需要精确控制，且单一的干预方法难以全面再现临床失眠的复杂神经生物学特征；水平台的平台尺寸要求严苛，物理干预导致的应激反应与睡眠剥夺效应存在耦合，可能影响机制研究的特异性；PCPA联合水平台睡眠剥夺模型理论上能更全面地再现失眠的多维度特征，但可能导致全身性生理紊乱。这些局限性提示研究者需根据具体科学问题选择合适模型，同时积极探索更贴近人类失眠病理的新模型构建方法。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

三种失眠小鼠模型制备方法的比较与评价

Comparison and evaluation of three methods for preparing insomnia mouse models

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