梯度掺锶羟基磷灰石骨水泥的体外细胞生物学性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.47.002

摘要/Abstract

摘要：

背景：锶掺入羟基磷灰石骨水泥后可以改善材料的结晶性和相容性，但产生的细胞毒性以及对细胞表面黏附、增殖和表达的影响还需要深入研究。
目的：观察梯度掺锶羟基磷灰石骨水泥的体外细胞生物学性能。
方法：制备4组羟基磷灰石骨水泥试样，分别编为0%，1%，5%和10%掺锶羟基磷灰石骨水泥，每组取6个平行试样紫外线照射灭菌3 h备用。浸提递质为含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液。按照掺锶羟基磷灰石骨水泥粉末质量∶浸提液=1 g∶10 mL比例配制。选用L-929成纤维细胞和幼兔成骨细胞，对成骨细胞进行鉴定。扫描电镜观察幼兔成骨细胞在梯度掺锶羟基磷灰石骨水泥表面的黏附和增殖情况，细胞的表达情况采用碱性磷酸酶活性检测法检测。
结果与结论：①不同掺锶量羟基磷灰石骨水泥的细胞毒性评级均为0或1级，各试样的细胞毒性与其掺锶量、作用时间、浸提液浓度有一定关联性。②适量锶元素的加入可以促进成骨细胞的黏附、增殖及表达，改善材料的溶解动力学，提高其生物降解性，更加符合临床要求。但目前尚缺乏有关的远期实验结果。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 羟基磷灰石骨水泥, 锶, 生物相容性, 稳定性, 成骨细胞, 生物降解, 骨传导, 骨诱导

Abstract:

BACKGROUND: Strontium-containing hydroxyapatite bone cement can improve the crystallinity and compatibility of the materials, but the effects on cell toxicity, cell surface adhesion, proliferation and expression still need further studies.
OBJECTIVE: To observe the in vitro cytobiological properties of gradient strontium-containing hydroxyapatite bone cement.
METHODS: Four groups of strontium-containing hydroxyapatite bone cement samples were prepared at a strontium content of 0%, 1%, 5% and 10%. Six parallel samples selected from each group were subjected to ultraviolet radiation sterilization for 3 hours for standby. Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing 10% fetal bovine serum served as extraction neurotransmitter. Strontium-containing hydroxyapatite cement powder was mixed with extract solution at a ratio of 1 g to 10 mL. L-929 fibroblasts and osteoblasts from immature rabbits were selected and identified. Scanning electron microscopy was used to observe the adhesion and proliferation of osteoblasts on the surface of gradient strontium-containing hydroxyapatite cement, and cell viability was detected using alkaline phosphatase activity method.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Cytotoxicity of different amount of strontium-containing hydroxyapatite cement was graded 0 or 1, suggesting the cytotoxicity of each sample was certainly associated with strontium content, reaction time, and extract concentration. (2) Hydroxyapatite bone cement containing a certain amount of strontium can promote osteoblast adhesion, proliferation and expression and improve the dissolution kinetics and biodegradability of materials, becoming more in line with the clinical requirements. But there is still lack of long-term results.

Key words: hydroxyapatites, strontium, biocompatible materials, osteoblasts, biodegradation, environmental

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

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引言

材料方法

设计：体外细胞学实验。

材料：选择出生1个月的新西兰幼兔1只，由解放军第四军医大学口腔动物中心提供，雄性，体质量0.3 kg。

方法：

掺锶羟基磷灰石骨水泥样品制备：实验试样是掺锶羟基磷灰石骨水泥水化产物，来源于西安交通大学金属材料强度国家重点实验室生物材料课题组，为白色块体和粉末(过100目ASTM筛)。

细胞培养：选用两种细胞，生长旺盛的L-929成纤维细胞和幼兔成骨细胞。

L-929成纤维细胞：小鼠成纤维细胞由解放军第四军医大学口腔医学院生物学教研室提供。用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液培养，2.5 g/L胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中止消化，稀释，将细胞按浓度1×10⁷ L^-1接种到96孔板中，每孔重复5遍，共接种细胞悬200 μL。

幼兔成骨细胞：选择出生1个月的新西兰幼兔1只。消毒后颈椎脱臼法处死，取四肢浸于75%乙醇溶液 5 min消毒后移入超净台。取四肢长骨骨髓细胞，用DMEM培养液冲洗骨髓腔，取上清进行培养，培养液为含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，待细胞汇合成单层后，2.5 g/L的胰蛋白酶常规消化、传代。将传代细胞加入条件培养基(DMEM完全培养基中加入地塞米松1×10^-8mol/L，β-甘油磷酸钠10 mmol/L、维生素C 50 mg/L)继续培养，使骨髓基质细胞转化为成骨细胞。将细胞按浓度1×10⁷ L^-1接种到96孔板中，每孔接种细胞悬液200 μL，重复5遍。

成骨细胞的鉴定：将第3代幼兔成骨细胞继续诱导培养，倒置相差显微镜观察细胞生长状况，待镜下观察出现钙结节后再换液一两次即可弃取培养液，体积分数95%乙醇固定30 min，PBS漂洗，茜素红染色。滴加40 mmol/L茜素红染液30 min，常规脱水，透明，封固，显微镜下观察。

L-929成纤维细胞和幼兔成骨细胞检测梯度掺锶羟基磷灰石骨水泥的细胞毒性：

浸提液的制备：将制备的4组水泥试样烘干，一部分为白色片状，直径10 mm，厚度2 mm，另一部分研磨成白色粉状，分别编为0%掺锶羟基磷灰石骨水泥、1%掺锶羟基磷灰石骨水泥、5%掺锶羟基磷灰石骨水泥和10%掺锶羟基磷灰石骨水泥，每组取6个平行试样紫外线照射灭菌3 h备用。浸提递质为含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液(新鲜配制，pH=7.2)。按照掺锶羟基磷灰石骨水泥粉末质量∶浸提液=1 g∶10 mL比例来配制，37 ℃，体积分数5% CO₂饱和湿度孵箱中浸提 48 h待用。

浸提液作用培养细胞：将浸提液按1 000，500，250，100 g/L浓度稀释，阳性对照为6.4 mL/L 苯酚，阴性对照为细胞培养液。细胞贴壁24 h后，移去上清。取浸提液及苯酚、细胞培养液分别加入96孔板中，每孔200 μL， 37 ℃，体积分数5% CO₂环境中培养。

四唑盐比色法：细胞培养1，3，5 d后，取浸提液与细胞作用的培养板，每孔加入四唑盐溶液(5 g/L) 20 μL，37 ℃，体积分数5% CO₂饱和湿度环境下继续孵育4 h，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入DMSO 150 μL，震荡10 min，酶联免疫检测仪570 nm波长下测定各孔光吸收值(A值，用单纯培养液调零)，取平均值。计算细胞相对增殖率。

按GB/T16886.5-2003/ISO 10993-5:1999规定的6级毒性分级法确定材料毒性并进行形态学观察。

幼兔成骨细胞在梯度掺锶羟基磷灰石骨水泥表面的黏附、增殖与表达：通过相差显微镜，扫描电镜观察幼兔成骨细胞在梯度掺锶羟基磷灰石骨水泥表面的黏附情况，增殖情况可参考四唑盐比色法检测的细胞相对增殖率。幼兔成骨细胞的表达采用碱性磷酸酶活性检测法检测。

材料的制备及细胞接种：将材料制成大小为4 mm× 4 mm×2 mm的圆片状，超声波清洗后烘干、灭菌，DMEM完全培养基预湿备用。将第3代幼兔成骨细胞(种植密度5×10⁴/孔)种植后置于6孔板培养皿培养。以不加材料、放置盖玻片后种植的成骨细胞作为对照，并对此5组分别进行相差显微镜及扫描电镜观察。另将第3代幼兔成骨细胞(种植密度5×10⁴/孔)与4种材料复合置于24孔板中培养作为实验组，以单独培养的成骨细胞作为对照，对此5组进行细胞增殖与碱性磷酸酶活性检测。

培养细胞的形态学观察：①相差显微镜观察：通过相差显微镜逐日观察幼兔成骨细胞在梯度掺锶羟基磷灰石骨水泥材料表面以及边缘细胞的黏附和生长情况。②扫描电镜观察：成骨细胞/材料复合后第5天取出，用体积分数为2.5%冷戊二醛固定、系列丙酮脱水、乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金后扫描电镜观察。

碱性磷酸酶活性检测法：采用碱性磷酸酶测定试剂盒，按照测定孔、标准孔、空白孔分组，测定孔中加入浸提液5 μL，标准孔加入0.1 g/L 酚标准液5 μL，空白孔加入双蒸水5 μL。再分别加入缓冲液50 μL，基质液 50 μL，充分混匀后，37℃水浴15 min，再分别加入显色剂150 μL，立即混匀，应用酶联免疫检测仪520 nm波长下测定各孔光的吸收值(A值，用空白管调0)。

讨论

对于生物材料进行细胞毒性研究是检测材料生物相容性的一项基本内容。体外细胞培养法具有简捷、快速、灵敏、重复性好等优点。1983年，美国学者Mosman首次报道四唑盐比色法以后，此方法已经广泛应用于肿瘤学、免疫学研究及医用材料的生物学相容性评价。四唑盐比色法简便易行，灵敏度高，结果客观且可重复性高。所以，文章实验采用四唑盐比色法检测骨髓基质细胞的增殖度，可以准确、快速、灵敏的反映细胞增殖程度和细胞毒性程度。实验首先选用GB/T16886.5-2003/ISO 10993- 5:1999推荐的L-929成纤维细胞对掺锶0%、1%、5%及10%的掺锶羟基磷灰石骨水泥浸提液进行细胞毒性研究^[7]，结果发现不同掺锶量羟基磷灰石骨水泥的细胞毒性评级均为0或1级，掺锶羟基磷灰石骨水泥无细胞毒性，各组之间细胞毒性差异无显著性意义(P < 0.05)。文章所得结论较文献^[8]中讨论的不同掺锶量磷灰石的细胞毒性相类似。文章中毒性为0级即细胞相对增殖率≥100的浸提液数量较多，说明仿生理条件下形成的掺锶羟基磷灰石骨水泥产物细胞毒性低。骨水泥最终是要应用于骨缺损修复，浸提液与植入部位的主要功能细胞作用，还可以反映材料对成骨细胞增殖、分化等功能的影响^[9]。郭永锦^[10]研究发现添加适量的碳酸锶、淀粉磷酸酯后可以改善骨水泥的生物溶解性能，骨水泥系统可作为生物活性物质的缓释载体，改性后的骨水泥生物材料具有良好的细胞学相容性。

文章实验对兔骨髓基质细胞诱导后，部分细胞与材料复合，检测其在材料表面的黏附与增殖能力，余留细胞继续培养来了解植入体内的细胞是否具有成骨性能。结果余留的细胞2周后出现大量钙结节，证实了与材料复合的细胞为成骨细胞，保持了其成骨表型。钙结节又称矿化结节，是成骨细胞在体外培养时形成矿化的细胞外基质，是成骨细胞分化的最后阶段。钙结节的形成包括胶原的沉积和基质的矿化两个步骤^[11]。在普通DMEM培养液中加入地塞米松和β-甘油磷酸钠对成骨细胞进行诱导，约2周后(即体外培养共约3周时间后)即会出现钙结节。对钙结节的观察鉴定可采用茜素红染色法^[12]。Coelho等^[13]对α-MEM培养液下形成的钙结节进行能谱分析，结果发现钙元素含量最多，其次为磷，此外，还有氧、碳、钠和镁等元素。其中钙磷比例约为2∶1。

碱性磷酸酶是成熟成骨细胞的标志性酶之一，在体外钙化中起着关键作用，即没有碱性磷酸酶活力，钙化就不会发生，其主要机制在于碱性磷酸酶能够水解有机磷酸酶，使局部PO4^3-浓度升高，并可破坏钙化抑制剂，从而启动钙化。文章实验提示5%、10%掺锶羟基磷灰石骨水泥表面成骨细胞碱性磷酸酶活性较高。对碱性磷酸酶活性的检测是鉴定成骨细胞和评价其功能活性的重要指标之一。掺锶羟基磷灰石骨水泥浸提液作用于成骨细胞的实验中可以看到其细胞毒性评级也为0-1级，掺锶羟基磷灰石骨水泥无成骨细胞毒性，各组之间细胞毒性差异无显著性意义(P < 0.05)。分析发现随着浸提液浓度升高、作用时间延长，细胞毒性似有增大的趋势，但统计学分析显示并无明显相关性。材料的细胞毒性与掺锶量呈现出一种5%掺锶羟基磷灰石骨水泥<10%掺锶羟基磷灰石骨水泥≈1%掺锶羟基磷灰石骨水泥< 0%掺锶羟基磷灰石骨水泥趋势，即5%掺锶羟基磷灰石骨水泥细胞毒性最低，0%掺锶羟基磷灰石骨水泥细胞毒性相对略高，差异并无显著性意义。李峰^[14]对新型含锶磷酸钙骨水泥的物理性能、肌肉内降解性能、骨组织中长期反应性及生物相容性进行研究，发现锶含量对骨水泥的抗压强度没有明显影响，不同含锶骨水泥初凝时间3.5-7.5 min，终凝时间9.0-14.5 min。含锶磷酸钙骨水泥材料细胞毒性评级为0级或1级，随着掺锶量的增加其细胞毒性有略微增大的趋势^[15]。对含锶磷酸钙骨水泥分别进行急性毒性试验、热原试验等，发现含锶磷酸钙骨水泥无毒，无热原性，植入兔肌肉和骨内后逐渐降解。可见，含锶磷酸钙骨水泥材料具有良好的生物相容性^[16]。

综合分析幼兔成骨细胞在梯度掺锶羟基磷灰石骨水泥表面黏附、增殖与表达实验结果，可知成骨细胞在不同骨水泥材料表面均有黏附、增殖及表达，但程度有所不同。5%、10%掺锶羟基磷灰石骨水泥更加适合成骨细胞的黏附与增殖，碱性磷酸酶表达也加明显，两者镜下差异不明显。0%、1%掺锶羟基磷灰石骨水泥表面成骨细胞黏附较少，增殖不活跃。电镜照片显示5%、10%掺锶羟基磷灰石骨水泥材料表面较多的陷窝、小颗粒提示细胞数量多，材料溶解、破坏重，提示加入5%-10%锶以改善羟基磷灰石骨水泥的溶解动力学，提高生物降解性。这些结果表示掺锶量不仅是调控掺锶羟基磷灰石骨水泥理化性能的关键，而且也是影响体外细胞生物学性能的重要因素。但目前尚缺乏有关的远期实验结果。

国内关于骨水泥中掺锶的研究并不多，叶冬平等^[17]研究一种新型可注射可降解磷酸钙骨水泥的理化性能，发现添加改性淀粉显著的改善了骨水泥的抗溃散性，随着骨水泥液固比的增大，骨水泥的抗压强度下降。骨水泥的水化产物为类骨羟基磷灰石结晶，从X射线衍射图谱还可以看出，因骨水泥的水化不完全，基线水平波动较大，说明在充分水化的条件下，骨水泥的压缩强度还能进一步提高。可注射含锶复合胶原磷酸钙骨水泥符合人体生物力学强度，能满足手术条件要求。王华等^[18]测试发现含锶羟基磷灰石骨水泥强化动力髋螺钉内固定股骨转子间骨折的极限载荷高于单纯动力髋螺钉内固定的极限载荷，差异有显著性意义(P < 0.05)。倪国新等^[19]将含锶羟基磷灰石生物活性骨水泥应用于髋关节置换治疗，并与聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥进行比较及评价，发现含锶羟基磷灰石生物活性骨水泥断裂韧度高于聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥，含锶羟基磷灰石生物活性骨水泥能与骨形成骨性融合，其与骨界面的剪切力明显大于聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥，具有替代聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥应用于髋关节置换的潜力。邝冠明等^[20]研究单侧和双侧球囊扩张注射生物活性锶羟基磷灰石骨水泥行椎体后凸成形术对骨折椎体模型的高度和生物力学性能的修复，在单侧组和双侧组平均注入3.07 mL和5.82 mL生物活性锶羟基磷灰石骨水泥，治疗后椎体各部位的高度均有所增加，两组椎体强化后的刚度双侧组较单侧组刚度修复效果好。可见，单侧或双侧注射生物活性锶羟基磷灰石骨水泥行球囊扩张椎体后凸成形术均能修复骨折椎体模型的高度和生物力学性能。小结：①不同掺锶量羟基磷灰石骨水泥的细胞毒性评级均为0或1级，各试样的细胞毒性与其掺锶量、作用时间、浸提液浓度有一定关联性。②适量锶元素的加入可以促进成骨细胞的黏附、增殖及表达，改善材料溶解动力学，提高生物降解性。但目前尚缺乏有关的远期实验结果。