2.1  灭菌效果检测  通过LB固体培养基定性的方法评估灭菌效果。菌落的缺失是评估灭菌的一个重要标准。对照组菌落迅速在LB琼脂表面萌发，在18 h内形成大面积的菌落；1%抗生素组在37 ℃环境下培养24 h也可见大量菌落生成；体积分数75%乙醇和氯己定能够完全杀死所有微生物，LB固体琼脂表面未见菌落生成，见图1。表明体积分数75%乙醇和氯己定处理24 h符合灭菌要求。

2.2  牛心包组织形态学观察结果  各组的牛心包VB染色见图2。牛心包主要以胶原纤维为主，弹性纤维含量较少。体积分数75%乙醇、氯己定和1%抗生素处理过的牛心包胶原纤维呈波浪状排列整齐，结构紧凑，弹性纤维含量较少但结构清晰，未见纤维断裂和排列混乱，与对照组新鲜的牛心包组织结构形态基本一致。因此，体积分数75%乙醇和氯己定处理24 h符合牛心包灭菌要求，并且最大程度地保留了心包组织结构的完整性。

2.3  心包抽提液细胞毒性检测结果  各组细胞存活率见表1。与培养24 h比较，培养48，72 h的L929细胞活性普遍升高；相同培养时间下与对照组比较，1%抗生素组和75%乙醇组的心包抽提液对L929细胞活性无影响；氯己定组的细胞存活率接近于0，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.0001)，见图3。说明经氯己定灭菌处理的牛心包抽提液具有较强的细胞毒性，会导致细胞完全死亡。而体积分数75%乙醇处理的牛心包抽提液无细胞毒性，连续3 d的细胞存活率都大于100%。

2.4  体外直接接触毒性实验结果  接种细胞24，48 h，显微镜下可见脱细胞支架周边爬满了扁平状内皮细胞，细胞形态正常，支架周边未出现细胞死亡现象，见图4。说明人脐静脉内皮细胞与牛心包脱细胞支架具有很好的生物相容性。

2.5  牛心包脱细胞支架内皮化实验结果  在长达20 d的细胞种植周期内，牛心包脱细胞支架内皮细胞化最初出现在第6天，零星可见人脐静脉内皮细胞附着在支架表层；第8-12天脱细胞牛心包支架表面黏附的细胞最多，直到第20天支架表层依然黏附较多的人脐静脉内皮细胞，但是细胞数量较前有所减少，见图5。通过实验结果可知，体外牛心包脱细胞支架表面人脐静脉内皮细胞内皮化的最佳时间点为种植的第8-12天。说明体积分数75%乙醇能使牛心包达到无菌要求且不影响支架的内皮细胞化效果。

组织工程材料的研发从根本上解决人体组织器官缺损导致的功能障碍，寻找一种人体组织器官的生物替代物，如心包已被广泛应用于心脏瓣膜的生物瓣和心血管外科补片^[1]。基于支架的组织工程是一个热点研究方向，它涉及了在模拟天然细胞外基质环境中接种和培养特定类型的细胞^[2]。近10年来，心脏瓣膜、膀胱、真皮、软骨、小肠等脱细胞生物材料受到了广泛关注^[3-8]。组织工程产品应用于临床首先必须无菌。灭菌被定义为消灭所有形式微生物的过程，而消毒是指消除细菌孢子外的许多或所有致病性微生物的过程。目前医疗行业使用的灭菌方法包括高压灭菌、伽玛辐射和环氧乙烷。生物组织的蛋白质在相对较高温度下会发生变性，干热和高压蒸汽不能用来消毒心包。伽玛射线可以裂解生物材料的胶原肽键，降低了材料的抗拉强度，加速了材料的降解速率^[9]。尽管环氧乙烷是一种常用的气体杀菌剂，但其是一种有毒的致癌物质，残留的环氧乙烷在某些情况下是有害的。因此必须选择合适的灭菌方法，以确保安全并保持材料的性能。

组织工程支架的灭菌不仅是杀死微生物，也要注意维护材料的性能和结构。在含有蛋白质或生物制品的支架中，灭菌方法的选择更应慎重，因为存在变性的风险，并且会导致重要的支架生物活性降低或丧失^[10-12]。在这种情况下，认识到标准的灭菌方法(包括高压灭菌、环氧乙烷和高能辐照)并不特别适用于组织工程中使用的牛心包。牛心包是当前生物瓣膜最重要的生物原材料。作者在国家重点研发计划资助的心脏组织工程支架研究工作中也发现，新鲜的牛心包易被微生物不同程度的污染，对牛心包的灭菌同样也是组织工程支架材料研发的关键之一。到目前为止，关于组织工程支架研究中牛心包灭菌方法的报道很少。实验探究使用体积分数75%乙醇作为牛心包化学灭菌剂的可行性，并将其与临床杀菌抗生素和氯己定进行了比较，另外还评估了灭菌过程对心包性能的影响，包括组织结构完整性和生物相容性，为类似科研工作提供一个可参考的思路和方法。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  随机对照观察实验。

1.2  时间及地点  实验于2019年5至11月在长海医院完成。

1.3  材料  体积分数75%乙醇(上海沪试)；PBS(福州迈新生物公司)；青霉素/链霉素/两性霉素B溶液(上海生工)；胎牛血清、DMEM(GIBICO，美国)；L929细胞和人脐静脉内皮细胞(长海医院心血管外科实验室提供)；TritonX-100、十二烷基硫酸钠(美国Sigma)；二甲基亚砜(上海沪试)；CCK-8试剂盒(日本同仁)；10%中性福尔马林(江苏世泰)；二甲苯(上海沪试)；氯化钠(上海沪试)；胰蛋白胨、(OXOID，英国)；琼脂粉(碧云天)；正置相差显微镜(Olympus，日本)；二氧化碳恒温培养箱(Thermo，美国)。

1.4  实验方法

1.4.1  牛心包获取及分组处理  牛心包从当地屠宰场获得，用无菌的冷PBS运送至实验室。去除附着的脂肪组织并用预冷的无菌PBS清洗干净。同一片牛心包裁剪成若干 1 cm×1 cm的小块，随机分4组处理：用含1%抗生素(青霉素/链霉素/两性霉素B溶液)的PBS处理24 h；用氯己定溶液处理24 h；体积分数75%乙醇处理24 h；以无菌PBS浸泡24 h的牛心包作为PBS对照组。每组随机抽取6个样本铺于无菌12孔板中并加入1 mL的DMEM完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素/两性霉素B溶液)，置于体积分数5%CO₂湿化的37 ℃恒温箱中24 h。培养液留存用于后续LB固体培养基涂板。

1.4.2  牛心包微生物培养实验  配置LB固体培养基，按照标准配比胰蛋白胨10 g：酵母提取物5 g：NaCl 10 g以去离子水定容1 L，同时按照每100 mL LB培养基中加入1.5 g琼脂粉，充分搅拌混匀，调节pH值为7.4。高压蒸汽灭菌，在无菌条件下倒板(约10 mL)，每组随机选3个样本培养液，吸取10 µL均匀涂抹在LB固体琼脂表面，37 ℃恒温箱中孵育24 h，观察琼脂表面是否有菌落生长。

1.4.3  牛心包组织形态学观察  每组随机选择5个牛心包样本，用体积分数10%中性甲醛固定，石蜡包埋后连续切片，行常规VB染色，光镜下观察并拍照。评估各组牛心包形态学变化，包括组织结构的完整性、胶原排列和细胞状态。

1.4.4  抽提液细胞毒性测定  将各实验组的牛心包研磨成粉末，按照每100 mg组织加1 mL DMEM完全培养基，4 ℃摇床震荡3 d，无菌环境下过滤分别得到心包抽提液。实验分为6组：正常细胞组(DMEM完全培养基+L929细胞)、空白组(DMEM完全培养基)、PBS对照组(PBS处理组的抽提液+ L929细胞)、1%抗生素组(1%抗生素处理组的抽提液+L929细胞)、氯己定组(氯己定处理组的抽提液+L929细胞)和75%乙醇组(体积分数75%乙醇处理组的抽提液+L929细胞)。在96孔板中配置100 µL/孔的L929细胞悬液，每组6个复孔。将培养板置于体积分数5%CO₂湿化的37 ℃恒温箱培养  24 h。向各组复孔中加入200 µL/孔对应的心包抽提液，每天固定时间点测量加入CCK-8工作液后30 min时所有实验孔在450 nm处的吸光度值，连续测量3 d，记录并保存数据。通过统计学分析比较不同灭菌处理方法的细胞毒性差异。

1.4.5  直接接触毒性实验  经过体积分数75%乙醇灭菌的牛心包反复冻融3次；置于含1%Tritonx-100、1%tris、0.5%十二烷基硫酸钠的无菌溶液处理3 d(pH=7.6)，隔8-12 h换液；无菌PBS洗3 d，隔8-12 h换PBS，通过一系列脱细胞程序得到牛心包脱细胞支架，大小1 cm×1 cm。将牛心包脱细胞支架与人脐静脉内皮细胞置于体积分数5%CO₂湿化的37 ℃恒温箱中共培养，24，48 h在正置显微镜下观察细胞与支架的直接接触情况及细胞状态。

1.4.6  脱细胞支架内皮细胞化实验  将体积分数75%乙醇灭菌后的牛心包脱细胞支架置于12孔板中，将重悬的人脐静脉内皮细胞悬液按照每孔2×10⁶的比例与脱细胞支架共培养，持续培养20 d。隔天更换新鲜培养液，每2 d种植一次人脐静脉内皮细胞，分别在第6，8，10，12，14，16，18，20天取6片已种植人脐静脉内皮细胞的脱细胞牛心包，制作石蜡组织切块，通过苏木精-伊红染色评估脱细胞支架内皮细胞化程度。用正置显微镜在50 µm标尺下随机选取不同切片的5个视野，统计脱细胞支架表层黏附的人脐静脉内皮细胞数量，得到体外牛心包脱细胞支架内皮化的相对最佳时间点。

1.5  主要观察指标  ①各组LB固态琼脂的菌落情况；②各组VB染色形态学观察；③各组CCK-8细胞毒性实验；④各组牛心包脱细胞支架内皮化的苏木精-伊红染色。

1.6  统计学分析  统计学软件运用GraphPad Prism，实验数据以x(_)±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析，  P < 0.05表示差异有显著性意义。

无菌无毒是组织工程材料临床应用的一项基本要求。尽管针对生物材料的灭菌方法种类繁多^[13-14]，包括干热灭菌、湿热灭菌、辐射灭菌、化学试剂灭菌，但如何对生物组织进行充分的灭菌并保留最初的支架结构仍是一个挑战。早期的研究证明，组织工程支架的灭菌不仅是杀死微生物，也要注意材料性能和结构的维护^[15-17]。最常见的生物材料消毒方法是使用化学药剂如过氧乙酸或环氧乙烷^[18-19]，或使用紫外线或伽玛射线^[8，20]，然而后者会导致心包组织的结构和生物力学的变化。超临界二氧化碳的应用可能为生物材料的灭菌提供一种新的有效方法^[21-22]。目前可利用戊二醛交联来改善生物瓣膜的机械性能，然而交联处理会增加氧化应激水平，促进胶原酶敏感性，最终导致瓣膜衰竭^[23-24]。另外有研究表明，戊二醛交联会导致细胞外基质结构成分的改变^[25]。这种对天然细胞外基质结构的破坏促进了先天免疫细胞将固定的牛心包识别为异物，刺激了一种以支架周围大量巨细胞和纤维包裹为特征的异物反应。但是考虑到牛心包组织结构的特性，必须选择合适的灭菌方法，以确保安全，并保持牛心包结构完整性和机械性能。在这种情况下，常用的灭菌方法(包括高压灭菌、环氧乙烷和高能辐照)并不特别适用于组织工程中使用的牛心包。

牛心包是一个动物组织，被各种微生物感染的可能性非常高^[26-27]。对照组的细菌定性实验也说明新鲜的牛心包含有大量细菌。组织工程支架构建之后的体、内外生物反应实验，是建立在无菌基础之上的，所以对牛心包的灭菌处理必不可少。实验的目的是确定一种既不破坏牛心包结构又能有效杀菌的方法。实验研究了一种新的方法，即使用体积分数75%乙醇固定和消毒牛心包，而不会造成任何有害影响。体积分数75%乙醇是一种常用的室温化学灭菌剂，作者通过改变浸泡时间证明了使用体积分数75%乙醇可以对牛心包进行有效的杀菌，并最大限度地维持牛心包组织结构的完整性。体积分数75%乙醇经济实惠、易清洗，其浸泡过的牛心包对细胞无毒性。课题组研究发现，牛心包滤液在一定程度上反而促进L929细胞的生长增殖，推测可能与牛心包组织中某些特殊成分有关。细胞黏附实验表明，牛心包脱细胞支架与人脐静脉内皮细胞具有良好的生物相容性，人脐静脉内皮细胞可以很好地黏附在脱细胞支架表层，形成内皮化支架。氯己定虽然能够起到灭菌作用，但牛心包中残留的氯己定不易清洗去除，具有较强的细胞毒性，无论是体外细胞直接接触实验还是CCK-8实验都可见细胞死亡，无法存活。抗生素虽然不能达到灭菌要求，但具有一定的抑菌作用，与以往研究一致^[28]。实验证明体积分数75%乙醇是牛心包灭菌的最佳选择。体积分数75%乙醇破坏细菌细胞壁的通透性，使蛋白质变性，密封洗涤24 h可以彻底杀死所有微生物。由于脂质成分堆积易促使瓣膜钙化^[29-30]，而体积分数75%乙醇作为一种有机溶剂可以进一步溶解牛心包上的脂肪组织等有机成分，可能对支架的抗钙化作用有益。另外，乙醇经济实用，易清洗，可安全地处理而不影响环境。

理想情况下，消毒方案应达到最大程度地减少生物污染，对组织完整性的影响应尽可能小，提高支架的临床应用价值。目前研究显示，体积分数75%乙醇是一种可以对任何表面进行灭菌消毒的有效试剂，但其实用性还有待于对不同的组织工程材料进行验证。灭菌条件对不同材料的影响各不相同，需要针对特定情况进行优化。未来的工作将研究体积分数75%乙醇灭菌脱细胞支架在体、内外的生物反应。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

组织工程：主要研究种子细胞、生物材料、构建组织和器官4个方向，其核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体，对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代，具有良好的发展前景和广阔的应用市场。

牛心包脱细胞支架：经化学和物理方法去除牛心包中的细胞，形成无免疫原性或低免疫原性材料，构建组织工程支架。

组织工程支架的灭菌不仅是杀死微生物，也要注意材料性能和结构的维护。在含有蛋白质或生物制品的支架中，灭菌方法的选择更应慎重，因为变性的风险是真实存在的，并且会导致重要的生物活性降低或丧失。在这种情况下，认识到标准的灭菌方法(包括高压灭菌、环氧乙烷和高能辐照)并不特别适用于组织工程中使用的牛心包。牛心包是当前生物瓣膜最重要的生物原材料。作者在国家重点研发计划资助的心脏组织工程支架研究工作中也发现新鲜的牛心包易被微生物不同程度的污染，对牛心包的灭菌也同样是组织工程支架材料研发的关键之一。到目前为止，关于组织工程支架研究中牛心包灭菌方法的报道很少。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程