2.1   打靶片段的扩增结果   打靶片段长度为1 567 bp，产物经PCR扩增胶回收，质量浓度约为20 mg/L，结果见图1。



2.2   缺失株的构建   随机挑选14个克隆，各接种3 mL LB(含33 mg/L卡那霉素)，37 ℃培养过夜。用基因组上同源臂外侧的一对引物进行PCR检测，敲除前菌株的扩增产物长度为6 507 bp；当pgaABCD基因被Kn抗性基因替换后，这对引物的扩增产物长度缩短为1 745 bp；从PCR的扩增产物长度判断：除第4，11号克隆外，其余皆是替换成功的阳性克隆，结果见图2。



2.3   MG1655/ΔpgaABCD-Kn菌株中Kn抗性基因的删除   随机选取4个克隆，分别接种3 mL LB培养基，37 ℃培养过夜。各取0.5 L菌液用pgaABCD-outF和pgaABCD-outR引物进行PCR扩增鉴定，Kn抗性基因消除的克隆产物长度缩短为  352 bp；从PCR产物长度判断，4个克隆均为Kn抗性删除的阳性克隆。选择第1号克隆的PCR产物进行测序验证，结果与设计一致，即为缺失株MG1655/Δpga，见图3。



2.4   互补株的构建   选取互补株各2株，分别接种3 mL LB培养基，37 ℃培养过夜。各取0.5 μL菌液进行PCR扩增鉴定，结果见图4。



2.5   生长曲线的检测   通过检测吸光度值观察细菌的生长情况，见图5。结果显示，野生株与缺失株、互补株的生长并无显著性差异，即pgaABCD的敲除以及互补不影响细菌的生长。



2.6   刚果红琼脂平板法检测生物被膜的形成能力   通过刚果红平板上菌落的形态观察可得，菌落为黑色、光亮和干燥的为具有产生物被膜的阳性菌株；菌落为白色或红色、光滑的为不能产生物被膜的阴性菌株，见图6。缺失菌株MG1655/Δpga的生物被膜形成能力显著降低，仅存在较少黑色、光亮和干燥的菌落，说明pgaABCD是生物被膜形成的主要调控基因，但存在其他调控基因。互补菌株Δpga/pgaA、Δpga/pgaB、Δpga/pgaC、Δpga/pgaD在刚果红平板上均有黑色菌落产生，说明pgaA、pgaB、pgaC、pgaD这4个基因均参与生物被膜的形成。



2.7   结晶紫半定量法检测生物被膜的形成能力   基于96孔板结晶紫半定量法获得MG1655和缺失菌的吸光度值(600 nm)分别为0.906±0.032和0.518±0.061，统计分析表明MG1655/Δpga缺失株生物被膜形成能力显著低于野生株MG1655(P < 0.01)，互补株与野生株的生物膜形成能力差异均有显著性意义(P < 0.05)，而互补株之间的生物膜形成能力差异无显著性意义，见图7。



2.8   胞外多糖的含量   使用全波长扫描的紫外可见分光光度计分别对标品和样品进行全波长扫描，最大吸收波长为483.5 nm。以最大吸收波长为检测条件，标准曲线方程y=17.18x+0.046 6(R2=0.999 3)，x为葡萄糖显色终点质量浓度(g/L)，y为吸光度。采用苯酚-硫酸法检测细菌胞外多糖含量[13]，对处理后的细菌沉淀物进行溶解，吸光度检测，得出野生株、缺失株多糖的含量分别是(5.721±0.122) mg及(3.262±0.201) mg，缺失株MG1655/Δpga胞外多糖明显减少  (P < 0.01)，互补株与野生株中多糖含量的差异均有显著性意义(P < 0.05)，而互补株之间多糖含量的差异无显著性意义，见图8。



2.9   缺失株的透射电镜观察   采用负染法制样，野生株与缺失株的形态见图9。

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大肠埃希菌(Escherichia coli，E. coli)作为临床常见病原菌，是院内感染的重要病原菌，近年来其检出率呈逐年上升趋  势[1-2]。CHINET中国细菌耐药监测结果表明近3年(2018-2020年)大肠埃希菌在临床分离菌株的分布中位居首位[3-4]。大肠埃希菌不仅可黏附于医疗装置(如留置导尿管、气管内插管等)形成生物被膜相关的慢性感染，而且还能够在膀胱上皮细胞内形生物被膜，造成泌尿道持续性感染，导致生物被膜临床分离株及其耐药株的检出率呈上升趋势[5]。生物被膜的形成是细菌感染的主要机制，该状态下的细菌对抗生素的耐药性比游离状态提高103倍以上[6-7]。这使得生物被膜在临床上更易引发难治性的慢性感染，严重威胁了人类的健康。
目前，已发现细菌生物被膜形成的主要调控因素是密度感应系统[8-9]，细菌密度或饥饿等应激信号激活密度感应系统调节生物被膜形成，其中pgaABCD操纵子是生物被膜主要成分糖蛋白的编码基因，是生物被膜形成的重要调节基因之一。pgaABCD操纵子存在于多种细菌中，其编码的聚β-1，6-N-乙酰基-1，6-氨基葡萄糖胺聚合物在生物被膜形成中起重要作用[10]。pgaABCD是调控生物被膜形成的主要基因，是生物被膜主要成分糖蛋白的编码基因。pgaA、pgaB、pgaC、pgaD在同一个染色体上，pgaA和pgaB是糖蛋白输出的外膜蛋白，pgaC和pgaD是糖蛋白合成所必需的胞质膜蛋白。通过对聚β-1，6-N-乙酰基-1，6-氨基葡萄糖胺的合成、输出和定位，介导细胞间的黏附和表面黏附，pgaABCD促进生物被膜的形成[11]。大肠埃希菌中聚β-1，6-N-乙酰基-1，6-氨基葡萄糖胺的合成需要LysR家族的DNA结合蛋白NhaR，在高pH值和高浓度钠离子作用下激活pgaABCD的转录[12]。
pgaABCD基因对大肠埃希菌生物被膜的形成能力、胞外多糖、菌株形态影响的报道甚少。此次研究通过构建大肠埃希菌缺失株和互补株，分析其生物被膜形成的特征变化，进一步明确pgaABCD基因在生物被膜形成中的作用，为生物被膜介导的耐药机制提供研究基础。
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1.1   设计   大肠埃希菌缺失菌株实验，采用t检验比较2组数据间的差异。
1.2   时间及地点   实验于2020年5-12月在新疆医科大学第五附属医院检验科、新疆医科大学基础医学院完成。
1.3   材料
1.3.1   质粒与菌株   大肠埃希菌MG1655为新疆医科大学第五附属医院实验室保存菌株。质粒pKD46、pCP20、pBR322、PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。
1.3.2   试剂与仪器
(1)缺失株构建所用试剂：卡那霉素(生工，A506636-0025)、Taq DNA聚合酶(生工，B500010-0200)，dNTP Mix(生工，B500056-0500)，50X TAE 缓冲液(生工，B548101-0500)，L-(+)-Arabinose(BBI，A610071-0025)。
(2)生物被膜形成能力检测所用试剂：葡萄糖标准品(天津市致远化学试剂有限公司，2015041028)，刚果红(Sigma-Aldrich，C6767)，胰蛋白胨(Oxoid，1462108)、酵母抽提物(Oxoid，1167448)，结晶紫(Amersco，0231)，NaCl(Sigma-Aldrich，S9625)。
(3)其他化学试剂：甲醇(分析纯)购自成都市科隆化学品有限公司，无水乙醇、丙酮购自天津市福宇精细化工有限公司，磷钨酸(分析纯)天津市大茂化学试剂厂，戊二醛购自TED PELLA，INC。
(4)仪器：电转仪(BIO-RAD，1652100)，PCR扩增仪(ABI，Verty96well)，测序仪(ABI，3730XL)，分光光度计(日本岛津，UV-VIS 2550)，电泳仪(北京六一仪器厂，DYY-6C)，核酸蛋白定量仪(杭州奥康，Nano-100)。
1.4   方法
1.4.1   重组克隆E.coli MG1655/pKD46的获得   将Lambda Red重组系统的pKD46辅助质粒转化入MG1655感受态细胞，电击转化(电击参数：电压=2.5 kV，电容=25 μF，电阻=200 Ω)，转移至离心管，30 ℃、160 r/min培养复苏3 h。取20 μL转化菌铺LB平板，置30 ℃培养箱培养至单克隆形成，即为MG1655/pKD46单克隆。

1.4.2   打靶片段的扩增   选择pgaABCD基因待敲除位置两侧各50 bp序列作为基因打靶的上、下游同源臂(引物序列见表1)。设计上、下游同源臂分别位于Kn抗性基因特异引物的两侧，通过化学合成得到可用于PCR扩增的长引物。以pKD4质粒为模板，用pfu酶对打靶片段含FRT重组位点的Kn抗性基因点进行扩增。扩增条件：95 ℃ 5 min，(95 ℃ 30 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 90 s)×30个循环，72 ℃ 7 min。以质粒pKD4为模板，用上述长引物经高保真PCR扩增得到pgaABCD基因打靶片段。

1.4.3   pgaABCD缺失株的构建
(1)pgaABCD打靶片段转化进入MG1655/pKD46感受态细胞：将E. coli MG1655/pKD46单克隆接种于LB肉汤       (50 mg/L Amp)中，30 ℃培养过夜。吸取0.5 mL加入50 mL LB肉汤中，并加入L-(+)-Arabinose，30 ℃、220 r/min培养至吸光度A600 nm达到0.5，处理与收集菌体，即为MG1655/pKD46电转化感受态细胞。取400 ng纯化的pgaABCD打靶片段加入MG1655/pKD46感受态细胞，电击转化(电击参数：电压=2.5 kV，电容=25 μF，电阻=200 Ω)。转移入离心管，30 ℃、160 r/min培养复苏3 h。铺LB平板(含33 mg/L卡那霉素)，置37 ℃培养箱培养至单克隆形成，即为MG1655/ΔpgaABCD-Kn单克隆。
(2)重组克隆的PCR筛选与鉴定：用PCR筛选鉴定重组克隆，敲除菌株鉴定引物pgaABCD-outF、pgaABCD-outR序列见表1。扩增条件：95 ℃ 5 min，( 95 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 120 s) × 35个循环，72 ℃ 7 min。
1.4.4   MG1655/ΔpgaABCD-Kn中Kn抗性基因的删除
(1)制备MG1655/ΔpgaABCD-Kn的电转化感受态细胞：MG1655/ΔpgaABCD-Kn接种于LB肉汤，30 ℃、220 r/min培养过夜，提取pCP20质粒。取1 μL pCP20质粒(10 mg/L)加入90 μL MG1655/ΔpgaABCD-Kn感受态细胞，冰上预冷10 min后，加入到电击杯(BioRad，2 mm)，于25 μF，200 Ω，2.5 kV下电击。
(2)阳性克隆(Kn抗性基因删除)的鉴定：完后电击后加入900 μL的LB肉汤悬浮细胞，30 ℃、160 r/min培养2 h。取10 μL涂LB平板，30 ℃培养过夜至单克隆形成，使质粒表达重组酶，删除氯霉素抗性基因。挑选生长良好的单个克隆接种于LB平板，42 ℃培养过夜，使质粒丢失。选取4个克隆，分别接种3 mL LB肉汤，37 ℃培养过夜。各取0.5 μL菌液用pgaABCD-outF和pgaABCD-outR引物再次进行PCR扩增及测序鉴定。
1.4.5   互补株的构建   选择质粒pBR322作为回补载体，将单个基因pgaA、pgaB、pgaC、pgaD连同上游的Shine-Dalgarno sequence(SD顺序)克隆于pBR322质粒四环素抗性基因(Tc)的EcoRV和SalI位点之间，获得细胞内稳定的组成型表达。pBR322-pgaA、pgaB、pgaC、pgaD表达的4个蛋白均为细胞内的天然结构，非融合蛋白，在每个基因的SD顺序前面添加了终止密码。构建pBR322-pgaA、pgaB、pgaC、pgaD四个质粒，通过电转化的方式分别转入MG1655/Δpga，获得相应的互补株：Δpga/pgaA、Δpga/pgaB、Δpga/pgaC、Δpga/pgaD。
1.4.6   缺失株、互补株的生长曲线及生物被膜形成能力的检测
(1)受试菌株：试验菌：MG1655、MG1655/Δpga、Δpga/pgaA、Δpga/pgaB、Δpga/pgaC、Δpga/pgaD；阴性对照菌株：表皮葡萄球菌ATCC 12228；阳性对照为前期实验获得的生物被膜形成能力较强的菌株S1。
(2)生长曲线的检测：观察受试菌株0，12，24 h生长情况，并绘制生长曲线。
(3)刚果红琼脂平板法：受试菌株经传代培养，选取各受试菌株的单个菌株分别接种于LB肉汤中，在37 ℃，120 r/min条件下培养18 h；然后接种于刚果红琼脂平板，37 ℃倒置培养24 h取出，放于室温24 h后，观察结果。
(4)结晶紫半定量法：受试菌株经传代培养，挑取单菌落于37 ℃、150 r/min培养约18 h后，稀释至0.5 McFarland浊度，进一步再稀释100倍。在96孔板中每孔加200 μL菌液，阴性对照为200 μL LB肉汤，每株菌设置12个复孔，37 ℃孵育24 h。小心弃去上清培养基，用灭菌0.01 mol/L PBS(pH 7.4)轻轻冲洗3次。每孔加入200 μL甲醇固定15 min后，弃甲醇，每孔加入0.1%结晶紫染10 min，蒸馏水冲洗至空白对照孔未见明显颜色。自然晾干后加入200 μL(乙醇∶丙酮=80∶20)溶解，于600 nm处测定吸光度值。
1.4.7   胞外多糖含量的测定
(1)葡萄糖检测标准曲线的建立：分别吸取葡萄糖标准品0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于试管中，以蒸馏水补至2.0 mL，加入5%苯酚1.0 mL、浓硫酸5.0 mL，摇匀室温放置20 min，以2.0 mL蒸馏水按同样显色操作为空白，以最大吸收波长为检测条件，以葡萄糖显色终点质量浓度(g/L)为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
(2)苯酚-硫酸法检测细菌的胞外多糖：挑取受试菌单菌落于LB肉汤，37 ℃120 r/min培养18 h，按1%接种量将过夜培养物转接于100 mL LB肉汤中，37 ℃、120 r/min培养8 h。4 ℃、4 000 r/min离心15 min，弃上清。蒸馏水重悬沉淀后加入体积分数37%的甲醛溶液，4 ℃保存2 h。然后加入1 mol/L NaOH，4 ℃再保存2 h。4 ℃、12 000 r/min离心20 min，弃上清，留取沉淀待查。将沉淀按“1.4.7(1)”方法制备，实验平行3次，测定样品吸光度，并根据标准曲线计算多糖含量。
1.4.8   形态学观察   将受试菌在37 ℃、150 r/min恒温摇床上连续培养24 h，4 ℃、3 000 r/min离心10 min；收集供试菌沉淀并用PBS洗涤3次，弃上清，加入200 μL小牛血清溶液，使菌体重悬，再次离心；完全吸除小牛血清溶液，快速加入2.5%戊二醛溶液置于4 ℃冰箱固定2 h。用PBS洗去戊二醛，取体积分数1%四氧化锇溶液固定1 h，加入PBS洗涤3次，每次10 min；再依次加入体积分数为50%，70%，80%，90%，100%丙酮进行梯度洗涤脱水，每次15 min，去除丙酮，包埋剂浸透、包埋、切片、镜检，透射电镜观察菌体的超微结构。
1.5   主要观察指标   应用刚果红平板、结晶紫半定量法、透射电镜检测构建菌株生物被膜形成能力的特性变化，苯酚-硫酸法检测其胞外多糖的含量。
1.6   统计学分析   所有数据采用x±s表示，运用SPSS 22.0软件进行t检验，P < 0.05表明差异有显著性意义。

此次研究建立了Lambda Red重组系统，成功构建大肠埃希菌缺失株MG1655/Δpga，互补株Δpga/pgaA、Δpga/pgaB、Δpga/pgaC、Δpga/pgaD。利用辅助质粒pCP20删除Kn抗性基因，完成无痕敲除。该方法具有稳定、高效的特点，为研究pgaABCD对大肠埃希菌生物被膜的影响建立了良好的基础。
采用成熟的定性和定量的方法，刚果红平板检测缺失株与互补株的生物被膜形成的表象变化[14]。通过刚果红平板的形态观察，发现缺失菌、互补菌形成的黑色菌落显著减少，但缺失菌仍有少量的黑色菌落，即生物被膜的形成不仅仅受pgaABCD的唯一调控。而互补菌也呈现不同的程度的少量黑色菌落，说明pgaA、pgaB、pgaC、pgaD可促进生物被膜的形成，但单独存在的基因其调控能力显著低于pgaABCD的调控能力。
采用结晶紫半定量法检测缺失株与互补株生物被膜形成能力的变化[15]，充分说明pgaABCD的缺失显著影响大肠埃希菌生物被膜的形成能力。结合胞外多糖的含量检测，进一步表明大肠埃希菌pgaABCD基因的缺失会影响生物被膜的特性，且pgaA、pgaB、pgaC、pgaD均参与生物被膜的形成。定性和定量实验发现，pgaABCD的缺失并没有使大肠埃希菌的生物被膜形成能力丧失，即存在其他生物被膜形成的调控基因。透射电镜观察发现缺失株MG1655/Δpga菌体的细胞壁、细胞膜变化明显，即pgaABCD对大肠埃希菌细胞的完整性、细胞膜、细胞壁以及细胞质造成了一定的损伤，该发现未曾见报道，为进一步明确pgaABCD对大肠埃希菌结构的影响提供实验基础。
研究表明，细菌在生物被膜形成的过程中会释放由密度感应系统合成的自诱导信号分子[16]。大肠埃希菌的密度感应信号分子主要是依赖S-核糖基高半胱氨酸酶基因产物的自诱导信号分子2系统[17]，S-核糖基高半胱氨酸酶是自诱导信号分子2生物合成中不可或缺的酶。大肠埃希菌的S-核糖基高半胱氨酸酶基因编码的蛋白酶催化合成自诱导信号分子2信号分子，是生物被膜形成的重要调节基因[18]，这为大肠埃希菌生物被膜形成的调控机制提供了新的探索途径，为生物被膜靶点治疗的药物研发开辟了新的途径。
近年来，生物被膜介导的耐药大肠埃希菌呈上升趋势，且导致反复慢性感染，较难根治，瞄准生物被膜形成的主要调控基因，缓解或抑制生物被膜的形成是治疗生物被膜介导的感染的一条潜在途径。此次研究明确了pgaABCD基因在生物被膜形成中的作用，对大肠埃希菌生物被膜特性的影响，为生物被膜介导的耐药机制研究提供了研究基础。
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文题释义：
Lambda Red重组技术：该技术能使外源同源线性DNA片段快速与基因组DNA相应基因同源重组，主要包括pKD46、pKD3、pCP20三个协助质粒。该方法广泛用于细菌的基因重组，稳定性较好，方法成熟。此次研究采用质粒pKD46、pCP20、pBR322，成功构建大肠埃希菌pgaABCD基因的缺失株和互补株，稳定性较好，适合该基因的敲除和回补。
生物被膜：生物被膜细菌对抗生素和杀菌消毒剂的抵抗力比浮游的非生物膜细菌高100-1 000倍，抗生素的应用不仅不能有效清除生物被膜，甚至还可以诱导细菌耐药性的产生，即生物被膜是造成细菌耐药性的首要因素。

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生物被膜的形成是细菌感染的主要机制，该状态下的细菌对抗生素的耐药性比游离状态提高10³倍以上。这使得生物被膜在临床上更易引发难治性的慢性感染，严重威胁了人类的健康。目前已发现细菌生物被膜形成的主要调控因素是密度感应系统，细菌密度或饥饿等应激信号激活密度感应系统调节生物被膜形成，其中pgaABCD操纵子是生物被膜主要成分糖蛋白的编码基因，是生物被膜形成的重要调节基因之一。

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