2.1   CAR-T细胞疗法    2.1.1   CAR-T细胞的组成结构及作用机制   CAR是一种跨膜嵌合蛋白，它结合T细胞形成可特异性识别和消除特定肿瘤细胞的CAR-T细胞，是CAR-T细胞的核心部件，通过反转录病毒或慢病毒转导，含胞外区、铰链区、跨膜区及胞内区4个结构域[2-3]。 各结构域具有特定的功能：①胞外区可由轻链和重链连接而成的单链可变片段(single chain fragment variable，scFv)，能够特异性识别肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens，TAAs)的单克隆抗体[4]。②铰链区是针对不同肿瘤相关抗原设计铰链区长度，以便结合靶抗原。③跨膜区选取CD3、CD8或CD28等跨膜受体蛋白作为细胞膜的锚点连接细胞内外，影响胞内区的激活信号传递，因此在活化T细胞中起重要作用。④胞内区是受体的功能端，由CD3ζ活化信号(包含免疫受体酪氨酸活化基序ITAM)和1个或1个以上的共刺激结构域[如CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、ICOS]组成细胞内信号转导区域[2]。其中，CD28跨膜结构域作为最稳定的受体在临床中广泛应用。正常T细胞依赖T细胞受体识别抗原，T细胞受体与主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子提呈的肿瘤抗原短肽结合，通过信号通路产生级联反应活化为细胞毒性T淋巴细胞，特异性结合有相同MHC抗原肽的肿瘤细胞进而发挥细胞毒性作用[5]。而CAR-T细胞可以针对肿瘤细胞抗原构建特定的单克隆抗体，通过scFv特异性识别肿瘤特异性抗原直接将信号传到T细胞内，使T细胞活化并释放穿孔素/颗粒酶等细胞因子从而破坏肿瘤细胞[6]，同时形成免疫记忆T细胞，发挥长效抗肿瘤作用。CAR-T细胞不受肿瘤MHC表达下调的限制性和抗原呈递细胞的局限，能用于治疗下调MHC Ⅰ类分子导致的免疫逃逸引起的肿瘤疾病，且CAR靶点范围较广，能识别包括蛋白质、脂类和糖类等多种物质[7-8]。 2.1.2   CAR-T发展历程及分类   按照使用的细胞种类，细胞治疗分为免疫细胞治疗和干细胞治疗。其中，过继性细胞免疫疗法是免疫细胞治疗的主要方向。目前经历3种形式发展，包括肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)疗法、T细胞受体基因工程改造的T(TCR-T)细胞疗法、CAR-T细胞疗法。TIL疗法需要从切除肿瘤中分离肿瘤浸润淋巴细胞，经体外进行扩增和培养后，再回输到体内[9]。TCR-T细胞疗法需要从外周血中分离出T细胞进行分子生物学改造，将能识别肿瘤特异性抗原的T细胞受体转导到T细胞中[10]。2022年1月美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准全球首款治疗实体瘤(无法切除或转移性葡萄膜黑色素瘤)的TCR-T疗法产品Kimmtrak[11]。通过改造T细胞受体结构可以获得CAR-T细胞，CAR-T细胞具有靶向抗原精准识别的特点，表现出高特异性和强抗肿瘤疗效。CAR结构差异会影响T细胞活性、增殖和抗肿瘤持久性[12]。不同的CAR-T细胞共刺激结构域或胞内信号区域，代表着不同的CAR-T代数[13]，目前已经发展到第5代，见表1。 "

5代CAR-T细胞基本结构示意图，见图3[14]。"

①第1代：CAR-T仅有1个激活结构域CD3ζ组成。由于缺少共刺激信号，CAR-T细胞在患者体内无法持续存在，对肿瘤无效。随着研究深入发现共刺激信号对于T细胞的活化至关重要，因而在胞内区增加1个或1个以上共刺激信号形成了第2代CAR-T细胞[15]。②第2代：CAR-T细胞具有1个激活结构域和1个共刺激结构域[16]。CAR-T细胞增强信号传递并产生大量的细胞因子，提高了效应T细胞增殖能力和抗肿瘤作用[17]。目前，临床普遍使用第2代CAR-T细胞，并取得了较好的临床疗效。为进一步提高T细胞的细胞活性和毒性，对T细胞的抗肿瘤信号通路深入研究，开发了第3代和第4代CAR-T细胞。③第3代：CAR-T细胞包含1个激活结构域和2个或更多的共刺激结构域的分子，进一步提升活化T细胞产生更多的细胞因子，发挥更持久的活性和抗肿瘤效力[18]。但研究发现，第3代CAR-T细胞的临床表现并未优于甚至劣于第2代CAR-T细胞。④第4代：第4代CAR-T细胞也称为TRUCK细胞，是在第2代CAR-T的基础上插入特定细胞因子的基因，如白细胞介素基因或表达自杀的基因：白细胞介素7、白细胞介素12、白细胞介素15、白细胞介素21和iCaspase-9等[19-21]。第4代CAR-T细胞可活化T细胞核因子的转录相应元件[22]。通过对致癌靶点的特异性识别来刺激活化T细胞的最小启动子，在肿瘤区域分泌相应的细胞因子白细胞介素12，进而调节肿瘤微环境，募集并活化巨噬细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)等免疫细胞到肿瘤部位，通过激活内源性免疫反应更有效地消除肿瘤细胞，同时减少化疗等预处理[23]。到目前为止，第3代和第4代CAR-T细胞尚未有产品获批。⑤第5代CAR-T细胞目前处于早期阶段[24]。在第2代基础上构建通用型CAR-T细胞，通常采用BBIR CAR或SUPRA CAR设计以提高CAR靶向识别的灵活性[25]。也有通过敲除内源性T细胞受体和人类白细胞抗原Ⅰ类分子的设计思路，以降低异体移植的免疫排斥反应，避免异体T细胞对宿主器官的免疫攻击，从而增加CAR-T细胞的可控性。显然，CAR-T的改进是当下一个备受关注的领域，研究人员希望开发出更有效、更安全的免疫疗法。 2.1.3  CAR-T细胞上市产品  随着第2代CD19靶向CAR-T细胞国际临床试验的成功进行，免疫细胞治疗已成为癌症治疗的前沿领域。2017年，FDA批准了全球首款CAR-T细胞疗法产品——诺华的Kymriah上市[26-27]。截至目前，全球已经上市11款CAR-T细胞疗法产品(表2)，其中经美国FDA共批准的有6款，经中国国家药品监督管理局(National Medical Products Administration，NMPA)批准上市的有5款。这些获批的产品均为2代自体CAR-T细胞，结构成熟、临床效果较突出。根据嵌合抗原受体的胞外区结构分为2类：①以CD19靶点的分别为Kymriah、Yescarta、Tecartus、Breyanzi、奕凯达、Relma-cel和源瑞达，其中5种用于治疗复发性或难治性大B细胞淋巴瘤(large B cell lymphoma，LBCL)，4款用于治疗复发或难治性滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)，2款用于治疗复发/难治性套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)，2款用于治疗B细胞急性淋巴细胞白血病(B cell acute lymphoblastic leukaemia，B-ALL)，1款用于治疗复发/难治性慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic leukemia，CLL/SLL)，1款用于治疗B细胞前体急性淋巴细胞白血病的青少或儿童[28-32]；②以BCMA靶点的分别为Abecma、Carvykti、福可苏和赛恺泽，用于治疗多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者。 "

值得一提的是，除源瑞达CD19的CAR使用的是自主研发的scFv(HI19a)单链抗体外，其他产品CD19的CAR结构胞外域均使用鼠源FMC63单链抗体。 Kymriah用4-1BB作为共刺激结构域而不是CD28，其相关临床试验数据最多，可治疗疾病范围也最广。Kymriah和Yescarta使用慢病毒载体转导自体T细胞；而Yescarta和Tecartus的CAR基因使用γ-反转录病毒传递，因此针对的适应证有所不同。此外，Tecartus采用了XLP制造工艺进行T细胞筛选和淋巴细胞富集，去除了恶性细胞，其结构和Yescarta非常相像。与其他产品不同的是，Breyanzi和Relma-cel以1∶1 CD4+∶CD8+ T细胞组成递送。Abecma的CAR胞外结构域为鼠源11D5-3组成抗BCMA单链抗体。而Carvykti的CAR包含两种来源的单域抗体，这两种靶向BCMA产品的嵌合抗原受体基因都是通过慢病毒传递的。CAR-T细胞产品治疗血液恶性肿瘤具有得天独厚优势、发展迅速，临床上取得了显著的效果。国内众多企业都在积极参与，推动技术的创新和应用，为免疫细胞治疗的发展提供了强大的动力，也为患者带来了更多的治疗选择。 2.2   CAR-T细胞治疗血液系统恶性肿瘤的相关靶点    2.2.1   靶向CD19的CAR-T细胞疗法   CD19是Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于Ig超家族，在B细胞表面发挥特异性信号转导的受体。CD19在多种B细胞恶性肿瘤表面表达，而不在其他正常组织上表达。由于CD19的表达程度高于CD20、CD22，因此CD19被认为是CAR-T治疗B细胞恶性肿瘤的首选靶点，也是血液系统恶性肿瘤相关抗原中研究最彻底的靶点[33]。目前，抗CD19 CAR-T的获批适应证已覆盖B-ALL(儿童、成人)和NHL当中的LBCL、FL、MCL，并正在积极探索其他亚型的适应证。靶向CD19的CAR-T细胞治疗的r/r B-ALL患者中可诱导83%-93%的应答率[34]。国际骨髓移植研究中心(Center for International Blood and Marrow Transplant Research，CIBMTR)分析了255例接受CAR-T治疗的B-ALL儿童患者，完全缓解率为85.5%，12个月无事件生存期(event-free survival，EFS)为52.4%[35]。BRUDNO等[36]在Ⅰ期临床试验中，20例B细胞淋巴瘤患者首次使用抗CD19-CAR(Hu19-CD828Z)T细胞，完全缓解率为55%，出现严重的神经毒性的患者仅有5%。WANG等[37]对23例r/r B-ALL患者在CAR-T治疗14 d后进行评估，缓解率为82%。MYERS等[38]在一项临床试验中，72例1-29岁r/r B-ALL患者接受人源化的抗CD19 CAR-T(huCART19)细胞治疗，73%的患者治疗后6个月仍检测到CAR-T细胞，12个月和24个月的无复发生存率分别为84%和74%，表现出了长期的疗效。目前的研究显示抗CD19 CAR-T细胞治疗r/r NHL患者效果良好，在一项涉及43例r/r B细胞淋巴瘤或CLL患者的研究中，58%的治疗患者获得了完全缓解，这部分完全缓解患者中有76%保持长期缓解，持续时间为43-113个月[39]。ABRAMSON等[40]评估了Breyanzi在269例r/r LBCL患者中的疗效，客观缓解率为73%，细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，CRS)≥3级为2%，患者得到长期的缓解率。而在ZUMA-1研究中，患者获得客观缓解率和完全缓解分别82%，54%[29]。2022年的一项研究中，抗CD19 CAR-T细胞治疗r/r FL的94例患者进行中位随访16.59个月，客观缓解率为86.2%，完全缓解率为69.1%，CRS为48.5%(等级≥3，0%)，免疫效应细胞相关神经毒性综合征(immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS)为4.1%(等级≥3，1%)，无治疗相关死亡事件[30]，CAR-T细胞表现出高反应性和可控毒性，但CD19的下调或突变容易导致复发，仍然是该疗法面临的重大挑战[41-42]。2021年国际血液和骨髓移植研究中心数据显示，接受CAR-T治疗的451例患有r/r B-ALL的儿童/年轻人，中位随访21.5个月，客观缓解率为86.8%，12个月无复发生存率为62.5%，CRS≥3级为17.8%和发生ICANS为10%[43]。然而，在临床治疗中，需要更长时间的随访以充分了解药物的持续性。 目前，已知的接受靶向CD19的CAR-T细胞产品治疗的B细胞淋巴瘤或白血病患者长期预后的数据，包括17项研究提供已上市靶向CD19的CAR-T细胞产品的随访数据。在ELIANA、ZUMA、JULIET等国际研究中[39，44-46]，均显示CD19 CAR-T细胞治疗B-ALL患者保持长期缓解，最长有5年之久。结合图4和图5可以看到，整体数据显示客观缓解率为53%-100%，并保持长期缓解。Yescarta及奕凯达治疗LBCL患者总缓解率较高，客观缓解率最高达到89%。治疗B-ALL的4款产品中Kymriah的缓解率最好，中位无事件生存期长达2年之久。治疗FL的4款产品均有较高缓解率，均达到86%以上，其中Relma-cel在3个月时的客观缓解率达到了100%，但随着时间推移会有所降低。治疗MCL以及CLL/SLL的产品缓解率均达到80%以上。半数以上的MCL患者在接受Tecartus产品治疗后2年仍处于缓解期，这表明了抗CD19 CAR-T细胞在B细胞恶性肿瘤治疗中具有长期有效的活性[47]。总的来说，这些结果表明大部分接受抗CD19 CAR-T细胞治疗的患者获得了较好缓解率，不需要进一步干预就能治愈疾病，见表3[28-32，40，44，48-60]。然而，抗原丢失或下调是肿瘤耐药性的常见原因，复发仍不可避免。因此，迫切需要开发更多的靶点和治疗模式以提高临床疗效。 2.2.2  靶向BCMA CAR-T细胞疗法  BCMA也称为CD269，是一种跨膜糖蛋白，是肿瘤坏死因子受体超家族的成员，表达于成熟的B淋巴细胞，较少表达于造血干细胞和正常组织中。BCMA的过度表达和激活与MM的进展相关[61]，这使得BCMA成为MM重要治疗靶点。近5年来，抗BCMA CAR-T细胞的临床试验数量稳步增长。RAJE等[62]对33例r/r MM患者输注bb2121细胞，完全缓解率和客观缓解率为85%，45%，23例患者出现CRS(≥3级，6%)。16例有副反应的患者的微小残留病变评估均为阴性，证实了抗BCMA的CAR-T细胞治疗MM的抗肿瘤活性。另一项研究中128例接受Abecma治疗，客观缓解率为97%，完全缓解率为67%，仅有5%的患者发生≥3级的CRS[63]，因此Abecma治疗MM得到较高的缓解率。针对成熟浆细胞上缺乏BCMA可能会限制疗效和复发的问题，KANG等[64]设计了新型tan-CAR，胞外区由scFv-BCMA和scFv-CD19串联，可同时表达靶向BCMA和CD19。双靶CAR-T细胞在体内外对CD19和 BCMA抗原阳性肿瘤细胞均有显著的抗肿瘤作用。不同靶向抗原的联合应用有助于降低复发率，为CAR-T细胞治疗提供新的策略。 "

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2023年，根据美国临床肿瘤学术年会(American Society of Clinical Oncology，ASCO)报告，伊基奥仑赛注射液治疗r/r MM患者增加至103例的Ⅰ/Ⅱ期临床试验研究，客观缓解率为96.1%，完全缓解率为74.3%。12个月的无进展生存率为78.8%，仅出现1例≥3级CRS，无≥3级ICANS[65]。这些患者发生的毒副作用得到了较好的处理，获得良好的长期疗效。与CD19靶向CAR-T细胞相比，由于这些结构的发展较晚，接受BCMA靶向CAR-T细胞治疗r/r MM患者的长期效果相关数据较少。目前共有6项研究，见表4[63，67-70]，患者的客观缓解率从73%-100%不等。结合图6，可以看到上市产品中Abecma、Carvykti、福可苏的总缓解较高。Carvykti的中位无进展生存期达到27个月，半数以上的患者得到了长期的疗效。大部分患者达到完全缓解或更好，随着时间的推移无进展生存期有下降的趋势。这些数据表明抗BCMA CAR-T细胞治疗对r/r MM表现出持久的反应[66]，但治疗后BCMA表达下调、复发以及耐药的机制仍然不明确，需进一步研究。"

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