唑来膦酸对双膦酸盐相关颌骨坏死小鼠颌骨骨髓间充质干细胞的影响

doi:10.12307/2026.308

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (13): 3217-3225.doi: 10.12307/2026.308

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唑来膦酸对双膦酸盐相关颌骨坏死小鼠颌骨骨髓间充质干细胞的影响

李朋礼1，杨燕美2，胡雅雯1，刘泓琦1，王曼伊3，闫舰飞3，顾斌2

1解放军总医院研究生院，北京市 100853；2解放军总医院第一医学中心口腔科，北京市 100853；3解放军第四军医大学口腔医院，陕西省西安市 710032

收稿日期:2025-04-03 修回日期:2025-05-31 接受日期:2025-06-12 出版日期:2026-05-08 发布日期:2025-12-24
通讯作者: 顾斌，博士，主任医师，教授，解放军总医院第一医学中心口腔科，北京市 100853；共同通讯作者：闫舰飞，博士，主治医师，解放军第四军医大学口腔医院，陕西省西安市 710032
作者简介:李朋礼，男，1996年生，汉族，解放军总医院研究生院在读硕士，主要从事口腔修复种植与干细胞研究。
基金资助:
国家老年疾病临床医学研究中心开放课题(NCRCG-PLAGH-2022017)，项目负责人：顾斌；军队后勤科研项目(JKAWS22J1006)，项目负责人：顾斌

Effect of zoledronic acid on jaw bone marrow mesenchymal stem cells in mice with bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw

Li Pengli1, Yang Yanmei2, Hu Yawen1, Liu Hongqi1, Wang Manyi3, Yan Jianfei3, Gu Bin2

1Graduate School of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2Department of Stomatology, First Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 3Stomatological Hospital of Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China

Received:2025-04-03 Revised:2025-05-31 Accepted:2025-06-12 Online:2026-05-08 Published:2025-12-24
Contact: Gu Bin, PhD, Chief physician, Professor, Department of Stomatology, First Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China; Yan Jianfei, PhD, Attending physician, Stomatological Hospital of Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China
About author:Li Pengli, Master candidate, Graduate School of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
Supported by:
Open Project of National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, No. NCRCG-PLAGH-2022017 (to GB); Military Logistics Research Project, No. JKAWS22J1006 (to GB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

双膦酸盐相关性颌骨坏死：是因长期使用双膦酸盐药物而引发的颌骨病变，这类药物抑制破骨细胞活性，虽能有效治疗骨质疏松和骨转移癌，但可能干扰颌骨正常代谢，导致骨组织坏死、暴露及愈合障碍。双膦酸盐相关性颌骨坏死多发生在拔牙或颌骨手术后，临床表现为骨暴露、疼痛、感染及愈合延迟，严重影响患者的生活质量。
唑来膦酸：对颌骨骨髓间充质干细胞的增殖、迁移及成骨分化功能具有显著影响。研究表明，当唑来膦酸浓度达到一定阈值时，其对细胞的抑制作用逐渐显现，表现为细胞增殖减缓、迁移能力下降、碱性磷酸酶活性和矿化结节形成显著降低以及成骨相关基因和蛋白表达水平下降。

摘要
背景：双膦酸盐类药物作为抗骨吸收治疗的核心药物，广泛应用于代谢性骨病的治疗，然而长期使用会引发双膦酸盐相关性颌骨坏死并发症。传统发病机制聚焦于双膦酸盐类药物对破骨细胞的抑制作用，但难以完全解释骨坏死病理发展过程，而与相对成熟的破骨细胞研究相比，双膦酸盐类药物对成骨相关细胞生物学特性及功能影响的报道较少，且部分报道之间存在差异，这种差异性可能源于实验体系、药物浓度及细胞来源，凸显了开展系统性、标准化研究的必要性。
目的：探讨临床常用第3代双膦酸盐——唑来膦酸对小鼠拔牙窝愈合及颌骨来源骨髓间充质干细胞增殖、迁移和成骨分化的影响。
方法：将16只雄性C57B/6J小鼠随机平均分为对照组和实验组，实验组腹腔注射唑来膦酸联合皮下注射地塞米松，对照组注射等量PBS，注射2周后拔除所有小鼠左侧上颌第一磨牙，继续注射2周后处死取材。通过拔牙窝创口大体观察、Micro CT成像与三维重建分析、苏木精-伊红染色观察小鼠拔牙窝骨改建、黏膜愈合情况；分离和培养两组小鼠下颌骨来源骨髓间充质干细胞，进行正常培养和成骨诱导培养后，通过CCK-8法、qPCR、Western blot以及碱性磷酸酶染色、茜素红染色，观察唑来膦酸对细胞增殖、迁移及成骨分化的影响。
结果与结论：①相比于对照组，实验组小鼠拔牙窝骨与黏膜愈合不良，炎性细胞浸润更明显；②相比于对照组，实验组小鼠颌骨来源骨髓间充质干细胞的增殖、迁移能力明显受到抑制(P < 0.05)；③相比于对照组，实验组小鼠颌骨来源骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶染色较弱，钙结节数量减少，成骨相关标志物碱性磷酸酶、整合素结合唾液酸蛋白、Ⅰ型胶原α1链、Runt相关转录因子2表达下调(P < 0.05)。结果表明：唑来膦酸可对小鼠拔牙窝愈合造成不良影响，可能与抑制颌骨来源骨髓间充质干细胞增殖、迁移、成骨分化有关。

https://orcid.org/0009-0002-9011-0053 (李朋礼)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 双膦酸盐, 颌骨骨坏死, 唑来膦酸, 颌骨, 拔牙窝, 间充质干细胞, 增殖, 迁移, 成骨分化

Abstract: BACKGROUND: Bisphosphonates, as the core drugs of anti-bone resorption therapy, are widely used in the treatment of metabolic bone diseases. However, long-term use can cause the complications of bisphosphonate related osteonecrosis of the jaw. The traditional pathogenesis focuses on the inhibitory effect of bisphosphonates on osteoclasts, but it is difficult to fully explain the pathological development of osteonecrosis. Compared with the relatively mature osteoclast research, there are fewer reports on the effects of bisphosphonates on the biological characteristics and functions of osteoblast-related cells, and there are differences between some reports. This difference may be due to the experimental system, drug concentration and cell source, highlighting the necessity of conducting systematic and standardized research.
OBJECTIVE: To investigate the effect of the third-generation bisphosphonate-zoledronic acid commonly used in clinical practice on the healing of tooth extraction sockets and the proliferation, migration and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells derived from the jaw in mice.
METHODS: Sixteen C57B/6J male mice were randomly divided into control group and experimental group. The experimental group was intraperitoneally injected with zoledronic acid combined with subcutaneous injection of dexamethasone; the control group was injected with the same amount of PBS. The left maxillary first molars of all mice were extracted after 2 weeks of injection, and the samples were sacrificed after 2 weeks of injection. The bone reconstruction and mucosal healing of the tooth extraction socket were observed by general observation of the wound of the tooth extraction socket, Micro CT imaging and three-dimensional reconstruction analysis, and hematoxylin-eosin staining. Bone marrow mesenchymal stem cells derived from the mandibular bones of the two groups of mice were isolated and cultured. After normal culture and osteogenic induction culture, the effects of zoledronic acid on cell proliferation, migration and osteogenic differentiation were observed by CCK-8 assay, qPCR, western blot assay, alkaline phosphatase staining, and Alizarin red staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, the bone and mucosa of the tooth extraction socket in the experimental group were poorly healed, and the inflammatory cell infiltration was more obvious. (2) Compared with the control group, the proliferation and migration abilities of bone marrow mesenchymal stem cells derived from the jaw in the experimental group were significantly inhibited (P < 0.05). (3) Compared with the control group, the alkaline phosphatase staining of bone marrow mesenchymal stem cells derived from the jaw in the experimental group was weaker, the number of calcium nodules decreased, and the expressions of alkaline phosphatase, bone sialic protein 2, type I collagen α1 chain and Runt-related transcription factor 2 were decreased (P < 0.05). The results showed that zoledronic acid could adversely affect the healing of the tooth extraction socket in mice, which may be related to the inhibition of the proliferation, migration and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells derived from the jaw.

Key words: bisphosphonate, osteonecrosis of the jaw, zoledronic acid, jaw, tooth extraction socket, mesenchymal stem cell, proliferation, migration, osteogenic differentiation

中图分类号:

李朋礼, 杨燕美, 胡雅雯, 刘泓琦, 王曼伊, 闫舰飞, 顾斌. 唑来膦酸对双膦酸盐相关颌骨坏死小鼠颌骨骨髓间充质干细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(13): 3217-3225.

Li Pengli, Yang Yanmei, Hu Yawen, Liu Hongqi, Wang Manyi, Yan Jianfei, Gu Bin. Effect of zoledronic acid on jaw bone marrow mesenchymal stem cells in mice with bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(13): 3217-3225.

图/表（结果） 4

2.1 双膦酸盐相关性颌骨坏死样病变小鼠拔牙窝愈合不良 为了研究双膦酸盐相关性颌骨坏死的潜在发病机制，通过注射唑来膦酸同时拔除小鼠左侧上颌第一磨牙来模拟人双膦酸盐相关性颌骨坏死病变过程，建立双膦酸盐相关性颌骨坏死样病变小鼠模型(图1A)。收集两组小鼠上颌骨，分析拔牙窝愈合情况。对照组(8/8)小鼠拔牙创口完全愈合，而实验组(6/8)小鼠拔牙窝伤口未完全愈合，未愈合率达到75% (图1B)。通过微计算机断层扫描(Micro-CT)与三维重建分析显示，与对照组相比，实验组小鼠拔牙窝区域的骨体积分数和骨矿物质改建均显著降低(图1C，D)。苏木精-伊红染色结果显示实验组小鼠拔牙窝骨空腔隙和炎性细胞浸润更严重(图1E)。

2.2 JBMMSCs的培养及表面标志物鉴定 两组细胞培养48 h后，光镜下可见有短梭形或三角形细胞自骨组织块边缘爬出，呈贴壁生长，同时可见悬浮生长的血细胞。继续培养至7 d后，镜下见细胞增殖至融合度80%-90%。此时按1∶2进行细胞传代培养。对照组和实验组细胞形态较为相似，均呈短梭形或三角形，胞体较小。随着传代，两组细胞快速增殖，胞体逐渐变大伸长，形态也变得较为均一(图2A)。流式结果显示，JBMMSCs免疫表型CD44、CD73、CD90及CD105阳性率均达到 95%以上，CD34、CD45均在5%以下，符合干细胞表面标志鉴定的要求(图2B)。

2.3 唑来膦酸对JBMMSCs增殖和迁移的影响 CCK-8法检测培养0-5 d的细胞增殖情况，两组JBMMSCs均呈现出稳定的体外扩增能力，但随着时间推移和培养，实验组细胞增殖能力明显降低(图3A)。将划痕处理的两组细胞培养0，24，48 h，镜下对同一区域细胞进行拍照，在迁移最远处细胞进行标记划线，计算迁移距离并进行统计学分析，实验组细胞迁移能力受到影响(图3B，C)。上述结果表明唑来膦酸对JBMMSCs的增殖和迁移能力有一定的抑制作用。

2.4 唑来膦酸对JBMMSCs成骨分化功能的影响 两组JBMMSCs成骨诱导7 d后，碱性磷酸酶染色结果显示，实验组JBMMSCs碱性磷酸酶染色明显弱于对照组(图4A)。成骨诱导14 d后进行茜素红染色，镜下观察到实验组JBMMSCs钙结节数量明显少于对照组(图4B)。成骨诱导7 d后采用qPCR检测成骨标志物碱性磷酸酶、整合素结合唾液酸蛋白、Ⅰ型胶原蛋白α1链、Runt相关转录因子2的mRNA表达水平变化(图4C)，以及Western blot检测Ⅰ型胶原蛋白α1链、整合素结合唾液酸蛋白、骨钙素、Runt相关转录因子2蛋白表达水平变化(图4D，E)，检测结果均显示实验组成骨相关的基因和蛋白表达降低，差异有显著性意义。上述结果表明唑来膦酸会抑制JBMMSCs的成骨分化功能。

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引言

双膦酸盐是近年来兴起的一类化学合成药物，分为含氮和非含氮两类，主要通过对破骨细胞活性和功能的抑制作用，治疗骨质疏松、多发性骨髓瘤等代谢性骨病[1-5]。然而，近年来双膦酸盐引发的双膦酸盐相关性颌骨坏死(bisphosphonate-related osteonecrosis of the Jaw)受到广泛关注。自2003年MARX[6]首次报道双膦酸盐相关性颌骨坏死以来，关于此病的病例报告数量逐年增加[7-9]。目前，中国每年约400万人次接受双膦酸盐治疗，全球年处方量达7 100万次，双膦酸盐相关性颌骨坏死的累积发病率在0.8%-12%之间，静脉给药者风险更高[10]。双膦酸盐相关性颌骨坏死多继发于拔牙、种植等有创操作，表现为黏膜溃烂、疼痛、感染，甚至骨暴露和病理性骨折，目前尚无公认的标准治疗方案，严重影响患者的身心健康和生活质量[11-13]。关于双膦酸盐相关性颌骨坏死的发病机制，目前已有骨代谢紊乱、微生物感染等多种假说被提出，但确切机制尚未完全阐明[14-18]。尽管骨代谢紊乱被认为是双膦酸盐相关性颌骨坏死的重要发病机制之一，但现有研究尚无法证明其在不同患者群体中的普遍性。此外，微生物感染假说也得到了一些研究的支持，研究表明口腔微生物可能通过引发局部炎症反应，进一步加剧骨组织的坏死，然而目前尚缺乏直接证据表明微生物感染是双膦酸盐相关性颌骨坏死的独立致病因素。因此，深入探讨双膦酸盐相关性颌骨坏死的发病机制并制定针对性预防和治疗策略，从而缓解患者痛苦，迫在眉睫。
破骨细胞是双膦酸盐药物的靶细胞，研究表明双膦酸盐可通过多种途径呈剂量依赖性抑制破骨细胞增殖与分化，并促进破骨细胞凋亡，同时还可以抑制成熟的破骨细胞形成肌动蛋白环从而抑制骨吸收功能，但这只能进一步丰富双膦酸盐抗骨吸收的药用机制，不足以说明会诱发骨坏死[19-23]。后来有学者将注意力转移至双膦酸盐对成骨细胞的研究，研究发现双膦酸盐可以呈剂量依赖的方式抑制成骨细胞的增殖，同时高浓度的双膦酸盐可降低成骨细胞的存活数量和迁移水平[24]。但双膦酸盐对成骨细胞分化的影响说法不一，有研究表明双膦酸盐可下调成骨细胞相关蛋白的表达，抑制成骨细胞分化成熟[25]；还有学者发现低剂量双膦酸盐促进成骨分化，高浓度时才会抑制成骨分化[26-27]。由此可见，双膦酸盐对成骨细胞分化的调控作用存在争议性，需要进一步研究明确。
此研究对小鼠腹腔注射临床常用的第3代双膦酸盐——唑来膦酸，观察唑来膦酸对小鼠拔牙窝愈合及颌骨来源骨髓间充质干细胞(jaw bone marrow mesenchymal stem cells，JBMMSCs)成骨分化的影响，以期进一步了解双膦酸盐相关性颌骨坏死的病理生理发展过程，为双膦酸盐相关性颌骨坏死的研究和预防治疗策略提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 动物实验研究，采用随机分组对照实验设计。
1.2 时间及地点 实验于2024年2-5月在中国科学院理化技术研究所实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 16只SPF级8周龄雄性C57BL/6J小鼠，体质量(22±2) g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司供应，动物生产许可证号：SCXK(京) 2024-0001。所有小鼠均在恒温恒湿屏障环境[温度(22±1) ℃，湿度(55±5)%，12 h昼夜节律]中进行为期4周的干预，干预期间自由摄食辐照灭菌饲料及酸化饮用水。
实验方案经中国科学院理化技术研究所实验动物伦理审查小组批准，审批号为IACUC-IPC-24004。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 实验试剂与仪器 唑来膦酸(Sigma，美国)；地塞米松(Sigma，美国)；α-MEM培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(Sigma，美国)；青链霉素双抗(Vivacell，以色列)；0.25%胰蛋白酶-EDTA、PBS(Vivacell，以色列)；Stem Gro®间充质干细胞无血清基础培养基(上海源培，中国)；40 g/L多聚甲醛、RNA提取试剂盒(天根生化科技，中国)；反转录试剂盒(Takara，日本)；BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher，美国)；酶标仪、实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)；0.2%茜素红染色液(索莱宝，中国)；BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(碧云天，中国)；CO2细胞培养箱(Thermo，美国)；倒置相差显微镜(LIOO，德国)；流式细胞仪(必科达，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 建立双膦酸盐相关性颌骨坏死样病变小鼠模型 16只6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠，随机分为2组(n=8)，根据临床患者所用药方式与剂量及啮齿类动物相对快速的骨代谢速度，实验组每周2次腹腔注射125 μg/kg 唑来膦酸合并每周1次皮下注射5 mg/kg地塞米松，对照组注射等量PBS，连续给药4周。首次注射2周后，在全麻下微创拔除每只小鼠左侧上颌第一磨牙，为确保手术过程的无菌操作，所有手术器械均经过严格的高温高压灭菌处理。术后密切观察小鼠的生命体征，确保其平稳恢复，按照既定方案继续给药。拔牙2周后，麻醉后处死小鼠，取上颌骨进行拔牙窝创口观察、Micro CT成像及Mimics三维重建分析、苏木精-伊红染色。
1.4.2 JBMMSCs的分离、培养与鉴定 拔牙2周后，麻醉状态下处死对照组和实验组小鼠，取两组小鼠下颌骨，剔除骨表面附着的肌肉、筋膜等结缔组织，利用咬骨钳将下颌骨组织剪碎至1-3 mm2大小，转移至15 mL离心管中，加入Ⅱ型胶原酶37 ℃消化90 min，800 r/min离心3 min，去除上清，然后将底部骨组织沉淀物转移至含α-MEM完全培养基(含95% α-MEM培养基、体积分数10%胎牛血清及1%青链霉素双抗)的培养皿中，于 37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养，48 h后首次半换液，随后每2 d进行全换液，显微镜下观察细胞生长状态，当细胞汇合度达到80%-90%时，按照1∶2的比例进行传代，取第3-5代细胞进行实验。流式细胞术鉴定细胞表面标志物的表达。
1.4.3 CCK-8法检测细胞增殖情况 第3代JBMMSCs以每孔100 µL接种于96孔板，细胞浓度约5×107 L-1，每孔约5 000个细胞，设4个副孔，在37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中培养，在第0，1，2，3，4，5天弃去培养基，每孔加90 µL α-MEM完全培养基和10 μL CCK-8试剂，避光孵育2 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值，绘制生长曲线。
1.4.4 细胞迁移实验 在6孔板背面绘制标记线，将第3代JBMMSCs以2×105个/孔细胞密度接种于6孔板，次日观察细胞融合率> 90%，用无菌枪头沿标记线划痕，PBS洗细胞两三次，洗去划下的漂浮细胞，加入Stem Gro®间充质干细胞无血清基础培养基，放入培养箱中培养，第0，24，48小时观察细胞迁移状况并拍照分析。
1.4.5 成骨诱导分化 将第3代JBMMSCs以2×105个/孔细胞密度接种于6孔板，使用α-MEM完全培养基培养细胞达70%融合时，更换为成骨诱导培养基(含体积分数10%胎牛血清、10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μg/mL维生素C、青链霉素双抗以及α-MEM培养基)培养，每两三天换液 1次，诱导7 d后，弃去培养基，PBS清洗2次，室温下用40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS清洗2次，使用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒进行染色，镜下观察染色结果并拍照；成骨诱导14 d后，镜下观察到细胞表面有钙结节生成，弃去培养基，PBS清洗2次，室温下用40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS清洗2次，加入茜素红染色液进行染色，镜下观察染色结果并拍照。

1.4.6 实时定量PCR检测成骨相关基因mRNA表达水平 利用RNA提取试剂盒，提取成骨诱导7 d后细胞总RNA，测定RNA浓度，利用反转录试剂盒将总 RNA反转录为cDNA，以此为模板使用实时定量PCR试剂盒进行扩增和检测，基因引物序列见表1。

1.4.7 Western blot 检测成骨相关蛋白表达水平 提取成骨诱导7 d后的细胞总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度，按照各组浓度定量至相同蛋白水平。制备SDS-PAGE胶，以每孔 20 μg蛋白上样量进行电泳并转膜，将膜放入含有5%牛血清白蛋白的封闭液内，在摇床上室温封闭1 h，TBST摇床洗涤3次，每次5 min，分别加入5%BSA稀释的一抗工作液(Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原蛋白α1链、整合素结合唾液酸蛋白、骨钙素，稀释比例为1∶1 000；内参为β-actin，稀释比例为1∶5 000)，4 ℃孵育过夜，次日加入HRP标记山羊抗兔二抗稀释液(1∶5 000)，室温下孵育1 h，通过ECL显色试剂盒显色，蛋白凝胶成像系统曝光成像，Image J软件进行灰度值分析。

1.5 主要观察指标 小鼠拔牙创口黏膜、骨组织愈合情况；小鼠JBMMSCs增殖、迁移以及成骨分化功能的变化。

1.6 统计学分析 实验均重复3次，实验数据用GraphPad Prism 9.0进行统计学分析，所有数据在分析前进行正态分析和方差齐性检验，如果满足正态分布和方差齐性，采用t检验、单因素方差分析验证显著性，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过解放军总医院研究生院生物统计学专家审核。

讨论

双膦酸盐类药物作为抗骨吸收的一线药物，其分子通过羟基磷灰石结合域靶向沉积于骨表面，可抑制破骨细胞活性及功能，有效阻断病理性骨吸收[28]。自1986年第1代依替膦酸盐上市以来，双膦酸盐类药物已广泛应用于骨质疏松、骨转移癌等疾病治疗，目前临床常用药物已发展至第3代双膦酸盐类药物——唑来膦酸。然而，长期使用该类药物会出现严重并发症——双膦酸盐相关性颌骨坏死，自2003年首次被报道以来备受关注，尽管已有多种假说试图解释双膦酸盐相关性颌骨坏死的发生机制，如骨代谢紊乱、血管生成抑制、微生物感染以及免疫抑制等，但其具体的病理生理过程仍未完全明确[14-18]。早期大部分研究集中在双膦酸盐类药物对骨代谢的影响，尤其是对破骨细胞的调控作用，研究显示双膦酸盐类药物可通过多种途径抑制破骨细胞的增殖、分化并诱导细胞凋亡，从而抑制骨吸收功能，但这不足以说明它会诱发颌骨坏死[19-23]。近年来，研究者们将注意力转移至对成骨细胞影响的研究，但关于双膦酸盐对成骨细胞分化调控作用的报道存在争议性，需要进一步明确。目前针对双膦酸盐相关性颌骨坏死的临床治疗多以对症治疗为主，包括保守治疗和手术治疗。此外，近年来也有部分研究探索了辅助性治疗方法，如高压氧、血小板浓缩制品、臭氧、特利帕肽以及分子层面的防治策略等等[29-35]，但仍有许多患者的治疗反应欠佳，且个体间疗效存在差异，因此目前尚未形成被广泛认可的治疗方案。基于此，模拟临床患者病理发展进程，构建实验动物模型，深入探究双膦酸盐类药物对成骨分化功能的调控作用，或将成为拓展双膦酸盐相关性颌骨坏死病理机制和防治策略新的突破口。
相较于大型动物模型(如猪、羊)，啮齿类动物尤其是小鼠具有成本低、繁殖快、基因操作便捷等优势，且小鼠缺乏哈弗氏系统重塑的特点可排除复杂骨改建机制的干扰，更适用于聚焦骨改建与骨重塑机制的研究，现已成为国际骨坏死研究联盟推荐的金标准模型[36-37]。通过模拟临床双膦酸盐用药周期(如注射唑来膦酸)联合创伤刺激(拔牙或种植手术)，可成功再现双膦酸盐相关性颌骨坏死特征性病理改变：黏膜愈合差、微血管密度下降，骨改建不良甚至出现骨坏死以及炎性细胞浸润等。基于此，该研究在2020年ADACHI等[38]提出的“双膦酸盐+拔牙”经典范式上，确定给药方式及剂量，辅以糖皮质激素进行建模。值得注意的是，许多接受双膦酸盐治疗的患者(如多发性骨髓瘤、骨转移癌患者)常同时使用糖皮质激素(如地塞米松)以控制炎症、水肿或化疗相关不良反应，同时联合地塞米松可缩短造模周期，在较短时间内重现双膦酸盐相关性颌骨坏死的典型特征[39-40]。
动物实验结果显示，实验组小鼠拔牙创愈合不佳、骨改建异常程度等显著高于对照组，与临床报道的双膦酸盐相关性颌骨坏死病例吻合，验证了模型的临床相关性。然而，需指出的是，啮齿类动物颌骨体积较小、骨代谢速率较快，可能放大双膦酸盐的病理效应，导致模型与人类疾病的病程差异。例如，人类双膦酸盐相关性颌骨坏死常需数月甚至数年的药物暴露，而小鼠模型通过短期高剂量给药即可诱发类似病变，这可能掩盖了长期低剂量用药的累积效应机制。此外，该研究建立的动物模型诱发因素较为简单，仅有“给药+拔牙”，未来研究中可考虑引入多因素复合模型，以更真实地模拟临床复杂病理环境。
实验成功分离、培养并鉴定小鼠JBMMSCs，选用第3代JBMMSCs进行细胞实验，有效避免了高代次细胞因衰老导致的分化能力下降问题。通过CCK-8和细胞迁移实验发现，实验组小鼠JBMMSCs的增殖、迁移能力明显受到抑制，这也与MANZANO-MOREND等[24]研究结果一致：双膦酸盐通过促进细胞周期在G0/G1期的阻滞，抑制成骨细胞的增殖，而细胞划痕愈合率下降也可能与唑来膦酸抑制整合素介导的黏附信号或下调基质金属蛋白酶的表达，从而削弱细胞的迁移修复能力有关。此外，双膦酸盐类药物还可通过干扰甲羟戊酸途径，抑制Rho家族GTP酶(如RhoA、Rac1)的异戊烯化修饰，从而破坏细胞骨架重组，阻碍细胞迁移[41]。成骨分化诱导后，实验组碱性磷酸酶活性显著降低，茜素红染色显示的矿化结节数量减少。同时，qPCR和Western blot检测发现成骨标志基因(如Runt相关转录因子2、骨钙素等)及蛋白表达水平均显著下调，这表明唑来膦酸不仅抑制JBMMSCs的增殖与迁移，还直接干扰其成骨分化进程。该结果与近年来关于双膦酸盐抑制骨形成的报道一致，HUANG等[27]研究表明，双膦酸盐类药物可下调成骨细胞骨形态发生蛋白2、Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶、骨钙素、骨粘连素和骨桥蛋白的表达，抑制成骨细胞分化成熟。针对以上结果，作者猜想在长时间、多次注射唑来膦酸情况下，使JBMMSCs处于一个药物浓度相对较高的环境，与前文所述高浓度唑来膦酸抑制JBMMSCs的增殖、迁移与成骨分化一致。
综上所述，该研究通过模拟临床双膦酸盐相关性颌骨坏死患者的病理发展过程，构建双膦酸盐相关性颌骨坏死样病变小鼠模型并进行相关实验，证明了唑来膦酸可对小鼠拔牙窝愈合造成不良影响；另一方面还能直接作用于JBMMSCs，抑制其增殖、迁移、成骨分化功能，为进一步探究双膦酸盐相关性颌骨坏死的机制奠定了一定的基础。但此研究仅在动物体内模拟探讨了唑来膦酸对JBMMSCs增殖、迁移以及成骨分化能力的影响，其可作为影响骨骼再生及治疗骨性疾病的作用靶点，未来还需利用体外细胞实验进一步探讨唑来膦酸影响JBMMSCs成骨分化的信号分子及相关通路调控机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

唑来膦酸对双膦酸盐相关颌骨坏死小鼠颌骨骨髓间充质干细胞的影响

Effect of zoledronic acid on jaw bone marrow mesenchymal stem cells in mice with bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw

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