衰老骨髓间充质干细胞通过半乳糖凝集素3促进多发性骨髓瘤细胞增殖

doi:10.12307/2026.395

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (19): 4836-4842.doi: 10.12307/2026.395

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衰老骨髓间充质干细胞通过半乳糖凝集素3促进多发性骨髓瘤细胞增殖

樊婷婷1，向苗苗1，袁小霜1，杨姁2，杨波2，田婷1，陈晓旭2，唐东昕2，王飞清2，刘洋2，李艳菊1，3

1贵州医科大学，贵州省贵阳市 550004；2贵州中医药大学第一附属医院，贵州省贵阳市 550001；3贵州医科大学附属医院血液科，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2025-06-11 接受日期:2025-10-22 出版日期:2026-07-08 发布日期:2026-02-13
通讯作者: 李艳菊，博士，主任医师，贵州医科大学，贵州省贵阳市 550004；贵州医科大学附属医院血液科，贵州省贵阳市 550004；共同通讯作者：刘洋，博士，教授，贵州中医药大学第一附属医院，贵州省贵阳市 550001
作者简介:樊婷婷，女，1980年生，贵州省兴义市人，汉族，在职硕士，主要从事干细胞组织工程研究。
基金资助:
学科优秀后备人才项目(gyfyxkrc-2023-14)，项目负责人：李艳菊；贵州省基础研究计划(自然科学类)重点项目(黔科合基础-ZK[2023]重点042)，项目负责人：李艳菊；贵州中医药大学人才团队项目(GZYTD [2024] 003)，项目负责人：刘洋

Senescent bone marrow mesenchymal stem cells promote multiple myeloma cell proliferation through galectins-3

Fan Tingting1, Xiang Miaomiao1, Yuan Xiaoshuang1, Yang Xu2, Yang Bo2, Tian Ting1, Chen Xiaoxu2, Tang Dongxin2, Wang Feiqing2, Liu Yang2, Li Yanju1, 3

1Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2The First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550001, Guizhou Province, China; 3Department of Hematology, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2025-06-11 Accepted:2025-10-22 Online:2026-07-08 Published:2026-02-13
Contact: Li Yanju, PhD, Chief physician, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Department of Hematology, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Liu Yang, MD, Professor, The First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550001, Guizhou Province, China
About author:Fan Tingting, MS, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
The Subject Excellent Reserve Talent Project, No. gyfyxkrc-2023-14 (to LYJ); the Key Project of Guizhou Province Basic Research Program (Natural Science), No. [2023] 042 (to LYJ); Talent Team Program of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, No. GZYTD [2024] 003 (to LY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

衰老骨髓间充质干细胞：具有分化为成骨细胞和成脂肪细胞的潜能，且有衰老分泌相关表型的特征。
衰老骨髓间充质干细胞条件培养液：衰老骨髓间充质干细胞会释放很多具有生物活性的细胞因子。收集衰老骨髓间充质干细胞培养基上清液，通过离心和过滤，得到具有活性成分的培养液，称为衰老骨髓间充质干细胞条件培养液。

摘要

背景：研究发现，多发性骨髓瘤微环境具有诱导间充质干细胞成衰老表型的功能，而衰老骨髓间充质干细胞对多发性骨髓瘤细胞影响的研究鲜有报道。
目的：探讨衰老骨髓间充质干细胞通过旁分泌半乳糖凝集素3对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响。
方法：取健康供者骨髓血，通过Ficoll密度梯度离心法和贴壁纯化法提取骨髓间充质干细胞。取第3代骨髓间充质干细胞，采用200 μmol/L过氧化氢溶液诱导2 h，再用L-DMEM完全培养基培养24 h，构建衰老骨髓间充质干细胞模型，通过β-半乳糖苷酶染色及衰老基因P21表达进行鉴定，RT-qPCR检测衰老骨髓间充质干细胞中半乳糖凝集素3的表达。收集衰老骨髓间充质干细胞上清液并通过离心浓缩制备衰老骨髓间充质干细胞条件培养基，用其培养多发性骨髓瘤细胞株U266 24 h，CCK-8检测U266细胞增殖情况，流式细胞仪检测U266细胞凋亡情况，RT-qPCR及Western blot检测U266细胞中BCL-2蛋白及mRNA表达。收集多发性骨髓瘤患者和健康人的骨髓，通过ELISA方法检测半乳糖凝集素3水平。

结果与结论：①过氧化氢诱导后，β-半乳糖苷酶染色阳性细胞明显增多，P21和半乳糖凝集素3 mRNA表达上调(P < 0.01)；②与对照组相比，衰老骨髓间充质干细胞条件培养基培养U266细胞24 h后，细胞增殖水平升高(P < 0.05)，凋亡率降低(P < 0.05)，BCL-2蛋白及mRNA表达水平增加(P < 0.05)；③多发性骨髓瘤患者骨髓半乳糖凝集素3水平较健康人明显增加(P < 0.05)。结果表明：衰老骨髓间充质干细胞可能通过旁分泌半乳糖凝集素3，上调BCL-2表达水平，促进多发性骨髓瘤细胞的增殖。

https://orcid.org/0009-0009-1804-2288 (樊婷婷)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 衰老, 骨髓间充质干细胞, 多发性骨髓瘤, 半乳糖凝集素3, 旁分泌, 骨髓微环境, 凋亡, 增殖

Abstract: BACKGROUND: Studies showed that multiple myeloma microenvironment has the function of inducing mesenchymal stem cells to become senescent phenotype, while the effect of senescent bone marrow mesenchymal stem cells on multiple myeloma cells is rarely reported.
OBJECTIVE: To investigate the effect of senescent bone marrow mesenchymal stem cells on the proliferation of multiple myeloma cells through paracrine galectin-3.
METHODS: Bone marrow blood was collected from healthy donors, and bone marrow mesenchymal stem cells were extracted by Ficoll density gradient centrifugation and adherent purification. The third-generation bone marrow mesenchymal stem cells were taken and induced with 200 µmol/L hydrogen peroxide solution for 2 hours. After the treatment was completed, they were replaced with L-DMEM complete medium for 24 hours of culture to construct the senescent bone marrow mesenchymal stem cell model. β-Galactosylase staining and senescence gene P21 were used for identification. Meanwhile, the expression of galectin-3 in aging bone marrow mesenchymal stem cells was detected by RT-qPCR. The supernatant of senescent bone marrow mesenchymal stem cells was collected and the conditioned medium of senescent bone marrow mesenchymal stem cells was prepared by centrifugal concentration. After culturing the multiple myeloma cell line U266 for 24 hours with it, the proliferation of U266 cells was detected by CCK-8 assay. The apoptosis of U266 cells was detected by flow cytometry. The expression levels of BCL-2 protein and mRNA in U266 cells were detected by RT-qPCR and western blot assay. Bone marrow blood was collected from patients with multiple myeloma and healthy individuals. The level of galectin-3 was detected by ELISA.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After hydrogen peroxide induction, the number of cells positive for β-galactosidase staining increased significantly, and P21 and galectin-3 mRNA expression levels were upregulated (P < 0.01). (2) Compared with the control group, 24 hours of culture of U266 cells with conditioned medium from senescent bone marrow mesenchymal stem cells increased the level of cell proliferation (P < 0.05), decreased the apoptosis rate (P < 0.05), and rose the expression levels of BCL-2 protein and mRNA (P < 0.05). (3) Galectin-3 levels in the bone marrow of patients with multiple myeloma were significantly higher than those in healthy controls (P < 0.05). These results suggest that senescent bone marrow mesenchymal stem cells may promote the proliferation of multiple myeloma cells by paracrine galectin-3, which in turn upregulates BCL-2 expression.

Key words: senescent, bone marrow mesenchymal stem cell, multiple myeloma, galectin-3, paracrine, bone marrow microenvironment, apoptosis, proliferation

中图分类号:

樊婷婷, 向苗苗, 袁小霜, 杨姁, 杨波, 田婷, 陈晓旭, 唐东昕, 王飞清, 刘洋, 李艳菊. 衰老骨髓间充质干细胞通过半乳糖凝集素3促进多发性骨髓瘤细胞增殖[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(19): 4836-4842.

Fan Tingting, Xiang Miaomiao, Yuan Xiaoshuang, Yang Xu, Yang Bo, Tian Ting, Chen Xiaoxu, Tang Dongxin, Wang Feiqing, Liu Yang, Li Yanju. Senescent bone marrow mesenchymal stem cells promote multiple myeloma cell proliferation through galectins-3[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(19): 4836-4842.

图/表（结果） 5

2.1 骨髓间充质干细胞培养及鉴定结果 第3代骨髓间充质干细胞传代第5天，倒置荧光显微镜观察细胞呈长梭形、形态大小均一，漩涡样生长，结晶紫染色可见清晰核质结构，见图1；骨髓间充质干细胞流式鉴定如图2所示，CD90表达97.8%、CD73表达97.1%、CD105表达99.6%，低表达CD14、CD34、CD45、CD11b及HLA-DR。

2.2 骨髓间充质干细胞成骨、成脂鉴定结果 成骨诱导21 d，茜素红S染色后可见有钙结节出现，见图3A。成脂诱导14 d，油红O染色后可见脂滴明显增大增多，见图3B。
2.3 衰老骨髓间充质干细胞模型构建后β-半乳糖苷酶染色结果 β-半乳糖苷酶染色显示，细胞体积明显变大，扁平样，胞质面积增加，见图4。
2.4 RT-qPCR检测衰老骨髓间充质干细胞中P21、半乳糖凝集素3 mRNA表达水平 与对照组相比，衰老骨髓间充质干细胞中P21、半乳糖凝集素3 mRNA表达明显增加(P < 0.01)，见图5。
2.5 CCK-8检测衰老骨髓间充质干细胞条件培养基对U266细胞增殖的影响 衰老骨髓间充质干细胞条件培养基培养16，24 h后，实验组吸光度值较对照组显著升高(P < 0.05，图6)，提示衰老骨髓间充质干细胞条件培养基可刺激U266细胞增殖。

2.6 流式细胞仪检测衰老骨髓间充质干细胞条件培养基对U266细胞凋亡的影响 用衰老骨髓间充质干细胞培养基培养U266细胞24 h后，流式检测总凋亡率(Q2和Q3的百分比之和)，结果显示与对照组相比，实验组U266细胞凋亡率降低(P < 0.05)，见图7。

2.7 衰老骨髓间充质干细胞条件培养基对U266细胞BCL-2 mRNA及蛋白表达的影响 与对照组相比，实验组U266细胞中BCL-2 mRNA及蛋白表达显著上调(P < 0.01)，见图8。

2.8 ELISA试剂盒检测多发性骨髓瘤患者和健康人骨髓中半乳糖凝集素3水平 与健康人对比，多发性骨髓瘤患者半乳糖凝集素3水平明显升高(P < 0.05)，见图9。

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引言

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种克隆性浆细胞异常增生的恶性血液病，临床主要表现为单克隆免疫球蛋白或其片段(M蛋白)的过度分泌。该疾病在血液系统肿瘤中发病率仅次于淋巴瘤，位居恶性血液病第二位。流行病学显示，欧洲发病率为4.5/10万-6.0/10万，中国骨髓瘤发病率约为1/10万[1-3]。目前，多发性骨髓瘤的治疗方法主要包括自体干细胞移植、免疫调节药物、蛋白酶体抑制剂和单克隆抗体疗法等，这些疗法明显提高了多发性骨髓瘤患者的生存率，延长了生存时间[4]，但患者仍易出现复发和耐药，5年生存率小于40%[5]，导致多发性骨髓瘤仍然无法治愈，其治疗仍面临重大挑战[6]。研究发现，多发性骨髓瘤的高度异质性是导致临床治疗困难的主要原因，主要表现在克隆浆细胞固有的遗传异质性和多发性骨髓瘤细胞及骨髓微环境之间的相互作用两个方面[7]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓微环境中的异质细胞群，与多发性骨髓瘤细胞的生长、骨质破坏等关系密切[8]。
与其他肿瘤一样，骨髓间充质干细胞支持多发性骨髓瘤细胞生长，它们之间存在复杂的相互关系。相关研究证实，多发性骨髓瘤患者的骨髓间充质干细胞具有β-半乳糖苷酶表达增加、细胞增大和衰老相关分泌谱成员表达升高的衰老特征[9-10]。衰老细胞分泌多种生物活性蛋白，并表现出“衰老相关分泌表型”(senescence-associated secretory phenotype，SASP)[11]，其可能会诱导组织微环境发生变化，从而促进肿瘤发生。目前的研究表明，在绝大多数血液系统恶性肿瘤中，骨髓微环境会驱动肿瘤细胞进展，同时也调控骨髓微环境，靶向骨髓间充质干细胞并改变它的生物学特性[8，12]。最近的研究表明，具备衰老特征的骨髓间充质干细胞很可能通过改变肿瘤微环境参与疾病进展和复发[13]。多发性骨髓瘤来源骨髓间充质干细胞具有早期衰老特征，这种衰老特征可能通过调控多发性骨髓瘤微环境，参与多发性骨髓瘤的进展和复发过程。
半乳糖凝集素3(Galectin-3，Gal-3)是一种多功能致癌蛋白，可调节细胞增殖、生长、黏附、血管生成和细胞凋亡。研究表明，半乳糖凝集素3具有抗凋亡作用，有助于多种类型癌细胞的存活[14]，并且半乳糖凝集素3在许多癌症中表达升高，包括实体瘤和血液肿瘤，半乳糖凝集素3似乎是肿瘤微环境支持细胞(包括骨髓间充质干细胞)产生的关键分子[15-16]。课题组既往研究发现，在间充质干细胞衰老相关分泌表型因子中，半乳糖凝集素3是促癌活性的重要递质，衰老间充质干细胞中半乳糖凝集素3水平升高，显著促进结直肠癌细胞增殖[17]，而在多发性骨髓瘤中未见报道。
既往研究揭示了年轻骨髓间充质干细胞通过白细胞介素6促进多发性骨髓瘤生长，而衰老骨髓间充质干细胞的作用尚不清楚。该实验假设衰老骨髓间充质干细胞可以通过旁分泌半乳糖凝集素3促进U266细胞中BCL-2的表达，旨在探讨衰老骨髓间充质干细胞与多发性骨髓瘤细胞之间的联系。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞水平实验。
1.2 时间及地点 实验于2023年10月至2024年10月在贵州医科大学分子生物学重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 骨髓样本 骨髓样本来自贵州医科大学附属医院血液科，包括3例健康供者(男2例，女1例)和4例多发性骨髓瘤患者(男3例，女1例)，所有样本采集均遵循伦理规范，在获取受试者知情同意后完成。
课题经贵州医科大学附属医院伦理委员会审批通过，审批文件编号为2023-507。
1.3.2 实验细胞 多发性骨髓瘤细胞系U266由贵州医科大学附属医院血液科实验室提供。
1.3.3 实验试剂与仪器 RPMI 1640培养基、L-DMEM培养基、H-DMEM培养基、胎牛血清(Gibco，美国)；人外周血淋巴细胞分离液、CCK-8试剂盒、β-半乳糖苷酶染色试剂盒(索莱宝，中国)；凋亡试剂盒(凯基，中国)；0.22 μm过滤器(Millipore，美国)；TriQuick Reagent总RNA提取试剂、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶配制试剂盒、油红O染色试剂盒、茜素红S染色液(碧云天，中国)；引物序列(生工，中国)；HLA-DR-FITC、CD105-PE、CD34-FITC、CD45-PE、CD11b-PE、CD90-FITC、同型对照流式抗体、流式细胞仪(BD，美国)；羊抗兔IgG二抗、羊抗鼠IgG二抗、GAPDH、BCL-2抗体(博士德，中国)；酶标仪(Bio-Tek，美国)；实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)；倒置荧光显微镜(Olympus，日本)。
1.4 实验方法
1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离及培养[18] 取健康供者的骨髓血，提取单个核细胞，随后采用贴壁法纯化骨髓间充质干细胞。将细胞置于恒温培养箱(37 ℃、体积分数5%CO₂)中培养，待融合度达到80%-90%时，按标准传代流程进行消化和接种。后续实验选用第3-5代骨髓间充质干细胞，以确保细胞状态的一致性。
1.4.2 结晶紫染色观察骨髓间充质干细胞形态 取第3代骨髓间充质干细胞，以每孔2×104个细胞密度接种于6孔板，用L-DMEM完全培养基培养，待细胞生长融合至80%，PBS清洗2次，40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS清洗2次，结晶紫染色30 min，PBS清洗2次，晾干后镜检并拍照。
1.4.3 流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志物 取第3代骨髓间充质干细胞，待生长融合至培养皿的80%-90%后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，离心弃上清，加PBS并轻轻吹打数次制成单细胞悬液，重复2次，调整检测样本的细胞浓度为1×109 L-1，分别加入以FITC标记的IgG、CD90、CD14、CD34及HLA-DR，PE标记的IgG、CD105、CD73、CD45及CD11b各5 μL，4 ℃避光孵育30 min后，充分混匀，上流式细胞仪检测细胞表面抗原表达，用FlowJo软件对检测结果进行分析。
1.4.4 骨髓间充质干细胞成脂分化及染色 取第3代骨髓间充质干细胞以每孔2×104个细胞密度接种于6孔板，用L-DMEM完全培养基培养，待细胞生长融合至80%，将完全培养基更换为成脂诱导培养基(罗格列酮1 µmol/L、地塞米松250 nmol/L、胰岛素5 mg/L、异丁基甲基黄嘌呤500 µmol/L、H-DMEM培养基)进行成脂诱导分化，诱导14 d可见脂滴形成并进行油红O染色，倒置荧光显微镜观察染色情况并拍照[19]。
1.4.5 骨髓间充质干细胞成骨分化及染色 取第3代骨髓间充质干细胞以每孔2×104个细胞密度接种于6孔板，用L-DMEM完全培养基培养，待细胞生长融合至80%，将完全培养基更换为成骨诱导培养基(L-抗坏血酸0.2 mmol/L、地塞米松0.1 μmol/L、β-磷酸甘油钠10 mmol/L、H-DMEM培养基)进行成骨诱导分化，诱导21 d进行茜素红S染色，倒置荧光显微镜观察染色情况并拍照[19]。
1.4.6 衰老骨髓间充质干细胞模型构建 第3代骨髓间充质干细胞在含200 μmol/L H2O2的L-DMEM培养基中培养2 h[20-21]，然后更换为含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基培养24 h，建立衰老骨髓间充质干细胞模型，对照组全程用L-DMEM完全培养基培养，对两组骨髓间充质干细胞进行β-半乳糖苷酶染色鉴定。
1.4.7 衰老骨髓间充质干细胞条件培养基的制备 衰老骨髓间充质干细胞在含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基中培养48 h获取衰老骨髓间充质干细胞上清培养液，在4 ℃下用截留分子质量为100 kD的超滤离心管，以3 000 r/min离心30 min，离心所得液体即为衰老骨髓间充质干细胞条件培养基，使用0.22 μm滤膜过滤，去除细胞杂质，将上清液在-80 ℃储存备用。
1.4.8 CCK-8法检测细胞增殖情况 将多发性骨髓瘤细胞U266以每孔2×103个细胞密度接种于96孔板，分2组，每组设置3个重复孔，对照组用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，实验组在对照组基础上添加衰老骨髓间充质干细胞条件培养基(10%体积比)，将培养板置于恒温培养箱中培养0，8，16，24 h，每孔加入10 μL CCK-8检测试剂继续培养2 h，使用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值。
1.4.9 流式细胞仪检测细胞凋亡率 将多发性骨髓瘤细胞U266以2×106个细胞密度接种于T25培养瓶中，分2组，对照组用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，实验组在对照组基础上添加衰老骨髓间充质干细胞条件培养基(10%体积比)。培养24 h后，800 r/min离心5 min，收集细胞沉淀，用1 mL预冷的PBS洗涤细胞，800 r/min离心5 min，每个样品管加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC/PI荧光染液避光反应30 min，上流式细胞仪进行检测。

1.4.10 RT-qPCR检测U266细胞中BCL-2 mRNA表达及骨髓间充质干细胞中 P21、半乳糖凝集素3 mRNA表达 将第3代骨髓间充质干细胞以1×105个细胞密度接种于T25培养瓶中，先用L-DMEM完全培养基培养，细胞融合至80%时，分2组，对照组继续用L-DMEM完全培养基培养24 h，实验组用含200 μmol/L H2O2的L-DMEM培养基培养2 h，然后更换为含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基培养24 h，采用Trizol 法提取细胞总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，然后在20 μL反应体积中进行荧光定量PCR。热循环条件为：在 95 ℃下初始变性30 s，在95 ℃下进行40次变性循环，持续5 s，然后在60 ℃下退火/延伸30 s。采用2-ΔΔCt相对定量方法对实验结果进行分析，实验重复3次以上。引物序列如表1所示。

将多发性骨髓瘤细胞U266以2×106个细胞密度接种于T25培养瓶中，分2组，对照组用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，实验组在对照组基础上添加衰老骨髓间充质干细胞条件培养基(10%体积比)。培养24 h后，采用Trizol法提取细胞总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，然后在20 μL反应体积中进行荧光定量PCR。热循环条件为：在95 ℃下初始变性30 s，在95 ℃下进行40次变性循环，持续5 s，然后在 60 ℃下退火/延伸30 s。采用2-ΔΔCt相对定量方法对实验结果进行分析，实验重复3次以上。引物序列如表1所示。
1.4.11 Western blot法检测U266细胞中BCL-2蛋白表达 将多发性骨髓瘤U266以2×106个细胞密度接种于T25培养瓶中，分2组，对照组用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，实验组在对照组基础上添加衰老骨髓间充质干细胞条件培养基(10%体积比)。培养24 h后，800 r/min离心5 min，收集各组细胞加RIPA细胞裂解液，冰上振荡混匀15 min，裂解完毕后，以4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清。将上清液与5×上样缓冲液以4∶1的比例混匀后金属浴96 ℃ 10 min使蛋白变性。蛋白样本放置于-80 ℃备用。取等量蛋白进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移到PVDF膜，使用快速封闭液封闭30 min，加入BCL-2一抗(稀释比例1∶1 000) 4 ℃孵育过夜，使用GAPDH为内参(抗体稀释比例1∶5 000)，TBST洗3次，每次10 min，二抗孵育2 h(稀释比例1∶5 000)，TBST洗3次，每次10 min，加入显影液于发光成像仪上成像，Image J分析条带灰度值。
1.4.12 ELISA检测多发性骨髓瘤患者和健康人骨髓中半乳糖凝集素3水平 样本处理步骤如下：采集4例多发性骨髓瘤患者及3例健康人骨髓样本后，立即于4 ℃、3 000×g离心15 min，分装上清于-80 ℃保存(冻融≤2次)。采用人半乳糖凝集素3 ELISA试剂盒，严格按说明书操作，以标准品浓度梯度设置制作标准曲线(R² > 0.99)，将多发性骨髓瘤患者和健康人骨髓上清加入孔板中，设置3个复孔，酶标板覆盖合适的膜，37 ℃温育90 min，吸净板孔中液体，依次加入配制好的生物素化抗体工作液，确保每孔100 μL，小心覆膜，37 ℃温育1 h，移除孔内液体，每孔加入洗涤剂350 μL，静置2 min后移除孔内液体并拍干，重复洗涤3次，每孔加入配好的酶结合物工作液100 μL，小心覆膜，置于37 ℃温育30 min，重复上述洗涤步骤5次，每孔加入底物溶液90 μL，覆膜，避光，37 ℃温育15-20 min，每孔加入终止液50 μL，立即在波长450 nm下测量各孔的吸光度值，根据所测标准品的吸光度值，结合标准品工作液的已知浓度，绘制标准曲线。
1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞中P21、半乳糖凝集素3 mRNA表达；②U266细胞增殖、凋亡情况以及U266细胞中BCL-2 mRNA和蛋白表达；③多发性骨髓瘤患者和健康人骨髓中半乳糖凝集素3水平。

1.6 统计学分析 原始数据经SPSS 22.0统计学软件整理分析，统计图表通过Graph Pad Prism 8软件绘制，用Flowjo V10分析流式结果，组间差异比较采用t检验，显著性水平为P < 0.05。所有统计方法经贵州医科大学生物统计学专家审核。

讨论

骨髓微环境是导致多发性骨髓瘤复发的重要因素，骨髓微环境可调节多发性骨髓瘤细胞的迁移、存活、增殖，多发性骨髓瘤细胞通过可溶性因子和细胞黏附分子与骨髓微环境相互作用，在疾病发展中起关键作用[2，22]。骨髓微环境由细胞成分(基质细胞、破骨细胞、骨髓源性抑制细胞等)和非细胞成分(细胞因子和液体环境[23-24])构成，而骨髓间充质干细胞是骨髓微环境中的重要成分之一[25]。研究表明，多发性骨髓瘤细胞与骨髓间充质干细胞相互作用诱导骨髓间充质干细胞自分泌或旁分泌，在促进多发性骨髓瘤发展中发挥至关重要的作用[26]。另有研究显示，多发性骨髓瘤骨髓微环境中骨髓间充质干细胞呈现衰老表型[8]，其可衍生大量的细胞因子从而调节肿瘤细胞的生长和存活[27-28]。目前多发性骨髓瘤细胞与骨髓间充质干细胞之间的相互作用已成为国内外研究的热点，而衰老骨髓间充质干细胞对多发性骨髓瘤细胞影响的相关研究甚少，该研究结果显示，衰老骨髓间充质干细胞中半乳糖凝集素3增多且衰老骨髓间充质干细胞条件培养基能上调多发性骨髓瘤细胞U266中BCL-2表达水平，从而促进多发性骨髓瘤细胞U266的增殖。
研究证明，多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞具有衰老相关表型[9，29]。此研究对骨髓间充质干细胞进行200 µmol/L 过氧化氢短期刺激，使它在氧化应激作用下呈现衰老表型，细胞体积明显变大，变成扁平样不规则的多角形，胞质增多，β-半乳糖苷酶染色阳性细胞明显增多，且P21衰老基因表达水平升高。
衰老骨髓间充质干细胞可能通过分泌细胞因子改变骨髓微环境并影响附近的恶性细胞，分泌的细胞因子称为衰老相关分泌表型[30]。该研究发现，衰老骨髓间充质干细胞中半乳糖凝集素3表达水平升高。半乳糖凝集素3可能是衰老相关分泌表型的重要成分之一，它是促癌活性的重要递质，与细胞增殖有关，并可能通过自分泌/旁分泌途径促进细胞增殖抵抗凋亡[31]。课题组前期研究表明，复制性衰老的脂肪源性间充质干细胞显著促进了结直肠癌细胞的增殖，并且与半乳糖凝集素3的表达有关[32]。半乳糖凝集素3是唯一包含BCL-2家族NWGR抗死亡基序的蛋白，通过磷酸化、易位和调节存活信号通路抑制化疗药物诱导的细胞凋亡[33]。该研究发现，与健康人相比，多发性骨髓瘤患者骨髓血中半乳糖凝集素3明显增加。通过衰老骨髓间充质干细胞条件培养基培养U266细胞24 h后，U266细胞凋亡明显减少，可能是半乳糖凝集素3通过调节BCL-2和其他BCL-2家族成员抑制多发性骨髓瘤细胞凋亡，在后续实验中将进一步研究半乳糖凝集素3调节BCL-2的相关机制。
既往文献报道，骨髓间充质干细胞条件培养基通过促进细胞增殖、迁移和抗凋亡作用从而促进肿瘤的发生发展[34-35]。该实验通过衰老骨髓间充质干细胞条件培养基培养U266细胞，检测U266细胞凋亡基因BCL-2水平，与对照组相比，实验组BCL-2 mRNA和蛋白表达水平显著上调。实验结果表明，衰老骨髓间充质干细胞通过旁分泌半乳糖凝集素3促进多发性骨髓瘤细胞U266增殖，其可能与上调BCL-2表达水平有关，抑制多发性骨髓瘤细胞凋亡，从而促进多发性骨髓瘤细胞的增殖。以上实验结果显示，衰老骨髓间充质干细胞可能会影响骨髓微环境，通过分泌相关细胞因子影响肿瘤细胞的增殖。
综上所述，衰老骨髓间充质干细胞可能通过旁分泌半乳糖凝集素3上调U266细胞BCL-2表达水平抑制多发性骨髓瘤细胞凋亡，从而促进多发性骨髓瘤细胞的增殖。该研究探索了衰老骨髓间充质干细胞与多发性骨髓瘤细胞的交互作用关系，为治疗多发性骨髓瘤提供了新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

衰老骨髓间充质干细胞通过半乳糖凝集素3促进多发性骨髓瘤细胞增殖

Senescent bone marrow mesenchymal stem cells promote multiple myeloma cell proliferation through galectins-3

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