2.1 大鼠后肢功能 BBB 评分 5 名实验人员分别在脊髓损 伤建模成功后 12，24，72 h 对大鼠后肢运动功能进行盲 法 BBB 评分，见图 1。 

2.2 脊髓损伤 72 h 后大鼠心肌细胞的自噬受到抑制 为了 明确大鼠脊髓损伤后心肌细胞自噬的变化情况，在大鼠 脊髓损伤 12，24，72 h 取心肌组织，采用 PCR 检测 LC3 mRNA 的表达水平。与假手术组相比，脊髓损伤大鼠心 肌组织中的 LC3 mRNA 表达降低，且在脊髓损伤 24，72 h 降低显著 (P < 0.05)。进一步采用 Western blot 检测自噬相 关蛋白的表达，与假手术组相比，脊髓损伤大鼠心肌组 织中自噬标志蛋白 LC3 的表达降低，自噬底物 p62 的表达 升高。以上结果表明，脊髓损伤后大鼠心肌细胞的自噬 受到抑制，且在脊髓损伤 72 h 后自噬水平降低最为显著 (P < 0.05)，见图 2。 
2.3 脊髓损伤大鼠血清可降低 H9c2 心肌细胞的存活率 为了检测脊髓损伤大鼠血清对心肌细胞的存活率是否有 影响，使用含体积分数 10% 脊髓损伤大鼠血清的培养基 处理 H9c2 心肌细胞 12，24，36，48 h，利用 CCK-8 法检 测细胞存活率，以假手术大鼠血清处理细胞作为对照。 如图 3 所示，在脊髓损伤大鼠血清处理 H9c2 细胞 24 h 时， 细胞存活率较对照组显著降低 (P < 0.000 1)。因此采用 24 h 的处理时间进行后续实验。 

2.4 确定木犀草素处理H9c2心肌细胞的安全浓度 为了确 定木犀草素处理 H9c2 心肌细胞的最适浓度，分别使用 10- 100 μmol/L 木犀草素处理细胞 24 h，采用 CCK-8 检测细胞 存活率。如图 4 所示，与空白对照组相比，10，20 μmol/L 木犀草素对细胞存活率无明显影响 (P > 0.05)，而用 30， 50，100 μmol/L 木犀草素处理 H9c2 细胞后，细胞存活率 显著降低 (P < 0.05)。因此采用 20 μmol/L 木犀草素进行后 续实验。 

2.5 木犀草素可改善脊髓损伤大鼠血清诱导的心肌细胞存 活率 与空白对照组相比，使用假手术大鼠血清处理细胞 后，细胞存活率无明显改变；使用脊髓损伤大鼠血清处 理细胞后，细胞存活率显著降低 (P < 0.01)；进一步使用 木犀草素预处理 H9c2 细胞 4 h，再用脊髓损伤大鼠血清 处理细胞 24 h，细胞存活率明显回升 (P < 0.000 1)，见图 5。 以上结果提示木犀草素可改善脊髓损伤大鼠血清对心肌 细胞造成的损伤。

2.6 木犀草素可改善脊髓损伤大鼠血清诱导的心肌细胞自 噬抑制 如图 6 所示，与假手术大鼠血清处理细胞相比， 脊髓损伤大鼠血清处理的 H9c2 细胞 LC3 蛋白表达显著降 低 (P < 0.05)，p62 蛋白表达显著升高 (P < 0.05)。进一步使 用 20 μmol/L 木犀草素对 H9c2 细胞预处理 4 h，再使用脊 髓损伤大鼠血清处理细胞 24 h，H9c2 细胞 LC3 蛋白表达 升高 (P < 0.05)，p62 蛋白表达降低 (P < 0.05)。以上结果表 明木犀草素可以改善脊髓损伤大鼠血清诱导的心肌细胞 自噬抑制。

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脊髓损伤是脊柱和神经外科中最常见的损伤之一[1] ， 而心功能不全是脊髓损伤常见的并发症，是引起脊髓损 伤患者死亡的重要原因 [2] 。研究表明，严重的脊髓损伤可 导致心肌萎缩、心肌结构改变 [3] 、左心室力学改变和心脏 功能受损等 [4] ，但具体机制并不清楚。因此，揭示脊髓损 伤患者出现心功能不全的机制对于提高患者的生存质量 和生存率有重要意义。

大量文献显示，心肌细胞死亡可引起心肌细胞进行 性丢失，进而导致心功能不全 [5-7] 。而自噬可以维持细胞 稳态，减少细胞死亡。自噬是细胞自我降解的过程，可 以清除细胞内错误折叠的蛋白质或受损的细胞器，维持 细胞稳态 [8] 。研究表明，自噬在基础和应激条件下可维持 心脏正常功能，而心肌细胞自噬异常在心功能不全的发 病机制中起着重要作用 [9-11] ，改善自噬可能是治疗脊髓损 伤后心功能不全的新靶点。

木犀草素 (3’，4’，5，7- 四羟基黄酮 ) 是一种天然的 黄酮类化合物，它丰富存在于多种植物中，如芹菜、菊花、 胡萝卜等。木犀草素具有抗炎、抗凋亡、抗过敏和抗癌 等多种生物学作用，在生物化学上可以作为抗氧化剂或 促氧化剂 [12-13] 。有研究表明，木犀草素可以促进自噬以减 轻脓毒症诱导的小鼠心肌损伤程度 [14] 。那么木犀草素是 否同样可以促进自噬进而改善脊髓损伤后的心功能不全 目前尚不清楚。

该研究发现脊髓损伤大鼠心肌组织自噬受到抑制， 而木犀草素可能通过促进自噬以改善脊髓损伤大鼠血清 诱导的心肌细胞死亡，为木犀草素改善脊髓损伤诱导的 心肌损伤提供一定的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1 设计 随机对照动物实验和细胞体外实验，组间比较 采用单因素方差分析。

1.2 时间及地点 实验于 2022 年 4 月至 2023 年 8 月在山 西医科大学基础研究中心完成。 

1.3 材料

1.3.1 实验动物与细胞 SPF 级雄性 SD 大鼠 24 只，4-6 周 龄，体质量 180-220 g，购自山西医科大学实验动物中心， 许可证号为 2021248。实验动物给予自由饮食，光照昼 夜交替各 12 h，温度维持在 24-26 ℃，待大鼠适应环境 1 周后开始实验。H9c2 细胞购自中国科学院上海细胞库。 实验方案经山西白求恩医院山西医学科学院实验动 物福利伦理委员会审查批准，审批号为 SBQDL-2022-077。 实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与 福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在 麻醉下进行所有的手术，并最大限度地减少其疼痛、痛 苦和死亡。

1.3.2 实验试剂与仪器 木犀草素 (Aladdin，L107328)； 二甲基亚砜 ( 中国索莱宝，D8371)；生理盐水 ( 碧云天， ST341)；CCK-8 检测试剂盒 (APE×Bio 公司 )；DMEM(Gibico 公司 )；胎牛血清 (Cell max 公司 )；胰蛋白酶 ( 索莱宝科 技有限公司 )；RIPA 裂解液 ( 武汉博士德生物工程有限 公司 )；PMSF 蛋白酶抑制剂 ( 武汉博士德生物工程有限 公司 )；蛋白质定量试剂盒 ( 武汉博士德生物工程有限公 司 )；SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒 (Minibio 公司 )；ECL 超敏 发光液 ( 大连美仑生物技术有限公司 )；兔抗鼠 LC3 抗体 (Abcam)；β-acttn 抗体 (Abcam，A5411)；山羊抗兔二抗 ( 中国中杉金桥，ZB-2306)；山羊抗鼠二抗 ( 中国中杉金 桥，ZB-2307)；恒温细胞培养箱 (Eppendorf，德国 )；低 温高速离心机 (Thermo Fisher，美国 )；酶标仪 (Molecular Devices，美国 )；电泳仪 (BIO-RAD，美国 )；半干转膜仪 (BIO-RAD，美国 )；Chemi Doc MP 全能型成像系统 (BIO-RAD， 美国 )。 

1.4 实验方法 

1.4.1 脊髓损伤大鼠动物模型建立 将 SD 大鼠随机分为假手术组和脊髓损伤 12，24，72 h 组，每组 6 只。使用 5% 戊巴比妥麻醉，在大鼠脊柱 T9-T11 部位备皮，剥离肌肉组 织，暴露脊椎，切除 T9-T11 椎板，暴露脊髓，使用改良的 Allen’s 冲击仪以 10 g 质量自 2.5 cm 高度自由落体冲击脊 髓。当大鼠出现摆尾、后肢抽搐即为造模成功。假手术 组仅暴露椎板，不损伤脊髓，之后逐层缝合大鼠伤口并 进行常规术后护理。假手术组和脊髓损伤组大鼠在造模 后 12，24，72 h 进行 BBB 评分以评估大鼠运动功能 [15] 。 脊髓损伤后 12，24，72 h 取大鼠心脏，采用 RT-qPCR 检 测心肌组织 LC3 mRNA 的表达，Western blot 检测心肌组 织中自噬相关蛋白 LC3 和 p62 的蛋白表达。脊髓损伤后 72 h 取大鼠血清，使用 0.22 μm 微孔过滤膜过滤后分装到 EP 管中。 

1.4.2 RT-qPCR 检测心肌组织 LC3 mRNA 的表达 收集假 手术组和脊髓损伤后 12，24，72 h 大鼠的心肌组织，使 用 TRIzol 试剂提取心肌组织中的总 RNA。运用反转录试 剂盒将总 RNA 反转录成 cDNA。利用 TB Green 荧光定量 PCR 试剂盒进行实时定量 PCR。RT-qPCR 循环条件为 95 ℃ 3 min；95 ℃ 35 s，55 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s (40 个循环 )； 60 ℃ 10 min。引物序列如表1所示，GAPDH作为内参基因， 通过 2-ΔΔCt 方法分析基因的相对表达。

1.4.3 Western blot 检测心肌组织自噬相关蛋白 LC3 和 p62 的蛋白表达 收集假手术组和脊髓损伤后 12，24， 72 h 大鼠的心肌组织，预冷 PBS 清洗，加入 RIPA+PMSF 裂 解 缓 冲 液 冰 上 裂 解 40 min， 收 集 裂 解 液，4 ℃、 12 000 r/min 离心 10 min，提取上清液至新 EP 管，使用 BCA 蛋白测定试剂盒检测蛋白的浓度。取蛋白样品，每孔 上样量为 38 μg，加入 5X 的 Loading Buffer 上样缓冲液， 金属浴 100 ℃高温煮沸，使蛋白变性，制备 12% SDSPAGE 以 80 V 转至 120 V 条件电泳分离蛋白质，然后通过 半干转将蛋白转移至 PVDF 膜，并使用 5% 奶粉封闭 2 h， 加入一抗 (p62 抗体和 LC3 抗体，1 ∶ 1 000 稀释 )，4 ℃ 孵育过夜，次日 TBST 清洗条带 3 次，每次 5 min，加入 二抗 ( 山羊抗兔、山羊抗鼠，1 ∶ 2 000 稀释 )4 ℃孵育 2 h，TBST清洗3次，将膜置于超高灵敏成像仪中进行曝光， 采集图像，使用 Image J 软件进行分析。 

1.4.4 细胞培养以及处理 将 H9c2 心肌细胞复苏至 25 cm2 细胞培养瓶中，使用含体积分数 10% 胎牛血清、1% 青 - 链霉素的 DMEM 培养基培养，细胞培养条件设置为 37 ℃ 和体积分数 5% CO2。

1.4.5 细胞活力测定 采用 CCK-8 实验方法测定细胞的存 活率。将 H9c2 细胞悬液接种在 96 孔细胞培养板内，每 孔细胞 103 -104 个，用 DMEM 完全培养基继续培养，当 细胞融合度达到 50%-60% 时，PBS 清洗后更换为含体积 分数 10% 脊髓损伤大鼠血清的 DMEM 培养基，继续培养 12，24，36，48 h，设置假手术大鼠血清培养作为阴性对 照组，以不含细胞，仅含有普通培养基为空白对照组。 之后每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，在培养箱内孵育 2 h 后， 使用多功能酶标仪测量 450 nm 波长处的吸光度值 (A)。细 胞相对活力=(A实验组-A空白对照组)/(A阴性对照组-A空白对照组)×100%。 

1.4.6 木犀草素对细胞毒性检测 采用 CCK-8 实验方 法 测 定 0，10，20，30，50 和 100 μmol/L 木 犀 草 素 对 H9c2 细胞的安全用药浓度。将 H9c2 细胞悬液接种 在 96 孔板内，每孔细胞 103 -104 个，置于 37 ℃和体积 分 数 5% CO2 培 养 箱 培 养。 当 细 胞 汇 合 达 到 50%-60% 时，加入不同浓度的木犀草素溶液，同时设置空白对照 组 ( 不含细胞，仅含有普通培养基 ) 和阴性对照组 ( 含 有普通培养基和心肌细胞 )。干预 24 h 后，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，继续培养 2 h 后使用多功能酶标仪 检测每孔细胞的吸光度值 (A)。细胞相对活力 =(A 实验组 - A 空白对照组 )/(A 阴性对照组 -A 空白对照组 )×100%。

1.4.7 木犀草素对脊髓损伤大鼠血清诱导心肌细胞死亡 的改善作用 将 H9c2 细胞分为空白对照组、假手术大鼠 血清组、脊髓损伤大鼠血清组以及木犀草素预处理组。 将 H9c2 细胞悬液接种在 96 孔板内，每孔细胞 103 -104 个，置于 37 ℃和体积分数 5% CO2 培养箱培养，当细胞 汇合达到 50%-60% 时，木犀草素预处理组即由普通培 养基更换为含有 20 μmol/L 木犀草素的 DMEM 培养基， 处理细胞 4 h 后更换为含脊髓损伤大鼠血清的 DMEM 培 养基。空白对照组更换普通培养基，假手术大鼠血清组 和脊髓损伤大鼠血清组更换为含假手术大鼠血清或含脊 髓损伤大鼠血清的 DMEM 培养基。继续培养 24 h 后每 孔加入 10 μL CCK-8 溶液，继续培养 2 h 后使用多功能 酶标仪检测每孔细胞的吸光度值 (A)。细胞相对活力 = (A 实验组 -A 空白对照组 )/(A 普通血清对照组 -A 空白对照组 )×100%。 1.4.8 Western blot 检测自噬相关蛋白 LC3 和 p62 的蛋白 表达 将 H9c2 细胞分为空白对照组、假手术大鼠血清组、 脊髓损伤大鼠血清组以及木犀草素预处理组。将 H9c2 细 胞悬液接种在 6 孔板内，每孔细胞 (1.0-1.2)×106 个，置 于 37 ℃和体积分数 5% CO2 培养箱培养，当细胞汇合达到 50%-60% 时，木犀草素预处理组即由普通培养基更换为 含有 20 μmol/L 木犀草素的 DMEM 培养基，处理细胞 4 h 后更换为含脊髓损伤大鼠血清的 DMEM 培养基。空白对 照组更换普通培养基，假手术大鼠血清组和脊髓损伤大鼠 血清组更换为含假手术大鼠血清或含脊髓损伤大鼠血清的DMEM 培养基。继续培养 24 h 后收集各组 H9c2 心肌细胞， 采用 1.4.3 方法检测自噬相关蛋白 LC3 和 p62 的蛋白表达。 

1.5 主要观察指标 ① BBB 评分；② LC3 的 mRNA 表达水 平；③心肌细胞活力；④ LC3、p62 的蛋白表达水平。

1.6 统计学分析 利用 GraphPad Prism 6.0 软件进行统计 学分析。所有数据以 x - ±s 表示，组间比较采用单因素方差 分析，P < 0.05 为差异有显著性意义。文章统计学方法已 经通过山西医科大学生物统计学专家审核。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脊髓损伤通常是由于外界的暴力冲击如高空坠落、 车祸等导致的脊椎压迫脊髓或脊髓横断等不可逆的急性 损伤 [16] 。心功能不全是脊髓损伤常见的并发症，研究显 示，脊髓损伤可导致心肌萎缩、左心室射血分数降低 [17] 、 心脏功能负荷增加 [18] 、心功能障碍等 [19] 。据统计，全球 住院患者中脊髓损伤的死亡率为 16.70%，而死于心功能 不全的脊髓损伤患者高达 75%[20] 。急性脊髓损伤可进展为 慢性脊髓损伤，其病理改变包括自主神经功能失控、循 环障碍、血管损伤以及炎症、氧化应激等 [21-22] ，这些改变 可能造成心肌细胞损伤、丢失、死亡而引发多种心脏疾 病最终导致心功能不全 [10，23-25] 。

研究表明自噬的稳态调节作用是保证心肌细胞正常 功能的重要因素。自噬是一种由溶酶体介导的能够降解受 损细胞器、错误折叠蛋白的调节方式。自噬可以通过平衡 细胞的合成与分解以稳定细胞内环境 [26] 。当自噬功能紊 乱时，心肌细胞功能失衡，可引起细胞死亡，可见心肌细 胞自噬异常在心功能不全的发病机制中起着重要作用[27] 。 自噬抑制可能是导致心肌细胞损伤的重要原因 [9-10] 。 WANG 等 [28] 的研究表明，在小鼠心肌梗死模型中，心脏 组织的自噬受到抑制，而促进心肌细胞中的 AMPK Thr172 和 CaMKII Thr287 磷酸化可诱导自噬，发挥心肌细胞保护 作用。自噬激活可在心脏缺血时保护心肌细胞，使其免 受营养缺乏和氧气剥夺的损伤 [29-30] 。心肌细胞自噬抑制 状态如果持续发生可加速心肌细胞的死亡，导致心功能 不全 [31] 。该研究表明，大鼠脊髓损伤后 12，24，72 h 心 肌组织自噬受到不同程度的抑制，表现为自噬标志物 LC3 mRNA 及蛋白的表达均降低，自噬底物 p62 蛋白累积， 且在损伤后 72 h 的自噬抑制具有显著意义。然而，由脊 髓损伤导致远隔部位的心肌自噬水平降低的原因是什么 呢？作者推测脊髓损伤大鼠血清中的某些物质可能导致 心肌细胞自噬抑制进而对心肌造成损伤。在此基础上提取脊髓损伤 72 h 大鼠血清并使用 0.22 μm 微孔过滤膜过 滤除菌后，用含体积分数 10% 脊髓损伤大鼠血清的培养 基处理心肌细胞 24 h，结果表明脊髓损伤大鼠血清抑制 心肌细胞自噬。因此上调自噬成为保护心肌细胞的有效途径。

木犀草素 (3’，4’，5，7- 四羟基黄酮 ) 作为天然黄酮 类化合物，存在于水果和蔬菜中，如芹菜、菊花、甜椒、 胡萝卜、洋葱叶、西兰花和欧芹 [13，29] 。在中国传统医学 中，富含木犀草素的植物被用于治疗高血压、炎症和癌症 等疾病。木犀草素具有抗炎、抗凋亡、抗过敏和抗癌等多 种生物学作用，在生物化学上可以作为抗氧化剂或促氧化 剂 [12，29-30] 。研究表明，木犀草素对高糖诱导的 H9c2 细胞 炎症模型有抑制作用，并且可以预防糖尿病小鼠心脏功能 和结构损伤 [32] 。此外，木犀草素对自噬具有调节作用。 在脓毒症诱导的小鼠心肌损伤模型中，心肌细胞自噬水平 降低，而木犀草素给药可以改善自噬抑制以减少心肌细 胞凋亡进而改善小鼠心脏功能 [29] 。木犀草素还可以通过 激活线粒体自噬减少阿霉素诱导的心肌细胞凋亡 [14] 。该 研究发现，木犀草素预处理脊髓损伤大鼠血清诱导的心 肌细胞损伤模型时，细胞的存活率明显提高，且自噬标 志蛋白 LC3 有所恢复，p62 蛋白累积显著下降，提示木犀 草素可能通过促进心肌细胞自噬从而提高 H9c2 细胞的存 活率。

该研究证实木犀草素可提高脊髓损伤大鼠血清诱导 的心肌细胞自噬水平，减少心肌细胞死亡。从心肌细胞自 噬抑制的角度探讨脊髓损伤诱导心功能不全的可能机制， 为治疗脊髓损伤后心功能不全寻找新的出路。然而该研究也存在不足之处，仅揭示脊髓损伤大鼠血清可以抑制 H9c2 细胞的自噬水平，但血清中具体发挥损伤作用的物 质并未明确，这也是研究进一步探讨的方向。

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文题释义：

脊髓损伤：通常是由于外界的暴力冲击如高空坠落、车祸等导致的脊椎压迫脊髓或脊髓横断等不可逆的急性损伤，可导致心功能不全等并 发症。 

自噬：是一种维持细胞稳态，降解细胞中衰老或损伤大分子蛋白质和细胞器的生物学过程，并为合成新的蛋白质和细胞器提供原料，广泛 存在于真核细胞中。自噬标志蛋白LC3和自噬底物p62蛋白通常作为检测自噬通量的重要指标。

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脊髓损伤后心功能异常通常是脊髓损伤患者的常见并发症，研究表明脊髓损伤可导致心肌萎缩、心脏功能负荷增加等，使得脊髓损伤患者的心血管疾病发病率增高及死亡增加。因此，脊髓损伤联盟关于脊髓损伤患者心脏疾病管理的临床实践指南倡导对常见心脏疾病进行早期筛查干预以降低心脏疾病的风险。我们的研究从心肌细胞自噬抑制的角度探讨脊髓损伤诱导心功能不全的可能机制，为治疗脊髓损伤后心功能不全寻找新的出路。

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