基因转染骨髓间充质干细胞复合同种异体骨修复绵羊极限骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.47.001

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (47): 8141-8148.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.47.001

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基因转染骨髓间充质干细胞复合同种异体骨修复绵羊极限骨缺损

王小志，何惠宇，杨楠，杨泽辉，胡杨

新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

修回日期:2013-09-01 出版日期:2013-11-19 发布日期:2013-11-19
通讯作者: 何惠宇，博士，主任医师，博士生导师，新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054 hehuiyu01@126.com
作者简介:王小志★，男，1987年生，新疆维吾尔自治区木垒县人，新疆医科大学在读硕士，主要从事口腔修复学临床及基础研究。 476942426@qq.com
基金资助:
国家自然科学基金项目(81060088)*，课题项目名称：三维打印构建组织工程化牙槽骨的实验研究

Gene-transfected bone marrow mesenchymal stem cells combined with allogeneic bone for repair of sheep critical-size bone defects

Wang Xiao-zhi, He Hui-yu, Yang Nan, Yang Ze-hui, Hu Yang

Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2013-09-01 Online:2013-11-19 Published:2013-11-19
Contact: He Hui-yu, M.D., Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China hehuiyu01@126.com
About author:Wang Xiao-zhi★, Studying for master’s degree, Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China 476942426@qq.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81060088*

摘要/Abstract

摘要：

背景：多项体内外实验表明外源性植入碱性成纤维细胞生长因子能明显促进骨形成过程，但外源性碱性成纤维细胞生长因子在体内易降解，影响疗效。
目的：利用分子生物学技术将碱性成纤维细胞生长因子转染至骨髓间充质干细胞中，观察同种异体骨复合基因转染骨髓间充质干细胞修复绵羊极限骨缺损的效果。
方法：将同种异体骨复合碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞组织工程骨、骨髓间充质干细胞复合同种异体支架骨材料、同种异体支架骨材料、β-磷酸三钙材料分别植入羊髂骨极限缺损处，植入后4，8，12周行组织学、免疫组织化学染色观察。
结果与结论：同种异体骨复合碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞组织工程骨植入后12周，手术结合区成软骨样结构较多，术区中央可见大量成骨样细胞，整个术区的支架材料降解较其他组多，支架材料孔洞内爬满纤维结缔组织，材料周围常见破骨样细胞；骨涎蛋白与Ⅰ型胶原呈强阳性表达。其他3组手术结合区虽有成软骨样结构及成骨样细胞出现，但中央区为死骨结构，且骨涎蛋白与Ⅰ型胶原呈弱表达。表明碱性成纤维细胞生长因子转染的骨髓间充质干细胞复合同种异体骨可基本修复绵羊极限骨缺损。

关键词: 生物相容性材料, 骨髓, 干细胞, 成纤维细胞生长因子2, 转染

Abstract:

BACKGROUND: Many in vivo and in vitro experiments indicate that implantation of exogenous basic fibroblast growth factor can significantly promote the process of bone formation, but the in vivo degradation of exogenous basic fibroblast growth factor affects the therapeutic efficacy.
OBJECTIVE: To observe the effects of basic fibroblast growth factor-transfected mesenchymal stem cells which transfected using molecular biology techniques combined with allogeneic bone in the repair of critical-size bone defects in sheep.
METHODS: Allogeneic bone with basic fibroblast growth factor-transfected bone marrow mesenchymal stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells combined with allogeneic bone material stents, allograft bone material, β-tricalcium calcium material were respectively implanted into critical-size bone defects in sheep. After 4, 8 and 12 weeks, histological and immunohistochemical staining was performed.
RESULTS AND CONCLUSION: At 12 weeks after implantation of allogeneic bone with basic fibroblast growth factor-transfected bone marrow mesenchymal stem cells as tissue engineering bone, there were many cartilage-like structures in the operative binding region and a large amount of osteoblast-like cells in the center of operative region, and there was more material degradation in the entire operative area as compared with other groups; there were fibrous connective tissues full of the pores, and osteoclast-like cells were commonly seen around the implant material; bone sialoprotein and collagen type Ⅰ expression were strongly positive. In the other three groups, although the cartilage-like structure appeared in the binding region, dead bone structure was found in the central area, and bone sialoprotein and type Ⅰ collagen expression was weak. These findings indicate that allogeneic bone with basic fibroblast growth factor-transfected bone marrow mesenchymal stem cells can basically repair critical-size bone defects in sheep.

Key words: biocompatible materials, bone marrow, stem cells, fibroblast growth factor 2, transfection

中图分类号:

R318

王小志，何惠宇，杨楠，杨泽辉，胡杨. 基因转染骨髓间充质干细胞复合同种异体骨修复绵羊极限骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(47): 8141-8148.

Wang Xiao-zhi, He Hui-yu, Yang Nan, Yang Ze-hui, Hu Yang. Gene-transfected bone marrow mesenchymal stem cells combined with allogeneic bone for repair of sheep critical-size bone defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(47): 8141-8148.

图/表（结果） 5

2.1 各组大体观察结果 术后4，8，12周实验动物均存活，伤口愈合良好。
术后4周，基因转染细胞支架组移植区完全被骨膜覆盖，剖面见致密结缔组织，至8，12周移植区内新骨形成逐渐增多，骨皮质表面平整无凹陷或凸起，人工骨与周边骨床界限不清，用口腔探针刺探缺损修复区硬度与周围基本一致，达到正常骨硬度。
术后4周，细胞支架组、磷酸三钙组、支架组在各时间点均无明显新骨生成，但各有差异。细胞支架组移植区后完全被骨膜覆盖，剖面见结缔组织，随时间点推移有所增加但不明显，总体较基因转染细胞支架组稀疏，植骨区特别是中间部位硬度下降明显；支架组移植区后骨膜覆盖完整，术区剖面有结缔组织，结缔组织内可见部分支架材料松散存在，口腔探针刺探植骨区硬度广泛明显降低；磷酸三钙组移植区后骨膜覆盖完整，口腔探针刺探植骨区硬度与周围正常骨一致，但修复区明显隆起突出，表面光滑连续，硬度变化小。
2.2 各组组织学观察结果 基因转染细胞支架组术后4周苏木精-伊红染色见移植区同种异体骨有部分吸收，周围充满纤维结缔组织，手术结合区有成软骨样结构及成骨样细胞出现，同种异体骨周围多有破骨样细胞围绕，中央区同种异体骨内开始出现骨小梁结构，内有成骨样细胞圈状排列；至8，12 周，移植区内新骨形成进一步增多，同种异体骨孔洞内成骨样细胞分泌的成骨基质逐渐连接成片，部分区域新骨逐渐改建成熟。同种异体骨材料吸收明显，其吸收后的间隙由新生骨所取代，同种异体骨内及周围组织未见炎性细胞浸润，见图4。

4周末，细胞支架组手术结合区出现成软骨样结构和成软骨样细胞，但中央区为死骨结构，支架材料内充有纤维结缔组织，但较基因转染细胞支架组稀疏，术区少有破骨样细胞，随时间点迁移，至8，12周有支架骨材料降解，无其他明显骨改建，见图5。4周末支架组、磷酸三钙组主要为死骨结构，手术结合区有成软骨样细胞及结构，术区材料周围有成纤维细胞包绕，细胞成分单一，至8，12周末基本无明显骨改建，见图6，7。

2.3 各组免疫组织化学观察结果 见图8，9。

基因转染细胞支架组：术后4周末可见中等量骨涎蛋白及Ⅰ型胶原阳性染色的细胞间质，染色部位呈现棕黄色，支架骨与正常骨交界区阳性染色较多，且以围绕支架材料周围为多，支架材料周围可见多核的破骨样细胞，随时间点推移，支架材料面积有逐渐减小的趋势，周围可见成骨样细胞增多，骨基质中骨涎蛋白及Ⅰ型胶原含量增多，阳性范围明显增加，以致棕黄色染色连成片状布满视野，见图8A、图9A。

细胞支架组：术后4周植入区内可见少量骨涎蛋白及Ⅰ型胶原阳性染色的细胞间质，阳性表达分布范围较分散，呈零星状，多在支架骨与正常骨界面区和支架骨周围，成骨样细胞少见，支架骨孔洞内有纤维组织，且未能填满孔洞，随时间点推移，阳性染色范围略有增加，周围可见成骨样细胞增多呈圈状包绕，见图8B，图9B。

支架组：术后各时间点骨涎蛋白及Ⅰ型胶原表达情况与细胞支架组类似，但支架骨孔洞内纤维组织与周围骨片不连续，周围基本无成骨样细胞及破骨样细胞，见图8C，图9C。

磷酸三钙组：术后各时间点骨涎蛋白及Ⅰ型胶原表达情况与支架组类似，中央区可见未降解的无活性样β-磷酸三钙材料，见图8D，图9D。

2.4 免疫组织化学统计分析参照Francisco等^[10]的方法，利用LEICA DM 3000数码显微镜摄取图像，先在显微镜下仔细观察每一片的表达情况，选表达阳性标本进行测量。每张切片随机选取5个400倍光学显微镜下视野。为获得具有可比性的吸光度值，在采集图像时选择相同的光源、光圈大小、亮度、对比度、色彩饱和度、增益及锐度等条件。

将图像信息传输到Image Pro Plus 6.0专业图像分析软件，选择平均吸光度值作为参考指标。平均吸光度值即所选范围内的所有象素点灰度值的平均，代表该标本的表达强度，平均吸光度值越大则阳性染色越强^[11]。对4组免疫组织化学阳性的表达进行显微图像分析，结果见表1，2。由表可看出骨涎蛋白及Ⅰ型胶原阳性表达的平均吸光度值在各组中随时间推移略有增加，基因转染细胞支架组两项指标平均吸光度值均明显高于其他各组 (P < 0.05)，但其自身在时间上并无统计学差异。细胞支架组、支架组及磷酸三钙组3组之间均差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

材料方法

设计：观察性实验。

时间及地点：细胞培养实验于2012年4至6月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心细胞生物学实验室完成，动物实验于2012年6至12月在新疆医科大学第一附属医院动物实验中心完成。

材料：

实验动物和骨源：6月龄雄性新疆阿勒泰大尾绵羊1只，体质量11 kg，供提取及培养骨髓间充质干细胞所用；成年健康新疆阿勒泰大尾绵羊9只，雌雄不拘，12月龄，体质量(33.0±1.5) kg，单独圈养于新疆医科大学动物中心。经bFGF转染的骨髓间充质干细胞复合同种异体支架骨、β-磷酸三钙及同种异体支架骨材料由新疆医科大学第一附属医院口腔修复科提供。

实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》^[5]。

基因转染骨髓间充质干细胞复合同种异体骨修复绵羊极限骨缺损实验的主要实验试剂及仪器：

实验方法：

骨髓间充质干细胞的培养^[6]：取6月龄新疆阿勒泰大尾绵羊，髂骨区备皮，碘伏消毒皮肤，选16号骨穿针进行穿刺，抽取约30 mL骨髓血，以体积1∶5比例加入3%肝素钠内不间断颠倒混匀，迅速放入超净台，将骨髓血用无菌滤网过滤至50 mL离心管内，再以体积1∶1与DMEM-F12培养基(含1%青-链霉素、2.38 g/L Hepas、0.6 g/L L-谷氨酰胺、0.05-0.06 g/L抗坏血酸及体积分数10%胎牛血清)共4-6 mL，在25 cm²细胞培养瓶内进行全骨髓培养法，放入37 ℃、体积分数5%CO₂恒温孵育箱内培养，每二三天进行半换液，直到血红细胞基本被培养基替代，镜下观察即可见细胞贴壁生长，大小不一，呈短梭形、多角形及不规则形，此后每二三天全换液，待细胞融合达90%-95%时，1∶2-1∶3传代或冻存，见图1。

骨髓间充质干细胞的诱导：第1代骨髓间充质干细胞培养5-7 d后，将培养液换成诱导培养基(DMEM-F12培养基中含1%青-链霉素，2.38 g/L Hepas、0.6 g/L L-谷氨酰胺、0.05-0.06 g/L L-抗坏血酸、2.16 g/L β-甘油磷酸钠、4 μg/L地塞米松及体积分数10%胎牛血清)。入 37 ℃、体积分数5%CO₂恒温孵育箱内培养，每二三天换液，待细胞融合达90%-95%时，1∶2-1∶3传代至第3代，细胞呈长梭形，形态较均一，排列旋涡状，生长旺盛，冻存备用，见图2。

构建bFGF慢病毒载体：参照本课题组前期实验方法^[7]，复苏293-FT细胞，二三天传代，传代3次后，接种于6孔板，待细胞生长达90%-95%融合时即可开始转染bFGF基因质粒，转染293-FT细胞48 h后收集慢病毒上清1 mL/冻存管，-80 ℃ 冻存备用。采用课题组前期转染方法用慢病毒液转染骨髓间充质干细胞^[8]。①转染前1 d，消化诱导培养第3代羊骨髓间充质干细胞并计数，1×10⁷L^-1的细胞浓度接种入6孔板，孵育过夜。②转染当天，每细胞孔中加入1 mL病毒液，再加入10 mg/L Polybrene，孵育过夜。③第3天，全换液，37 ℃，体积分数5%CO₂潮湿的孵箱孵育过夜。④第4天，用含 5 mg/L Blasticidin的培养基全换液，孵育过夜；以后每三四天换1次液(含Blasticidin的培养液)。⑤第14-16天，经10-12 d的Blasticidin压力筛选后，可见数个大小不等的、分散的细胞团块。

羊松质骨支架材料与骨髓间充质干细胞的复合培养：参照本课题组前期实验方法^[9]，无菌条件下将准备好的羊松质骨材料置于6孔板中，加入适量DMEM/F12培养液预湿12 h，将培养液吸干弃去。分2组，每组2块支架，每块1孔，共4孔。调整细胞悬液浓度为1×10¹⁰L^-1，于超净台内向每块支架缓慢滴加细胞悬液100 μL，置 37 ℃，体积分数为5% CO₂饱和湿度孵箱内孵育。2 h后将6孔板取出，于超净台内沿6孔板壁缓慢加入DMEM/F12培养液3 mL，放入培养箱中培养。每日倒置相差显微镜观察材料周围和孔隙内细胞形态、生长情况；复合培养后第7天扫描电子显微镜观察细胞在材料表面的黏附、生长、增殖和基质分泌情况。

实验动物模型建立：实验前将9只阿勒泰大尾羊单独圈养并禁食24 h，3%戊巴比妥钠0.005-0.02 mg/kg耳缘静脉推注麻醉，在双侧髂骨区备皮，常规消毒后，由皮依次分层至髂骨骨膜，翻开骨膜，在其外侧用牙科慢速机制备15 mm(长)×10 mm(宽)×10 mm(高)大小骨缺损(预实验3个月末已证实此范围缺损无法自行成骨修复，正式实验不再重复，未设空白组)，用生理盐水冲洗去除骨碎屑后随机均分成3组，均于左侧植入bFGF+骨髓间充质干细胞(1×10¹⁰ L^-1)+同种异体骨作为基因转染细胞支架组，于其中3只右侧植入骨髓间充质干细胞(1×10¹⁰L^-1)+同种异体骨作为细胞支架组，另3只右侧植入β-磷酸三钙作为磷酸三钙组，剩余3只右侧植入同种异体骨作为支架组，见图3。

等待缺损区血充盈，再将骨膜复位缝合，依次缝合术区。

免疫组织化学染色：每组动物于术后4，8，12周末各处死1只，分离出手术部位骨块(边界大于术区)，去尽软组织，体积分数10%甲醛液固定24 h，进口脱钙液脱钙处理后常规脱水包埋，制成蜡块。选取各组蜡块进行组织切片，每组20张，置入60 ℃烤箱过夜，每例中取5张进行常规的苏木精-伊红染色，其他切片进行免疫组织化学染色，二甲苯处理，梯度乙醇脱水，自来水洗1次，蒸馏水洗3次，5 min/次，将切片放入装有体积分数3%H₂O₂的塑料盒内去除过氧化物酶，室温浸泡10 min，0.01 mol/L PBS洗3次，5 min/次。再将切片放入装有枸橼酸钠缓冲液的高压修复盒内，高温微波修复10 min，取出后自然冷却至室温，0.01 mol/L PBS浸洗3次， 5 min/次。

山羊血清封闭非特异性抗原37 ℃ 30 min， 0.01 mol/L PBS洗3次，5 min/次。分别用兔抗BSP抗体、兔抗Collagen Ⅰ抗体孵育切片，4 ℃冰箱过夜。用 0.01 mol/L PBS浸洗3次，5 min/次。滴加通用型二抗 37 ℃ 孵育30 min。用 0.01 mol/L PBS浸洗3次，5 min/次。显微镜下用新鲜配制的DAB液显色，待显色充分，及时用自来水终止显色。苏木精复染，盐酸乙醇分化，0.01 mol/L PBS返蓝。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

采用LEICA DM 3000数码显微镜采集图像进行观察分析，观察骨涎蛋白和Ⅰ型胶原的表达，摄取图像，用Image-Pro Plus分析软件进行图像分析。

主要观察指标：各组大体观察、组织学观察、免疫组织化学观察结果。

统计学分析：数据均以x(_)±s表示，由统计人员经SPSS 17.0统计软件进行处理，两组间比较用t 检验，多组间比较用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

传统骨移植方法修复大面积骨缺损存在着可获得的骨量有限、成形困难、排斥反应和供区并发症等缺陷。组织工程骨的应用为修复大面积骨缺损带来新的希望。Schmitz等^[12]最早定义骨极限缺损的概念，即指在特定的骨骼上所造成的终生不能自行修复并愈合的最小缺损。他们首先建立了大鼠、兔和狗颅骨极限缺损模型，已被大量应用于测量评价各种骨替代材料的修复效果。实验采用Schmitz的标准，采用转染bFGF基因的骨髓间充质干细胞复合支架材料构建组织工程骨，通过骨传导作用、骨生成作用、骨诱导作用修复髂骨极限缺损^[13]。

bFGF是促进细胞生长作用很强的多肽因子，它是骨组织工程中信号调节因子之一，对骨组织的损伤有修复作用。成骨细胞胞膜表面存在bFGF受体，成骨细胞合成的bFGF以自分泌或旁分泌形式释放到胞外与受体结合，可促进骨原细胞分化为成骨细胞，诱导成骨细胞分裂、增殖，并促使其合成骨基质、钙结合蛋白及含有羟基磷灰石颗粒的基质小泡，加快基质钙化。bFGF可促进成软骨细胞增殖，并合成Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原，加速骨折端软骨形成。同时bFGF也是一种强大的促血管生长因子，刺激血管内皮细胞增殖和迁移，诱导内皮细胞长入胶原基质中，并形成与毛细血管相似的管腔，对血管的爬入支架内起到了促进作用^[14]。

许多体内外实验均表明外源性植入碱性成纤维细胞生长因子能明显促进骨形成过程^[15-16]，但是外源性碱性成纤维细胞生长因子在体内易降解，影响疗效。因此实验用分子生物学技术，用慢病毒载体携带bFGF基因转染骨髓间充质干细胞，为成骨修复提供成骨潜能细胞，且提供生长因子基因诱导其分化成骨，增强成骨活性，最后复合具有桥梁支架作用的同种异体骨修复骨缺损，产生更强大的骨诱导能力、更稳定的物理性能及良好的生物相容性，最终促进机体成骨修复。李春明等^[17]利用bFGF基因转染犬骨髓间充质干细胞组织工程骨预构复合体+种植体修复犬颌骨极限骨缺损，通过实验发现种植体复合bFGF基因转染的犬骨髓间充质干细胞(或未转染骨髓间充质干细胞)都能够良好地修复颌骨缺损，并能够使种植体与组织工程骨形成良好的骨结合。这些利用骨组织工程技术，特别是基因转染技术的复合组织工程骨，成为近几年修复大面积骨缺损研究、应用发展的前沿。

骨涎蛋白是由成骨细胞、破骨细胞和成齿细胞合成的磷酸化糖蛋白，主要分布于矿化的胶原基质如骨、牙本质、牙骨质和生长期的钙化软骨以及含有矿化区的软组织中^[8]。骨涎蛋白是骨新陈代谢的标志物, 能激活成骨细胞、成骨样细胞，可优先与Ⅰ型胶原的α-2链相连结，形成羟基磷灰石结晶晶核，引导矿化的形成。在新形成骨及骨再建活跃部位高表达，骨涎蛋白在未成熟成骨细胞的前体细胞中不表达，分化的早期短暂表达，后来在分化成熟的成骨细胞中表达量明显增加。

骨涎蛋白在血管形成过程中也起着重要作用。新生毛细血管的血管内皮细胞表面可表达αvβ3 整合素受体，该受体可识别骨涎蛋白的C末端RGD序列。骨形成初期是无血管的软骨，软骨在生长期间需血管长入及成骨细胞与破骨细胞的参入才能转变成骨。软骨细胞和成骨细胞可表达血管形成分子如骨涎蛋白,它可在骨基质钙化中支持血管的长入。研究证实骨涎蛋白参与骨的早期形成，通过电子显微镜在早期矿化沉积物中观察到骨涎蛋白。所以在骨形成过程中的血管生长入骨，骨涎蛋白起着重要的支持作用^[18]。李景辉等^[19]用人恒牙牙髓干细胞诱导培养至第3代，接种到三维明胶支架上进行成骨向诱导培养，诱导14 d后植入裸鼠背部皮下，通过免疫组织化学方法检测骨涎蛋白的表达等验证其成骨效果。

Ⅰ型胶原由成骨细胞以原胶，原的形式分泌，骨基质 90%由Ⅰ型胶原构成，Ⅰ型胶原纤维间通过特殊的共价键相互组合，为钙盐沉积提供基础。有研究发现，高水平的Ⅰ型胶原 mRNA表达反映了成骨细胞的大量形成^[20]。Ⅰ型胶原对维持骨结构的完整及骨生物力学特性，防止骨的变形和断裂起着非常重要的作用，它决定着骨的韧性，进而影响骨的强度^[21]。郑瑜谦等^[22]用冻存的Beagle犬骨髓基质细胞复合胶原膜植入裸鼠体内4周后，用免疫组织化学方法检测Ⅰ型胶原的表达等，结果表明冻存骨髓基质细胞复苏后进行体外培养扩增与诱导分化，并在体内环境下复合胶原支架材料，仍然具有较强成骨能力。

因此，作者通过实验大体观察、组织学观察、免疫组织化学观察及统计学分析认为，β-磷酸三钙材料在观察期内硬度下降较小，在手术结合区有成软骨样结构及成骨样细胞出现，但术区材料降解少，孔洞内虽有部分纤维组织充填，但不能与材料连续，术区中央呈现死骨样结构，无法完全修复髂骨极限缺损；同种异体支架骨材料在观察期内硬度下降较大，在手术结合区有成软骨样结构及成骨样细胞出现，术区材料降解多但新骨形成很少，支架孔洞内部分填充有纤维组织，但不能充满，术区中央呈现死骨样结构，无法完全修复髂骨极限缺损；骨髓间充质干细胞+支架材料在观察期内硬度基本无变化，术区结合部的成软骨样结构和成骨样细胞比前两组有所增加，术区的新骨形成也增多，但术区中央仍无法大范围成骨及纤维血管化，无法完全修复髂骨极限缺损；转染bFGF基因的骨髓间充质干细胞复合支架材料在观察期内硬度基本无变化，高度与周围正常组织一致，手术结合区成软骨样结构较多，术区中央可见大量成骨样细胞，整个术区的支架材料降解较其他组多，支架材料孔洞内爬满纤维结缔组织，材料周围常见破骨样细胞。通过免疫组织化学观察到骨涎蛋白与Ⅰ型胶原在基因转染细胞支架组中的阳性表达程度明显高于其他组，且随着成骨细胞的分化成熟及新骨的形成，阳性表达程度增加，呈正相关性。骨涎蛋白与Ⅰ型胶原在细胞支架组、支架组、磷酸三钙组中的阳性表达程度均明显低于基因转染细胞支架组，各组间略有差异。免疫组织化学进一步证明经过bFGF基因转染的骨髓间充质干细胞复合支架材料能够基本修复髂骨极限缺损，达到了研究目的，为当今热门的骨组织工程及较少的大型动物骨极限缺损实验提供有价值的实验数据。

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作者通过实验大体观察、组织学观察、免疫组织化学观察及统计学分析认为，β-磷酸三钙材料在观察期内硬度下降较小，在手术结合区有成软骨样结构及成骨样细胞出现，但术区材料降解少，孔洞内虽有部分纤维组织充填，但不能与材料连续，术区中央呈现死骨样结构，无法完全修复髂骨极限缺损；同种异体支架骨材料在观察期内硬度下降较大，在手术结合区有成软骨样结构及成骨样细胞出现，术区材料降解多但新骨形成很少，支架孔洞内部分填充有纤维组织，但不能充满，术区中央呈现死骨样结构，无法完全修复髂骨极限缺损；骨髓间充质干细胞+支架材料在观察期内硬度基本无变化，术区结合部的成软骨样结构和成骨样细胞比前两组有所增加，术区的新骨形成也增多，但术区中央仍无法大范围成骨及纤维血管化，无法完全修复髂骨极限缺损；转染碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞复合支架材料在观察期内硬度基本无变化，高度与周围正常组织一致，手术结合区成软骨样结构较多，术区中央可见大量成骨样细胞，整个术区的支架材料降解较其他组多，支架材料孔洞内爬满纤维结缔组织，材料周围常见破骨样细胞。通过免疫组织化学观察到骨涎蛋白与I 型胶原在基因转染细胞支架组中的阳性表达程度明显高于其他组，且随着成骨细胞的分化成熟及新骨的形成，阳性表达程度增加，呈正相关性。骨涎蛋白与I 型胶原在细胞支架组、支架组、磷酸三钙组中的阳性表达程度均明显低于基因转染细胞支架组，各组间略有差异。免疫组织化学进一步证明经过碱性成纤维细胞生长因子基因转染的骨髓间充质干细胞复合支架材料能够基本修复髂骨极限缺损，达到了研究目的，为当今热门的骨组织工程，较少的大型动物骨极限缺损实验提供有价值的实验数据。

作者贡献：王小志、何惠宇进行实验设计，实验实施为王小志、杨楠、杨泽辉，实验评估为胡杨，资料收集为王小志，王小志成文，何惠宇审校，王小志对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。
学术术语：骨涎蛋白-是由成骨细胞、破骨细胞和成齿细胞合成的磷酸化糖蛋白，主要分布于矿化的胶原基质如骨、牙本质、牙骨质和生长期的钙化软骨，以及含有矿化区的软组织中。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

基因转染骨髓间充质干细胞复合同种异体骨修复绵羊极限骨缺损

Gene-transfected bone marrow mesenchymal stem cells combined with allogeneic bone for repair of sheep critical-size bone defects

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