2.1   鹿角胶冻干粉得率   称取鹿角片500 g，共得到鹿角胶冻干粉322 g，得率为64.4%。
2.2   鹿角胶的蛋白含量测定结果   测得标准曲线为y=0.352 9x+0.060 3，R2=0.999 3，标准蛋白溶液在0-0.50 mg/mL浓度范围内线性良好，见图1；根据公式：蛋白质含量(%)=供试品浓度(mg/mL)×供试品溶液体积(mL)/供试品质量(mg)×100%，计算出鹿角胶样品蛋白质含量为(35.33±0.69)%。




2.3   鹿角胶的荧光标记及纯化结果    标记混合物在葡聚糖凝胶色谱柱上呈现3条色带，即FITC-CCC、未被标记的鹿角胶和过剩FITC，见图2。由于凝胶滤过色谱柱的分子筛原理[12]，相对分子质量大的物质先被洗脱出来，所以洗脱的第1条色带为荧光标志物FITC-CCC，洗脱的第2条色带为游离鹿角胶，剩下的色带为游离的FITC。收集第1条色带的洗脱物进行进一步检测。



2.4   FITC-CCC溶液的荧光成像考察   FITC溶液、FITC-CCC溶液、鹿角胶溶液在小动物活体成像仪中的荧光成像如图3所示，其中FITC溶液与FITC-CCC 溶液均显示出荧光，而鹿角胶溶液无荧光，说明鹿角胶本身不带有荧光。



2.5   FITC-CCC UV光谱扫描结果   由紫外光谱图可以看出，鹿角胶在420-600 nm范围内无特征吸收峰，FITC-CCC与FITC均在491.5 nm出现吸收峰，说明FITC已成功的标记到鹿角胶上，见图4。



2.6   荧光标记率的检测结果   以FITC作为标准品，其标准曲线回归方程为：y=483 903x+3 854.9 (R2=0.999 5)，测得FITC-CCC的荧光取代度为0.953%，达到了在满足检测灵敏度的前提下，拥有相对低的标记效率，最大化地减少了荧光标记对多肽功能和理化性质的影响。见图5。



2.7   荧光标记鹿角胶的体内示踪结果
2.7.1   实验动物数量分析   选用90只小鼠分为2组进行了荧光标记鹿角胶的入血成分荧光强度检测，另取114只小鼠进行体内示踪观察鹿角胶体内分布(6只)和骨组织分布(108只)，实验过程均无脱失，共204只小鼠进入结果分析。
2.7.2   FITC-CCC的入血成分荧光强度检测结果    45只小鼠灌胃FITC-CCC后，30 min至10 h内可以在血清中检测到荧光物质，其中灌胃2 h后，血液中荧光强度最强，说明此时鹿角胶在血清中分布最多。45只小鼠灌胃FITC后，15 min至11 h内可在血液中检测到荧光物质，其中，1-5 h荧光强度较强，见图6。



2.7.3   鹿角胶体内分布路线图   小鼠荧光成像结果见图7。灌胃FITC-CCC小鼠体内荧光强度呈现先增加后减少的趋势，大约灌胃1 h后，便可在股骨、胫骨附近发现荧光，荧光信号为3.2×108 P·(s·cm2·sr)-1/[μW·(cm2)-1]，说明此时FITC-CCC已在骨中富集，荧光信号在灌胃FITC-CCC 4 h左右达到最高水平，约为4.0×108P·(s·cm2·sr)-1[μW·(cm2)-1]，在骨中的富集一直持续到20 h后才逐渐消失。此外，灌胃FITC的小鼠骨的荧光信号明显低于灌胃FITC-CCC的小鼠。



2.7.4   鹿角胶骨组织分布图   为了进一步验证FITC-CCC是否具有骨靶向性，在相应时间点取小鼠双侧股骨与胫骨进行荧光成像，结果如图8所示。同样的，灌胃FITC-CCC 1 h后便在骨组织中检测到较强荧光，灌胃FITC-CCC小鼠的荧光信号要强于灌胃FITC小鼠。由此证明，鹿角胶可通过入骨发挥作用。



2.7.5   吸收入血及入骨荧光物质的鉴定   根据激光共聚焦显微镜及活体示踪检测结果，选择灌胃2 h后收集小鼠血清，灌胃4 h后提取小鼠双侧股骨与胫骨，组织匀浆收集蛋白液。通过对鹿角胶、血清、骨组织3组样品中凝胶电泳后荧光信号较强的样品蛋白进行二级质谱检测发现[13]，血液中的荧光物质为核糖体蛋白[14]、补体6蛋白[15]、超氧化物歧化酶[16]、重组激活蛋白1和核心蛋白聚糖(decorin，DCN)[17-18]，骨组织中带有荧光的功能性蛋白质分别为Toll样受体4[19]、核心蛋白聚糖和胸腺嘧啶β10。见图9。

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鹿角胶为梅花鹿Cervus nipport Temminck或马鹿Cervus elaphus Linnaeus的角经水煎煮、浓缩制成的固体胶[1]，其性温，味甘咸，归肾、肝经，具有温补肝肾、益精养血、益肾补骨的功效，被称为“血家圣药”，药用历史已有千年。鹿角胶在治疗骨科疾病方面具有悠久的历史与经验，有生精补髓、养血益阴、强筋健骨等功效，可用于股骨头坏死[2]、骨质疏松[3]、肾虚腰脊冷痛、膝关节炎的辅助治疗。前期研究表明，鹿角胶的主要活性成分鹿角胶小分子肽结构相对稳定，富含促进骨生长的肽链，能够促进骨细胞的存活与功能的建立，从中开发补骨新药，具有深厚的历史渊源和良好的应用前景[4-5]。但鹿角胶结构变化复杂，体内的生物降解与修饰过程繁冗，很难通过气相色谱、光谱、质谱等方法直接检测，难以确定其体内分布、吸收、代谢情况，严重制约了鹿角胶系列产品开发。
因此，建立多肽类大分子体内分布检测方法，对蛋白、多肽类药物的开发至关重要，也是深入研究鹿角胶药效物质的重要方法。目前，研究多肽类大分子体内分布的方法主要有同位素标记法[6]、免疫学方法[7]、荧光标记法等。同位素标记法和荧光标记法可以提高多肽检测的灵敏度，但同位素标记法具有放射性而且半衰期短，应用较少。荧光标记法操作简便、灵敏度高、毒副作用小、安全性高，已成为探究多肽类成分吸收入血并到达靶器官与组织的有效手段。常用的荧光染料主要有硫氰酸荧光素、绿色荧光蛋白[8]、罗丹明试剂[9]、花菁素类染料等[10]。而选择一种分子量小、不影响蛋白功能及活性、稳定无毒的荧光染料对方法的建立尤为重要。
异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)是一种在细胞生物学、免疫学、分子生物学研究领域广泛应用的荧光素类标记物[11]，其中的异硫氰基通过与被标记物如鹿角胶中多肽的伯胺基团反应形成硫脲键，成为牢固的荧光染料-蛋白质结合物，可实现对目标分子的荧光标记，具有量子产率高、寿命长、光稳定性好等优点。FITC荧光标记方法的建立极大促进了对中药大分子，尤其是蛋白多肽类、多糖类物质的开发。因此，此次研究在前期研究的基础上，采用FITC作为荧光探针对鹿角胶进行标记，通过紫外可见光谱研究标记样品的荧光特性。随后借助先进生物分子荧光标记及活体示踪技术绘制鹿角胶体内靶器官分布路线图，使鹿角胶在体内的分布过程可视化，确定其吸收、分布情况；采集给药后荧光最强时间点的血液及骨组织，分离荧光物质，将其中含有荧光蛋白的胶块酶解、纯化，通过蛋白质组学获得氨基酸组成序列，进行数据库搜索，确定吸收入血及入骨的鹿角胶成分，最终形成以鹿角胶为示范的多肽类药物体内药代动力学方案，为其下一步开发应用奠定基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   示踪动力学研究，随机对照动物实验。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。实验方案经山东省中医药研究院动物实验伦理委员会批准，批准号为No.SDZZY20201201001。
1.2   时间及地点   实验于2021年11月至2022年3月在山东省中医药研究院和山东大学医学转化平台完成。实验方案经山东省中医药研究院动物实验伦理委员会批准，批准号为No.SDZZY20201201001。
1.3   材料
1.3.1   动物   4周龄18-20 g KM小鼠204只，雌雄不限，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK (鲁)20190003。饲养于山东省中医药研究院中药药理所SPF级动物实验室内，室温23-25 ℃，湿度50%-60%，12 h光照和12 h黑暗周期，标准动物饲料进行喂养，开展实验前所有小鼠先适应性饲养3 d。
1.3.2   药品和试剂   鹿角片(山东建联盛嘉中药有限公司，产品批号：190039)，经山东省中医药研究院中药资源室林慧彬研究员鉴定为鹿科动物梅花鹿 Cervus nipport Temminck 锯茸后翌年春季脱落的角基；FITC(上海源叶生物科技有限公司，生产批号：J10GS151106)；葡萄糖凝胶G-25(北京索莱宝科技有限公司，生产批号：414S014)；异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司，生产批号：21103001)。
1.3.3   仪器   Xmark 型酶标仪(BIO-RA 有限公司，美国)；AllegraX-30R Cectrifuge高速冷冻离心机(艾本德公司，德国)；LGJ-10型冷冻干燥机(盛超科创生物科技有限公司，中国)；Nikon DS-U3型成像系统(尼康，日本)； ZX-002型紫外分光光度计(岛津，日本)；LSM880+Fast Airyscan型激光共聚焦显微镜(蔡司，德国)；R500IP型小动物麻醉机(瑞沃德生命科技有限公司，中国)；IVIS Spectrum型小动物活体成像仪(PE，美国)；Q Exactive型质谱仪(Thermo Fisher，美国)；Easy-nLC 1000型液相色谱仪(Thermo Fisher，美国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   鹿角胶的制备   按2020版《中国药典》方法制备成鹿角胶[1]：称取鹿角片500 g置于圆底烧瓶中，加入5倍量蒸馏水浸泡8 h，煎煮3 h后收集煎煮液，补充水量再煎，共煎煮2次；合并2次煎煮液，使用水浴锅高温浓缩至膏状后停止浓缩，冷却至室温即得鹿角胶。鹿角胶预冷后置于冷冻干燥机中冻干鹿角胶冻干粉，-20 ℃保存备用。
1.4.2   鹿角胶蛋白含量检测   精密称取鹿角胶冻干粉3份，用适量双蒸水复溶，配成0.5 mg/mL的供试品溶液。按BCA蛋白含量测定试剂盒要求操作，配置BCA工作液及标准品溶液，将需要检测的蛋白样品与BCA工作液在37 ℃培养箱中充分反应30 min 后，用酶标仪检测标准溶液及各样品在562 nm 的吸光度值。根据测得的标准品溶液吸光度值绘制出标准曲线，根据标准曲线计算出各样品的蛋白含量。
1.4.3   对鹿角胶进行荧光标记   精密称取鹿角胶1 080 mg，用pH 9.5的碳酸盐缓冲液配制成蛋白浓度为20 mg/mL的溶液，置于搅拌器上搅拌，缓缓加入FITC，避免粉末黏附于壁上，使每毫克蛋白含有0.01 mg FITC，4 ℃条件下反应24 h。使用葡聚糖凝胶G-25对标记好的鹿角胶进行分离，使用pH 7.2的PBS避光洗脱，除去未标记的FITC和盐类小分子杂质，收集标记的FITC-鹿角胶(FITC-cornus cervi colla，FITC-CCC)，所得样品冻干后保存。
1.4.4   FITC-CCC 溶液的荧光成像考察   设定小动物活体成像仪Ex=(475±30) nm，Em=(600±30) nm，分别将待测溶液(A：FITC 溶液，B：FITC-CCC 溶液，C：鹿角胶溶液)放置于小动物活体成像仪的暗箱里面进行成像摄影，观察其成像情况。
1.4.5   FITC-CCC UV光谱扫描   分别称取鹿角胶、FITC-CCC、FITC 1.5 mg，加入适量蒸馏水配制成1.5 mg/L的溶液，在波长420-600 nm内进行紫外光谱扫描，得到各样品紫外光谱图。
1.4.6   荧光标记率的检测   取5支琥珀色避光型ep管，分别加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL的1.0 μg/mL FITC标准溶液(精密称取1.0 mg FITC，蒸馏水溶解并定溶至100 mL 得质量浓度为10 μg/mL的FITC溶液，准确吸取10 μg/mL FITC溶液1.0 mL，加入9.0 mL 蒸馏水将FITC配制成1.0 μg/mL的FITC 标准溶液)，并分别加蒸馏水定容至5.0 mL，混匀。以等体积蒸馏水为空白对照，测定各管荧光强度(激发波长490 nm，
发射波长530 nm，狭缝宽10 nm)并绘制标准曲线。准确称取2.0 mg的FITC-CCC，用蒸馏水定容至10 mL 配制浓度为0.2 mg/mL的溶液，吸取1.0 mL 样品溶液，加入4.0 mL蒸馏水混匀后，检测其荧光强度，计算鹿角胶的荧光标记效率。
1.4.7   荧光标记鹿角胶的体内示踪研究
(1)FITC-CCC的入血成分荧光强度：随机选取45只KM小鼠禁食后，灌胃给予FITC-CCC水溶液350 mg/kg，分别于给药前(作为空白对照)，给药后15，30 min及1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 h后摘眼球取血500 μL，每个时间点3只。分离血清，将血清移至共聚焦显微镜专用玻片中，使用共聚焦显微镜检测荧光强度，记录血液中荧光强度变化，找到血液中荧光强度最强的时间点。同时，另取45只小鼠灌胃FITC水溶液(3.34 mg/kg)作为对照组，实验方法同上。
(2)活体成像示踪检测：另取6只小鼠随机分为2组，FITC-CCC组3只，FITC组3只。小鼠置于小动物气体麻醉机中，使用异氟烷-氧气混合气体麻醉小鼠后，俯卧位平放于动物多光谱活体成像系统的记录暗箱中。进行口服给药，给药方法和剂量同(1)。记录0.5，1，1.5，2，3，4，5，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，48 h荧光成像图片，对其药物分布情况进行监测，绘制鹿角胶体内分布路线图，并根据荧光的增强和衰减的过程，探讨药物在小鼠体内的吸收代谢情况。活体动物成像仪拍摄条件：拍摄像素2×2；FOV 12；激发波长480 nm；发射波长535 nm；曝光时间2 s。
(3)骨组织成像检测：另取108只小鼠分为2组，FITC-CCC组54只，FITC组54只。使用3%戊巴比妥钠按10 mL/kg剂量以腹腔注射方式麻醉小鼠，在灌胃0.5，1，1.5，2，3，4，5，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，48 h后取小鼠双侧股骨头，每个时间点取3只小鼠。将标本置于活体成像系统中进行拍摄，根据荧光的增强和衰减的过程，观测药物在骨头内的吸收代谢情况，确定股骨头部位荧光最强的时间点。
1.4.8   吸收入血及入骨成分检测
(1)吸收入血成分的采集：小鼠灌胃FITC-CCC，选取血液中荧光强度最强时间点，摘眼球取血，室温静置1 h后，1 500 r/min离心10 min，分离血清备用。
(2)吸收入骨成分的采集：小鼠灌胃FITC-CCC，选取股骨头部位荧光最强的时间点，解剖取股骨头部位，研磨匀浆，提取骨组织匀浆蛋白备用。
(3)吸收成分荧光物质的检测：对鹿角胶、血清及匀浆蛋白进行蛋白凝胶电泳，通过凝胶电泳找到荧光蛋白在电泳胶上的位置，将该蛋白经胶内胰酶消化试剂盒消化，使用高效液相色谱仪分离纯化含有荧光的肽段，得到荧光信号峰较强的样品。
(4)吸收部位荧光物质的鉴定：对得到的荧光峰信号较强的样品进行二级质谱检测，获得的数据比对UniProt数据库中梅花鹿的蛋白库中相应肽段的氨基酸组成序列，获得匹配度较高的蛋白，确定吸收入血与骨组织的鹿角胶成分。
1.5   主要观察指标   ①鹿角胶冻干粉得率；②鹿角胶的蛋白含量；③鹿角胶的荧光标记及纯化结果；④FITC-CCC 溶液的荧光成像考察结果；⑤FITC-CCC UV光谱扫描结果；⑥荧光标记率；⑦荧光标记鹿角胶的体内示踪结果。
1.6   统计学分析   采用SPSS 24.0软件对数据进行统计分析。数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。文章的统计学方法已经山东省中医药研究院统计学专家审核。

鹿角胶中富含多种氨基酸、多肽、蛋白质，含量高达85%以上。目前已从鹿角胶中分离和鉴定出了除赖氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸8种人体必需氨基酸外[20]，还含有丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、半胱氨酸共19种氨基酸，其中含量最多的为丙氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸和L-羟脯氨酸[21]。鹿角胶中多肽含量也较高，随着多组学技术的发展，目前已经从鹿角胶中检测出多种多肽。蒋梦彤等[22]借助定量多肽组学与糖基化分析鉴别结合的方式，从鹿角胶中鉴定了213个含Gal-Hyl肽段、102个含Glc-Gal-Hyl肽段，为胶类中药多肽成分的鉴别提供了新思路。鹿角胶中胶原蛋白的含量居于首位，占蛋白含量的80%[23]，胶原蛋白水解产物能够促进骨关节康复、帮助伤口愈合，为鹿角胶治疗骨相关疾病提供了物质基础。鹿角胶的蛋白质含量在许多文献中都有介绍[23-24]，但具体的测量值或范围都有所差异，一般在30%-60%之间，鹿角品种、生长环境、采集方式、采集时间、采后加工与贮藏方式都会对检测结果造成一定影响。此次研究中的鹿角胶样品的蛋白含量经BCA法测定为35.33%，与报道范围相符。
此次研究采用荧光标记法对鹿角胶进行荧光标记，提高了鹿角胶检测的灵敏度和特异性。与LC-MS技术等色谱分析方法相比，荧光标记法对样品分子质量的均匀性要求较低，能更全面地反映鹿角胶在体内的分布和代谢情况。与放射性同位素标记方法相比，虽然该方法的灵敏度较低，但不需要专用和昂贵的仪器和放射性试剂，操作简便，更适合普通实验室使用；但该方法仍存在鹿角胶被代谢或降解后无法检测到，不能反映鹿角胶在体内的降解或代谢情况。此次研究选用FITC与鹿角胶发生亲核反应生成FITC-CCC，实现了对鹿角胶的荧光标记。通过荧光成像和UV光谱考察，发现FITC成功标记到鹿角胶上，可用于研究鹿角胶在体内的分布和药代动力学。实验的荧光标记率为0.953%，虽然低标记率能减少荧光标记对多肽功能和理化性质的影响，但鹿角胶中仍有成分未被标记上，不能全面反映鹿角胶入血、入骨的有效成分，下一步实验需要进一步改进以提高鹿角胶的标记率。
能否被吸收入血是中药成分发挥生物活性的前提，入血成分的分析与鉴定可以为发现鹿角胶发挥药效的物质基础提供重要线索。此次研究通过灌胃FITC-CCC和FITC，应用共聚焦显微镜和荧光成像考察鹿角胶在体内的荧光强度变化，以此判断鹿角胶在体内的吸收消除情况。结果显示，FITC-CCC在给药2 h后在血液中的荧光强度最高，4 h后在骨内达到最高荧光强度。通过对鹿角胶、血清、骨组织3组样品中凝胶电泳后荧光信号较强的样品蛋白进行二级质谱检测，共鉴定出5个入血成分，4个入骨成分，其中核心蛋白聚糖的特征片段可同时在血液与骨中被检测到，推测核心蛋白聚糖是鹿角胶发挥药效的关键物质。
核心蛋白聚糖是一种富含亮氨酸的小蛋白聚糖，由一个含亮氨酸重复序列的蛋白质核心和一个由硫酸软骨素或硫酸皮肤软骨素组成的糖胺聚糖链组成。核心蛋白聚糖在骨骼生长和胶原蛋白形成过程中发挥重要作用。骨骼中90%有机物是胶原蛋白(主要是Ⅰ型)，在非胶原蛋白中蛋白聚糖占细胞外基质的10%-15%[25]。核心蛋白聚糖可直接影响矿物沉积[26]、与细胞因子的相互作用调节成骨细胞和破骨细胞的活性[27]、调节胶原纤维的粗细等多种方式调控骨矿化[28]。虽然蛋白聚糖在软骨基质中所占比例不足5%[29]，但却在维持软骨的力学及生化特性方面扮演着重要角色。CHERY等[30]证实了核心蛋白聚糖是体内软骨细胞周围基质微力学和软骨细胞机械转导的关键决定因素，也是天然软骨基质的重要组成部分，并表明调节核心蛋白聚糖活性可以改善软骨再生。HAN等[31]发现核心蛋白聚糖基因敲除小鼠出现严重的骨质疏松表现，软骨变薄，底层钙化组织暴露，骨小梁结构发生了改变，确定了核心蛋白聚糖对软骨蜕变的调节作用非常重要。因此，鹿角胶对于骨修复的作用可能与其入血入骨成分核心蛋白聚糖有一定的关联，同时，亦需要对其进行进一步的研究。
此次研究通过活体示踪技术，首次发现了鹿角胶中的药效关键物质核心蛋白聚糖，为鹿角胶的进一步应用提供了物质基础。此研究建立的荧光示踪方法，对鹿角胶等中药大分子的体内药代动力学研究也具有积极意义。相信随着荧光示踪及活体成像技术的成熟，药物在器官中的分布细节也将会更清晰地呈现出来，为复杂中药活性成分及其含量的解析提供更科学有效的手段。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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文题释义：

异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)：是荧光素的衍生物，以氧杂蒽为母体结构，相对分子质量为389.4，外观为橙黄色结晶粉末，最大吸收光波长和最大发射波长范围分别为490-495 nm和520-530 nm，其水和乙醇溶液呈现明亮的易检测的黄绿色荧光，且较易保存。FITC易与被标记分子中的-NH2，-OH，-SH等结合，可通过化学反应或生物修饰(例如蛋白质标记)的方式附着到目标分子上，赋予目标分子荧光特性。

核心蛋白聚糖(decorin，DCN)：是一种广泛分布于人体组织中的小分子蛋白多糖，属于富含亮氨酸小分子蛋白多糖家族，是细胞外基质的重要组成部分，同时是转化生长因子β1信号通路的天然拮抗剂，主要分布在哺乳动物的肌腱、软骨、主动脉、韧带等以结缔组织为主的部位。DCN具有修饰不同类型的胶原并调控胶原纤维合成及机械特性的能力。

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活体成像一般是指生物体处于活体状态下,在细胞和分子水平上应用多种成像模式对各种生物行为进行定性和定量分析研究的一种新技术。小动物活体成像技术中的光学成像主要采用生物发光(Bioluminescence)与荧光 (Fluorescence)两种技术，可以直接实时观察标记的基因及细胞在活体动物体内的活动及反应，被越来越广泛地应用于医学及生物学研究领域。该文章应用活体成像技术，动态观察鹿角胶在体内的分布动向，并得到直观的图像，结果一目了然，为鹿角胶等复杂大分子药物的体内活性成分研究提供了新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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