Three-dimensional bioprinting technology in tissue engineering

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.018

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: Three-dimensional bioprinting technology is the emerging technology in recent years, which is one of the branches of tissue engineering. The three-dimensional bioprinting technology has been used in the reproduction process of in vitro tissues and organs, which has achieved surprising outcomes.
OBJECTIVE: To review the three-dimensional bioprinting technology in terms of its principles, operating steps, relationships with tissue engineering, advantages and challenges, as well as clinical applications.
METHODS: The first author did a computer-aided retrieval of the PubMed database, CNKI database, and CQVIP database for articles relevant to three-dimensional bioprinting technology used in tissue engineering published between January 2000 and October 2000. The key words were “three-dimensional bioprinting, tissue engineering, rapid prototyping technology, scaffold materials, selective laser sintering, fuseddeposition modeling, stereolithography” in English and Chinese. Repetitive studies were excluded, and 52 of 79 related literatures were adopted in result analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Three-dimensional bioprinting technology is one of the branches of tissue engineering, which can build a virtual three-dimensional structure layer by layer under the computer-aided design technology, with the help of imaging data information (including CT and MRI). This technology has the advantages of high precision, high building speed, fabrication on demand, and also has the challenges in engineering mechanics and biological activities. In a word, it is a meaningful and promising technology in clinical application.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

Key words: imaging, three-dimensional, tissue engineering, stents, magnetic resonance imaging, computer-aided design

CLC Number:

R318

Shi Jing, Zhong Yu-min. Three-dimensional bioprinting technology in tissue engineering[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(2): 271-276.

Figures/Tables 1

2.1 什么是3D打印所谓3D打印是可以真实打印三维物体的一种技术[9]，其最早应用于工业制造领域，目前上海已经有3D打印实体店开张了。其打印原理简单来说类似于激光成型技术，采用分层加工、迭加成形的技术，即通过逐层增加材料来形成3D实体。称其为“打印机”是因为参照了目前商用打印机的技术原理，因为分层加工的过程与喷墨打印十分相似。3D打印机与传统喷墨打印机最大的不同在于：3D打印机的喷头不仅仅能在平面上移动，还能够垂直移动。它的打印过程类似于CT或者MRI扫描的逆过程，将一层层剖面图再重新叠加起来，从而构成三维结构。实现3D打印的过程：首先在电脑中利用计算机辅助设计等技术建立产品模型，根据需要调整各种参数、如大小、各种生物分子的配比等，然后相关软件会自动将产品按照一定的厚度进行虚拟的“切片”，并将相关数据传输到3D打印机，打印机就把这些极薄的“切片”用塑料、松脂或金属粉末像打印彩绘图那样打印出来，然后通过可自由转动的喷嘴喷出堆接材料、强力胶水或聚焦光束将其黏合成一个整体。打印过程涉及到所谓的“胶水”和“粉末”：在需要成型的区域喷洒一层特殊胶水，胶水液滴本身很小，且不易扩散，然后是喷洒一层均匀的粉末，粉末遇到胶水会迅速固化黏结，而没有胶水的区域仍保持松散状态。这样在一层胶水一层粉末的交替下，实体模型将会被“打印”成型，打印完毕后扫除松散的粉末即可“刨”出模型，而剩余粉末还可被循环利用。因此，打印耗材由传统的墨水、纸张转变为“胶水”、“粉末”，当然，此处所指的“胶水”、“粉末”都是经过处理的特殊材料，不仅对固化反应速度有要求，对于模型强度以及“打印”分辨率都有直接影响。 2.2 组织工程学的三维构建经典的组织工程构建需要种子细胞和支架材料[10]。支架材料定义是：可以为种子细胞提供适合其生长的场所和发挥生物学功能的一种生物学材料，具有能模仿天然组织的构建性能[11]。作为种子细胞的生物学载体，理想的支架材料应具如下特征[12-13]：①良好的生物相容性。②适中的生物降解性。③具有诱导或引导组织再生的能力。④具有一定的生物力学强度与可塑形性。⑤无毒性与无免疫原性。⑥具有合适的孔径，利于细胞黏附生长等特点。早期的支架构建采用单纯的铸造技术，尽管可以形成多孔，但孔径的大小无法与细胞相匹配，无法根据计算机辅助成型技术事先确定支架内部结构及细胞与孔径间的连接。如今，最初用于制造业的模具开发和制造的快速成型技术解决了这一难题[14-17]。快速成型技术是多种三维构建技术的总称，又称为立体自由构建[18-22]，其方法主要是先利用计算机辅助成像技术虚拟构建出三维数字结构，再依此数字化模型，以逐层加工的模式逐步构建出所需的三维组织实体结构。以下简单介绍几种快速成型技术。 2.2.1 选择性激光烧结[23-26] 选择性激光烧结是使用激光发热将聚合物颗粒熔融烧结为所需的形状的一种生产制造技术。激光束扫描聚合物粉末，使局部表面温度升高，引起聚合物颗粒逐层烧结形成所设计的结构。选择性激光烧结的分辨率受到激光束直径的限制。改进选择性激光烧结加工工艺主要包括使用更小的激光束直径，更细的粉末，更薄的烧结层，从而生产出分辨率更高的支架，扩大支架的表面积，有利于细胞的生长。 2.2.2 熔融沉积成型[27-29] 熔融沉积成型是将热熔性材料加热熔化，通过喷头挤喷出来，随即与前一个层面熔结在一起，逐层沉积直至形成三维支架。该项技术的局限性在于其Z轴方向的运动有限，不利于三维构建，此外，用于熔融沉积成型的材料对其熔点和加工条件有较严苛的限制。 2.2.3 立体光刻技术[30-32] 立体光刻技术是以光敏树脂为原料，紫外激光器发射激光，在光树脂表面进行逐点扫描，使被扫描区域的树脂薄层发生光聚合反应而固化，形成一个薄层，一层固化完毕后，工作台下降一个凝固层的厚度，在原先固化好的树脂表面再敷上一层新的液态树脂，然后进行下一层的扫描加工，新固化的一层牢固地黏在前一层上，如此反复直到三维构建完成。其局限性在于细胞支架都是树脂类材料，不具有生物可降解性。 2.2.4 3D生物打印技术以上几种立体自由构建技术，虽已取得了很好的效果，但其均不能够同时将细胞和支架材料同时构建为组织模型。而最初用于制造工业的打印设备为研究者提供了灵感：将打印机的墨水盒内按需装入配比好的混入种子细胞的液态材料，组成“生物墨水”，甚至可以依据彩色喷墨打印机具有不同颜色的墨盒槽的原理，选择不同的细胞、营养成分、支架材料等按不同配比装入不同的色槽，从而构成“彩色生物墨水”，实现按需的组织学装配。尽管生物大分子容易受到酸、碱、热等理化因素的因素发生变性，但有研究者已经成功地利用气泡打印机将DNA寡核苷酸链打印到玻璃表面形成微矩阵[33]，Boland领导的研究小组使用改装的普通喷墨打印机成功地将生物细胞打印到基质上，并先后完成了从细胞打印到器官打印的开创性研究[34]。 2.3 3D打印技术的优势和难题 2.3.1 3D打印技术相较其他快速成型技术，具有如下优势 ①高精度：即分辨率高。该技术可以精确控制墨水喷射位置和墨水的量，有利于生物显微结构的建立，有利于局部痕量供给生物活性因子及药物，从而有利于控制组织的局部生长发育。②可以同时打印种子细胞和支架材料，更利于整体三维结构的构建。其可以使用多颜色墨盒的原理，从而实现同时打印组织/器官内的不同组分，使用不同的细胞、细胞外基质和生物活性因子，并且使用精确的配比。③构建速度快：能够快速的制造生物组织/器官，保证了生物材料的存活率，从而显著有利于再生医药、器官移植等未来医学领域。④可以按需制造出符合个体需求的单个器官或组织，真正实现医学的个性化需求。⑤3D生物打印使用的种子细胞是来自患者自己身体的细胞，所以可以从根本上解决其他组织工程易发生的排异反应。 2.3.2 3D组织/器官打印技术尚处于起步阶段，还有很多问题需要解决 ①力学方面：喷射过程中的剪切力和液滴的冲击力会对打印细胞液活性造成冲击。因此，“生物墨水”的配制必须符合流体力学的要求，包括黏滞性、密度、表面张力等重要参数[35]。这些因素均可造成细胞的损失影响细胞的存活，从而不利于体外的培养。同时打印前，打印过程中均要求所打印的细胞或分子保持液态，而打印后又要求其必须立即凝固，以维持黏弹性状态。这种液态到固态的变化必须保证不引起细胞、生物活性因子以及其他微粒的损伤，这也对3D打印的发展提出了相当大的挑战。②生物支架材料：生物支架材料要解决的问题有：支架材料的可降解性及降解速率；材料的机械力学强度；支架的最适孔径和孔隙率[36-37]。适度的生物降解速率，指该降解速率需和组织再生的速率相匹配，最后可完全吸收或可安全排出。合适的孔尺寸、高的孔隙率(90%)和相连的孔形态，对于大量细胞的种植、细胞和组织的生长、细胞外基质的形成、氧气和营养的传输、代谢物的排泄以及血管和神经的内生长起着决定作用[38]。虽然，支架的最适孔径尚无定论，但学者还是公认，几十到几百微米的孔径对于细胞的迁移和长入支架内部通常认为是必需的[39]。支架孔径过小，不利于细胞的穿透，培养的细胞经过很长的时间，仍然依附于支架表面，未能穿透到支架内部。支架孔径过大，不利于细胞的黏附和铺展，同样会妨碍细胞生长。解决此问题的一个方法是用纳米纤维与微米纤维共同构建支架材料[40]。纳米纤维为细胞的黏附和生长提供合适的表面形态，利于细胞在支架上的黏附与生长，微米纤维提供整体的环境，利于细胞渗透到支架内部。所以微/纳米复合纤维支架应用于组织工程具有很大潜力[41]。目前国内外研究的支架材料种类众多，但归纳起来可分为两大种类：一类是天然生物衍生材料，如脱钙骨基质、壳聚糖、藻酸盐凝胶等；另一类是人工合成生物高分子材料，主要有羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃等无机材料和以聚乳酸及其共聚物等为代表的有机材料。这些支架材料都各有其优缺点，传统的支架往往是单一的有机物或无机物，但其往往不能同时满足3D打印的需要，因此，现在的研究方向是发挥不同材料的优势，弥补单一材料的不足，制造出各种复合支架材料。③生物学方面：3D打印过程中必须优先考虑的问题就是如何保持细胞的活力以及产品的塑形[42-44]。组织/器官打印必须处理好的几个生物学问题包括：A.所选择的打印方法对细胞和DNA既无毒性，也不会引起不可逆的损伤，在整个打印过程中都要求是无菌化的。B.打印的构建物可以快速成型，成为有凝聚性的、具有机械稳定性的三维结构，不能在打印后出现溶解或坍塌。C.打印的构建物可以进行体外培养、增殖、分化、发育等后处理过程，要求构建模型是具有组织/器官三维特征的，能够模拟组织/器官特异性的微结构和微环境。D.构建的组织/器官的再血管化问题也非常关键，它是构建组织/器官成活的关键，血管可以及时为种子细胞提供其成活所必需的营养，并且可以排泄代谢废物。 2.4 3D生物打印技术的临床应用 2.4.1 人造毛细血管德国的Gunter Tovar博士已经利用3D打印技术制造出人工血管[45]。虽然早在20世纪50年代，人造血管就已经被研制成功，但仅限于大动脉血管，对于直径在6 mm以下的静脉血管或者毛细血管的研究上，一直没有取得突破性进展。主要原因是，人造毛细血管不仅需要足够细小，而且还要有能和真实血管媲美的弹性和生物相容性。德国科学家用3D打印双光子聚合和生物功能化修饰制作出的毛细血管，具有良好的弹性和人体相容性，不但可以用于替换坏死的血管，还能与人造器官结合，有可能使构造的组织/器官实现再血管化。 2.4.2 人造骨骼人体骨骼形态极不规则，个体形态差异较大，因此，成批制造人工骨骼意义不大，而个性化定制人工骨骼在临床应用中有广泛需求。瑞士伯恩塞尔医院的Christian Weinand领导的研究小组成功复制了他自己的拇指骨[46]。解放军第三军医大学西南医院关节研究中心已经拥有自己的立体打印骨骼的三维打印机。该科王富友博士用其打印了教学实体器官，还用打印出来的“人造器官”为患者讲解手术方案，未来有望用于人体实验。 3D打印用于人工骨的构建时，根据使用材料的不同，可以分为3种工艺：①黏结材料三维打印所用喷头大多为压电式喷头，易造成喷嘴阻塞，且其黏结剂的添加会影响骨骼材料的生物活性，因此，该技术不能应用于成形人体骨骼。②光敏材料三维打印运动方式最为简单，喷头选择性地喷出实体材料和支撑材料，可在室温下操作，是理想的骨骼打印方法，其局限性在于当前广泛用于骨骼构造的生物材料是羟基磷灰石，其自身不是光敏材料，所以必需与光敏材料混合使用，从而影响了骨骼的生物活性。③熔融材料三维打印成形，可采用由磷灰石和骨骼所需的有机盐配置而成的骨水泥，不需要添加黏合剂或光敏介质，有利于维持细胞的活性；由螺杆挤压式喷头喷射成形，不会造成阻塞现象；不需要紫外光照射固化，只需要惰性气体迅速冷却即可，使其可在室温下操作。因此，该技术成为人体骨骼3D成形领域的主导方向。上海交通大学、西安交通大学、清华大学的研究者们在此技术上均取得了不同程度的成果[47-49]。 2.4.3 口腔医学类似于人体骨骼，牙齿的形态、结构亦相当复杂，组织结构构成多样，为了适应牙槽的结构，牙齿生长及发展变化的趋势亦完全不同，因此，用传统的组织工程技术进行牙再生存在众多难以解决的问题。而三维生物打印技术是可以进行计算机辅助成型技术设计的，以满足个性化生产的需求，因此，三维打印技术在口腔医学也有着广泛的应用。北京大学口腔医学院薛世华等[50]已经成功进行了人牙髓细胞共混物的三维生物打印。该课题组采用酶联合消化法原代培养人牙髓细胞作为种子细胞，海藻酸钠-明胶水溶胶作为支架材料，进行三维打印。打印后，将获得的三维生物打印结构体浸入完全培养基进行后加工培养。经评测，打印后的细胞体存活率可达(87±2)%。该研究表明生物打印技术在人牙齿组织工程中应用的可行性，未来有望应用于牙再生工程。据百度网页新闻搜索得知，Objet公司与3Shape公司日前宣布，两家公司已合作研发出牙科领域的三维修复方案。此方案将Objet Eden系列三维打印机与3Shape Dental System 2010进行无缝整合，完成牙科领域的三维修复设计和三维原型制作。它涵盖了从三维印模扫描、应用3Shape Dental System完成计算机辅助成型设计、运用3Shape CAM bridge专属CAM软件编辑/修复三维数据，直至在Objet Eden系列三维打印机上完成最终生产和制作等一系列的工作流程。"

References

[1] Langer R.Tissue engineering: perspectives, challenges, and future directions. Tissue Eng. 2007;13(1):1-2.

[2] Liu M, Liu N, Zang R, et al. Engineering stem cell niches in bioreactors. World J Stem Cells. 2013;5(4):124-135.

[3] 赵宇,于淼,柏树令.脱细胞技术及其在组织工程中的应用研究进展[J].中国修复重建外科杂志,2013,27(8):950-954.

[4] Huang J, Mao Y, Millis JM. Government policy and organ transplantation in China. Lancet. 2008;372(9654): 1937-1938.

[5] Ozbolat IT, Yu Y. Bioprinting toward organ fabrication: challenges and future trends. IEEE Trans Biomed Eng. 2013;60(3):691-699.

[6] Partridge R, Conlisk N, Davies JA. In-lab three-dimensional printing: an inexpensive tool for experimentation and visualization for the field of organogenesis. Organogenesis. 2012;8(1):22-27.

[7] Xu C, Chai W, Huang Y, et al. Scaffold-free inkjet printing of three-dimensional zigzag cellular tubes. Biotechnol Bioeng. 2012;109(12):3152-3160.

[8] Jakab K, Norotte C, Marga F, et al.Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells. Biofabrication. 2010;2(2):022001.

[9] 王雪莹.3D打印技术与产业的发展及前景分析[J].中国高新技术企业,2012,(26):3-5.

[10] 房瑞,许零.组织工程皮肤支架材料和种子细胞的研究进展[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(47):9329-9333.

[11] Credi C, Biella S, De Marco C, et al. Fine tuning and measurement of mechanical properties of crosslinked hyaluronic acid hydrogels as biomimetic scaffold coating in regenerative medicine. J Mech Behav Biomed Mater. 2013; 29C:309-316.

[12] Panetta NJ, Gupta DM, Longaker MT. Bone tissue engineering scaffolds of today and tomorrow. J Craniofac Surg. 2009;20(5):1531-1532.

[13] Ku KC, Lee MW, Kuo SM, et al. Preparation and evaluation of collagen I/ gellan Gum/β-TCP microspheres as bone graft substitute materials. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2013;2013:6667-6670.

[14] Yeong WY, Chua CK, Leong KF, et al. Rapid prototyping in tissue engineering: challenges and potential. Trends Biotechnol. 2004;22(12):643-652.

[15] Lantada AD, Morgado PL. Rapid prototyping for biomedical engineering: current capabilities and challenges. Annu Rev Biomed Eng. 2012;14:73-96.

[16] Cao P, Duhamel Y, Olympe G, et al. A new production method of elastic silicone carotid phantom based on MRI acquisition using rapid prototypingtechnique. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2013;2013:5331-5334.

[17] Lee SJ, Lee HP, Tse KM, et al. Computer-aided design and rapid prototyping-assisted contouring of costal cartilage graft for facial reconstructive surgery. Craniomaxillofac Trauma Reconstr. 2012;5(2):75-82.

[18] Shanjani Y, De Croos JN, Pilliar RM, et al. Solid freeform fabrication and characterization of porous calcium polyphosphate structures for tissue engineering purposes. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2010;93(2):510-519.

[19] Leong KF, Cheah CM, Chua CK. Solid freeform fabrication of three-dimensional scaffolds for engineering replacement tissues and organs. Biomaterials. 2003 ;24(13):2363-2378.

[20] Hong JM, Kim BJ, Shim JH, et al. Enhancement of bone regeneration through facile surface functionalization of solid freeform fabrication-based three-dimensional scaffolds using mussel adhesive proteins. Acta Biomater. 2012;8(7): 2578-2586.

[21] Kwon BJ, Kim J, Kim YH, et al. Biological advantages of porous hydroxyapatite scaffold made by solid freeform fabrication for bone tissue regeneration. Artif Organs. 2013; 37(7):663-670.

[22] Lee JS, Cha HD, Shim JH,et al. Effect of pore architecture and stacking direction on mechanical properties of solid freeform fabrication-based scaffold for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 2012;100(7):1846-1853.

[23] Mazzoli A. Selective laser sintering in biomedical engineering. Med Biol Eng Comput. 2013;51(3):245-256.

[24] Gittard SD, Narayan RJ. Laser direct writing of micro- and nano-scale medical devices. Expert Rev Med Devices. 2010; 7(3):343-356.

[25] Cahill S, Lohfeld S, McHugh PE. Finite element predictions compared to experimental results for the effective modulus of bone tissue engineeringscaffolds fabricated by selective laser sintering. J Mater Sci Mater Med. 2009;20(6):1255-1262.

[26] Tan KH, Chua CK, Leong KF, et al. Selective laser sintering of biocompatible polymers for applications in tissue engineering. Biomed Mater Eng. 2005;15(1-2):113-124.

[27] Centola M, Rainer A, Spadaccio C, et al. Combining electrospinning and fused deposition modeling for the fabrication of a hybrid vascular graft. Biofabrication. 2010; 2(1):014102.

[28] Korpela J, Kokkari A, Korhonen H, et al. Biodegradable and bioactive porous scaffold structures prepared using fused deposition modeling. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2013;101(4):610-619.

[29] Charest K, Mak-Jurkauskas ML, Cinicola D, et al. Fused deposition modeling provides solution for magnetic resonance imaging of solid dosage form by advancing design quickly from prototype to final product. J Lab Autom. 2013; 18(1):63-68.

[30] Kumar S, Hofmann M, Steinmann B, et al. Reinforcement of stereolithographic resins for rapid prototyping with cellulose nanocrystals. ACS Appl Mater Interfaces. 2012; 4(10): 5399-5407.

[31] Linnenberger A, Bodine MI, Fiedler C, et al. Three dimensional live cell lithography. Opt Express. 2013;21(8): 10269-10277.

[32] Bajaj P, Chan V, Jeong JH, et al. 3-D biofabrication using stereolithography for biology and medicine. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2012;2012:6805-6808.

[33] Okamoto T, Suzuki T, Yamamoto N. Microarray fabrication with covalent attachment of DNA using bubble jet technology. Nat Biotechnol. 2000; 18(4):438-441.

[34] Cui X, Dean D, Ruggeri ZM, et al. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol Bioeng. 2010; 106(6):963-969.

[35] Mironov V, Reis N, Derby B. Review: bioprinting: a beginning. Tissue Eng. 2006;12(4):631-634.

[36] 位晓娟,奚廷斐.医用海藻酸基生物材料的研究进展[J].中国修复重建外科杂志,2013,27(8):1015-1020.

[37] Rajangam T, An SS. Fibrinogen and fibrin based micro and nano scaffolds incorporated with drugs, proteins, cells and genes for therapeutic biomedical applications. Int J Nanomedicine. 2013;8:3641-3662.

[38] Song SJ, Choi J, Park YD, et al. Sodium alginate hydrogel-based bioprinting using a novel multinozzle bioprinting system. Artif Organs. 2011;35(11):1132-1136.

[39] Oh SH, Park IK, Kim JM, et al. In vitro and in vivo characteristics of PCL scaffolds with pore size gradient fabricated by a centrifugation method. Biomaterials. 2007; 28(9):1664-1671.

[40] Ekaputra AK, Prestwich GD, Cool SM, et al. The three-dimensional vascularization of growth factor-releasing hybrid scaffold of poly (epsilon-caprolactone)/collagen fibers and hyaluronic acid hydrogel. Biomaterials. 2011;32(32): 8108-8117.

[41] Thorvaldsson A, Stenhamre H, Gatenholm P,et al. Electrospinning of highly porous scaffolds for cartilage regeneration. Biomacromolecules. 2008;9(3):1044-1049.

[42] Ingber DE, Mow VC, Butler D,et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 2006; 12(12):3265-3283.

[43] Cui X, Boland T, D'Lima DD, et al. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 2012;6(2):149-155.

[44] Chang CC, Boland ED, Williams SK, et al. Direct-write bioprinting three-dimensional biohybrid systems for future regenerative therapies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2011;98(1):160-170.

[45] Engelhardt S, Hoch E, Tovar GE, et al. Fabrication of 2D protein microstructures and 3D polymer-protein hybrid microstructures by two-photon polymerization. Biofabrication. 2011;3(2):025003.

[46] Weinand C, Gupta R, Weinberg E,et al. Toward regenerating a human thumb in situ. Tissue Eng Part A. 2009;15(9): 2605-2615.

[47] 王天明, 习俊通, 金烨. 颗粒体进料微型螺旋挤压堆积喷头的设计[J].机械工程学报, 2006,42(9):178-184.

[48] 吴永辉, 李涤尘. 基于RP的人工骨骼制造方法探索[J].中国机械工程,2001,12(4):392-394.

[49] 熊卓, 颜永年, 张超. PLLA/TCP复合骨组织载体框架的低温挤出成形[J]. 清华大学学报：自然科学版, 2003,43(5):593-596.

[50] 薛世华,吕培军,王勇,等.人牙髓细胞共混物三维生物打印技术[J].北京大学学报:医学版，2013,45(1):105-108.

[51] Tsang VL, Bhatia SN. Fabrication of three-dimensional tissues. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2007;103:189-205.

[52] Catros S, Guillemot F, Nandakumar A,et al. Layer-by-layer tissue microfabrication supports cell proliferation in vitro and in vivo.Tissue Eng Part C Methods. 2012;18(1):62-70.