2.1   口腔鳞状细胞癌干细胞的临床意义   口腔鳞状细胞癌是头颈部最常见的肿瘤之一，其5年存活率为20%-50%[1]。确定口腔鳞状细胞癌的发生机制有助于开发更有效的治疗方法，对提高患者的生存率至关重要[2]。与口腔上皮相似，口腔鳞状细胞癌可产生增殖细胞、分化细胞和干细胞3种细胞，干细胞有能力产生表型多样的肿瘤细胞群并可无限分裂[3]，这些自我增殖的肿瘤干细胞能够影响口腔鳞状细胞癌的发生、发展及预后[4-5]，见图1。目前发现肿瘤干细胞主要有3种起源方式：①基因改变，如甲基化、去甲基化和突变等；②体细胞致癌重编程；③细胞外信号等肿瘤微环境的改变[5]。 作为肿瘤细胞的一个亚群，肿瘤干细胞具有自我更新、自我重建的能力，其主要特征体现在如下3个方面：首先，肿瘤干细胞必须表现出强大的肿瘤发生能力；其次，肿瘤干细胞经过3次移植后仍然能够自我活化、复制；第三，癌症干细胞必须表现出分化能力，能够建立来自干细胞的异种谱系[6-8]。此外移植的肿瘤干细胞还可能发生基因突变，导致去分化，并进一步加强细胞干性[6，8]。目前，已经从造血系统肿瘤、脑癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、头颈癌和皮肤癌等组织中提取出了肿瘤干细胞[7]，且不同类型的肿瘤干细胞各自具有其独特的特征[9]。 肿瘤干细胞对现有的治疗方法通常表现出抗性，针对肿瘤干细胞的口腔癌治疗方法可能是一种新的途径[10]。目前，大多数肿瘤的治疗策略建立在传统的观点上，即肿瘤是由具有增殖潜能的细胞亚群引起的，治疗的首要策略包括手术切除等[11]，然而肿瘤干细胞在手术治疗时可能已经转移，这些细胞对手术治疗乃至放化疗有着抵抗机制，在口腔鳞状细胞癌的转移和复发中起着重要的作用[12]。因此，针对口腔鳞状细胞癌干细胞设计靶向治疗有着重要的临床意义。 2.2   分离口腔鳞状细胞癌干细胞的方法   2.2.1   体外分离口腔鳞状细胞癌干细胞的方法   主要有3种：①基于细胞表面标记(如CD44)表达的荧光激活细胞分选；②根据乙醛脱氢酶活性分离；③在非附着培养条件下进行肿瘤细胞成球实验[13]。 2.2.2   体内分离口腔鳞状细胞癌干细胞的方法   肿瘤干细胞是对肿瘤生长至关重要的癌细胞亚群，明确肿瘤干细胞在癌组织中的自然生态位对于理解它们的调控作用是很重要的。近年来，遗传谱系工具被应用于体内肿瘤干细胞的研究，最广泛使用的谱系追踪方法是 Cre-lox系统，其中Cre重组酶的表达由细胞特异性启动子驱动[14]。通过这种方法对研究癌症内环境稳定中的细胞层次结构非常有用。CHEN等[15]在致癌物诱导的未受干扰的头颈部鳞状细胞癌内对肿瘤细胞进行了克隆追踪，他们发现Bmi1+肿瘤干细胞参与了头颈部鳞状细胞癌的发生、发展和转移，有趣的是顺铂可以有效杀死增殖细胞，但不能杀死Bmi1+肿瘤干细胞，这可能是头颈部鳞状细胞癌复发的原因；Rosa26DTA小鼠在Bmi1+肿瘤干细胞消融后其肿瘤能力明显减弱。此外，在小鼠皮肤鳞状细胞癌模型中，通过Cre-lox系统发现表达转化生长因子β的肿瘤细胞负责加速肿瘤的生长[16]。 尽管这些小鼠模型有助于在体内研究肿瘤干细胞的表征，但小鼠和人类之间存在着差异。小鼠和人体内的一些细胞因子在功能上并不相同，这两个物种对肿瘤干细胞的调节可能遵循不同的方案。 2.3   治疗口腔鳞状细胞癌的可能靶点   在口腔癌分级的基础上，需要考虑肿瘤干细胞亚群的特性才能获得成功的癌症治疗，同时使用旨在消除肿瘤干细胞以降低肿瘤再生能力的方法可能会增强其他治疗的效果。 目前，发展肿瘤干细胞特异性治疗的努力正在不断增加。为了杀灭肿瘤干细胞，研究人员已经探索了多种分子靶点，如信号通路、细胞表面分子、凋亡途径、microRNA、干细胞标志物等[17]。通过调节这些靶点，可以消除肿瘤干细胞群，并有助于癌症治疗。此外天然化合物靶向肿瘤干细胞的研究也在逐渐增加，部分天然化合物具有毒性低、易获得、成本低廉等优点，在辅助放化疗等传统肿瘤治疗手段有着独特的优势。 2.3.1   干细胞标记物可能是靶向治疗口腔鳞状细胞癌的重要途径   目前口腔鳞状细胞癌干细胞鉴别、分离应用最多的分子标记物为CD44、ALDH和CD133。比较肿瘤干细胞和正常干细胞的分子特征，发现这两种不同的细胞群分子特征有大量的重叠；有趣的是，与自我更新、血管生成、迁移和抗凋亡相关的基因在这两个干细胞群中广泛共享，特别是在胚胎干细胞中高度富集的因子往往与口腔鳞状细胞癌干细胞的干细胞样特征有关[18]，如Oct3/4(Octamerr结合转录因子4)、SOX2(性别决定区Y-box 2)、NANOG (NANOG Homeobox)和KLF4 (Kruppel-like factor 4)。越来越多的证据表明，CD44、ALDH、CD133、Oct3/4、Nanog、Sox2、KLF4等干细胞标记物在口腔鳞状细胞癌发生、发展及治疗中扮演重要角色，是口腔鳞状细胞癌干细胞鉴别、分离及潜在的治疗靶点。 (1)CD44：CD44是位于11p13号染色体短臂上的CD44基因编码的糖蛋白，是一种细胞表面黏附分子。该基因由两组外显子组成，即常量外显子和可变外显子。该基因序列可以通过选择特定的外显子编码多种不同的蛋白质从而具有广泛的功能。由外显子1-5和16-20组成的一组被拼接在一起，形成一个标准CD44(CD44s)的转录本；其他10个变量外显子6-15也被称为v1-v10，它们交替剪接并包含在标准外显子中，含有可变外显子或其肽产物的分子称为CD44v；它们具有独特的细胞黏附特性，可导致2个不同的细胞或1个细胞与其周围细胞基质之间的相互作用，有助于肿瘤细胞的聚集和迁移[19]。 CD44在正常口腔黏膜上皮及口腔黏膜癌前病变、恶性病变中均有表达[20]，口腔鳞状细胞癌患者肿瘤组织CD44的表达明显高于正常口腔黏膜上皮[21]，并可作为口腔肿瘤干细胞识别的表面标志物[16]。事实上，CD44是口腔鳞癌肿瘤干细胞识别中被研究最多的细胞表面标志物，其表达已在多种实体恶性肿瘤如中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌以及包括口腔癌在内的头颈部鳞状细胞癌中得到确认[22]。CD44在许多癌症中激活一系列酪氨酸激酶受体[23]， 通过激活PI3K/AKT通路增加肿瘤细胞的增殖和存活率[24]。在口腔癌中由MAPK/PI3K驱动的CD44变异体(v4和v6)表达与口腔癌侵袭性、耐药性和干性相关。CD44v4表达与ERK1/2激活和促进顺铂耐药性相关，而CD44v6表达主要与PI3K/Akt/GSK3β激活和驱动肿瘤侵袭、迁移相关[25]。 此外，CD44表达与口腔鳞状细胞癌浸润深度相关，并可能成为预测隐匿性淋巴结转移的指标[26]。唾液和血清中可溶性CD44水平的测定可能作为诊断患者是否有癌细胞浸润及早期癌症的有效方法[27]。 (2)ALDH：醛脱氢酶(Aldehyde Dehydrogenase，ALDH)有19个不同的ALDH蛋白亚型，不同蛋白亚型基因分别定位在不同的染色体区段上。与肿瘤干细胞最亲密的亚型是ALDH1家族，主要包括ALDH1A1、ALDH1A2、ALDH1A3、ALDH1B1、ALDH1L1和ALDH1L2。ALDH1A1、ALDH1A2、ALDH1A3是3种高度保守的同工酶，可将视黄醛催化成为细胞内的重要信号分子视黄酸，视黄酸对干细胞的发育、分化以及胞内醛的催化至关重要[28]。 ALDH在实体恶性肿瘤如结肠、乳腺、肝脏、肺肿瘤及头颈部鳞状细胞癌中均有表达[29]。与CD44相似，在口腔癌干细胞中也观察到ALDH的表达并与口腔癌分期、耐药及淋巴结转移相关[30-31]。在小鼠中，表达高水平ALDH标记的癌细胞具有更高的肿瘤发展潜力，而表达低水平ALDH标记的细胞则导致肿瘤发展受限[32]。因此，ALDH的表达可以用来预测口腔鳞状细胞癌的预后。  从头颈部鳞状细胞癌组织中提取的ALDH1+细胞具有自增殖能力、肿瘤形成能力、侵袭能力和成球能力[33]。ALDH1表达水平与口腔鳞状细胞癌的分期和发展呈正相关，与患者生存呈负相关；在动物模型中，ALDH1+细胞表现出更强的侵袭能力、转移能力、球状体形成能力和增加对治疗的抵抗力；ALDH1+细胞群与CD44+细胞群存在明显的重叠，其中50.6%-74.4%的ALDH1+细胞表达CD44，而只有9.8%-23.6%的CD44+细胞具有较高的ALDH活性[9，12，33]，这些研究成果表明ALDH1可能是一个更有效的口腔鳞状细胞癌干细胞标志物。 此外，ALDH抑制剂已被证实与传统的化疗、放疗在抑制疾病进展和预防肿瘤细胞耐药方面具有协同作用[34]。例如CHEN等[35]在头颈部鳞状细胞癌患者放化疗过程中抑制ALDH表达，观察到患者放化疗效果改善。 (3)CD133：人类CD133基因位于4号染色体上，包含至少37个外显子。CD133 (prominin-1)分子质量为115- 120 kD，包含850-865个氨基酸，n端暴露于细胞外环境，而c端暴露于细胞质。CD133有5个跨膜结构域，其中有2个较大的糖基化胞外环和2个较小的胞内环，分别包含约250和20个氨基酸残基[36]。 该标记已在神经组织的上皮细胞和干细胞以及脑癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤和皮肤癌组织中观察到[37]。CD133在口腔癌中可能是一种独立预后标志物，与肿瘤进展和淋巴结转移相关[38]。在口腔癌细胞中，CD133+细胞比例为1%-2%，CD133+细胞具有更高的侵袭性、克隆原性和体内致瘤性；沉默CD133能够增强口腔癌细胞的化疗敏感性[39]。此外，CD133水平升高与口腔癌细胞上皮-间充质转化过程相关[40]，并诱导细胞增殖[41]。 干细胞转录调节因子OCT4、SOX2和NANOG在肿瘤干细胞的转录和增殖中起关键作用，OCT4还可引起口腔癌变并作为口腔鳞状细胞癌发生的分子标记物[42]。OCT4和NANOG的表达与CD133的表达增加直接相关[43]。CD133还可能通过调节干细胞转录因子的表达启动口腔鳞状细胞癌，尽管它们具有自我更新和致瘤特性[44-45]，但是CD133在一些肿瘤细胞中不表达，因此CD133不能单独作为鉴别实体肿瘤中肿瘤干细胞的可靠标志物。 (4)Oct3/4：Oct3/4在正常口腔黏膜、癌前病变、口腔鳞状细胞癌原发部位和转移部位均有表达，Oct4与Sox2共表达可能导致口腔黏膜恶性转化[46]。HABU等[47]研究发现Oct3/4的高表达增加了口腔鳞状细胞癌的恶性程度，当Oct3/4失活后其恶性成分减少；Oct3/4与其他肿瘤干细胞标记物一起通过增强迁移和侵袭能力促进口腔鳞状细胞癌转移病灶形成；此外，当原发癌细胞中存在Oct3/4时，易发生颈部淋巴转移。总的来说，Oct3/4可能促进口腔鳞状细胞癌恶性、转移，特别是当与其他肿瘤干细胞标志物共表达时。 (5)Nanog：HUANG等[48]研究了Nanog与口腔鳞状细胞癌之间的关系，发现Nanog阳性细胞具有标志性的肿瘤干细胞特性。Nanog翻译后磷酸化对调节Bmi1和促进头颈部鳞状细胞癌发生至关重要[49]。与其上游靶点Oct4一样，Nanog被认为有助于提高口腔鳞状细胞癌细胞的活性和侵袭性，并且是颈淋巴转移高危患者的预测因子[49]。NANOG的表达与口腔鳞癌的分化、转移和术前辅助治疗的耐药性相关[50]。SEINO等[51]研究发现Nanog高表达的口腔癌细胞对辐射等抗癌治疗具有抗性。总之，这些研究表明Nanog可作为口腔鳞状细胞癌干细胞的标志物，是对具有高远处颈部转移风险患者进行分层的预测因子，从而为这些患者的治疗规划提供信息。 (6)Sox2：研究发现4个转录因子(Sox2、Oct4、c-Myc、Klf4)的表达足以将分化的细胞重新编程为诱导多能干细胞，而Sox2在这个过程中扮演重要角色[52]。 Sox2通常与CD44共表达，这2种因子联合作用对肿瘤干细胞的自我更新能力有显著影响[53]。Sox2的表达是口腔白斑患者发生口腔癌风险的独立预测因子，并在早期口腔肿瘤发生中起到了重要作用[54]。Sox2的下调降低了口腔鳞状细胞癌干细胞的自我更新能力、耐药能力、侵袭能力及体内致瘤能力[55]。Sox2在体内以IFN-I依赖方式促进头颈部鳞状细胞癌的生长[56]。研究发现PI3K/mTOR可直接调控Sox2蛋白质含量[57]，Sox2反过来激活ALDH1A1的表达和ALDH活力，Sox2表达通过诱导Cadherin 1来促进间叶细胞向上皮细胞的过渡和增殖，从而促进了肿瘤的进展。此外SOX2可诱导抗凋亡蛋白BCL-2的表达，增强对顺铂等凋亡诱导药物的耐药[58]。 综上所述，Sox2作为干细胞标记物在肿瘤发生发展中发挥重要作用，将来可能作为口腔鳞状细胞癌患者的预后指标。 (7)Bmi1：研究人员为了解口腔鳞状细胞癌干细胞的病理通路开展了相关研究，发现口腔鳞状细胞癌干细胞中大量表达靶基因Bmi1[59-60]。下调Bmi1表达可以影响口腔鳞状细胞癌干细胞成球能力和集落形成能力[61]。高Bmi1表达常与头颈部鳞状细胞癌的晚期、侵袭性临床病理行为、干细胞样特性、耐药性和不良预后相关[62-63]。以Bmi1为靶点，使用小分子抑制剂可显著降低头颈部鳞状细胞癌的肿瘤复发[64]。这些研究结果表明Bmi1具有成为干细胞标记物的潜力，并可能成为治疗口腔鳞状细胞癌的重要靶点。 2.3.2   影响口腔鳞状细胞癌干细胞的信号通路   SHH、Wnt、EGFR等信号通路控制着正常干细胞自我更新和分化，往往异常激活口腔鳞状细胞癌干细胞。因此，识别口腔鳞状细胞癌干细胞所需的关键途径(通路)可能是靶向口腔鳞状细胞癌干细胞的重要治疗途径。   (1)SHH信号通路：SHH(SonicHedgehog)信号通路是胚胎发育和成熟组织稳态的重要机制[65]。当SHH与PTCH受体结合时该通路被激活，PTCH受体进而抑制Smoothened(SMO)跨膜受体，而SMO的激活通过募集和激活GLI家族转录因子(包括GLI1、GLI2和GLI3)来触发SHH信号级联[66]。既往研究表明，SHH信号在多种肿瘤干细胞中上调，包括脑肿瘤、乳腺癌、肝癌和胃癌[67-70]。在口腔鳞状细胞癌中，与正常口腔黏膜相比，肿瘤组织中GLI、PTCH1、SMO和SHH表达水平均升高[71]。此外，GLI1的表达与口腔鳞状细胞癌淋巴结转移、复发、临床分期及预后不良有关，而SHH信号通路的阻断会抑制肿瘤生长和血管生成[72]。在口腔鳞状细胞癌细胞系中抑制GLI3表达后，减少了OCT4和Bmi1的表达，导致口腔鳞状细胞癌中肿瘤干细胞数量减少、成球能力下降[73]。 (2)WNT信号通路：WNT信号通路是干细胞自我更新和决定命运的进化保守通路[74]。基于β-catenin的依赖，WNT信号通路可分为2个，即经典和非经典途径。经典β-catenin/WNT信号通路的激活需要绑定WNT卷曲蛋白及其受体配体、脂蛋白受体相关蛋白5或6(LRP 5/6)，收集β-catenin降解复合体并允许β-catenin积累在细胞质中。然后，β-catenin将易位到细胞核，通过绑定目标T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)转录因子推动下游转录的氨基端[75]。 既往研究已经表明β-catenin/WNT信号通路维系口腔鳞状细胞癌干细胞的重要作用：WNT通路活化剂或WNT抑制剂可以改变口腔鳞状细胞癌干细胞增殖率，而这种处理对亲代口腔鳞状细胞癌细胞的影响很小[76-78]。最近的一项研究表明，头颈部鳞状细胞癌中WNT通路的激活增加了肿瘤干细胞的成球能力和侵袭性[79]。 (3)EGFR信号通路：EGFR是一种跨膜蛋白，通过绑定特定的配体，包括表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGFα)，进而激活细胞内的信号级联控制细胞生长、分化和生存[80]。在头颈部鳞状细胞癌中可以观察到EGFR表达水平升高，EGFR信号通路活性增加与治疗耐药性和临床预后不佳相关[81]。在高侵袭性人乳头瘤病毒16(HPV-16)阳性的头颈部鳞状细胞癌细胞系UM-SCC-104中，EGFR的高表达促进了肿瘤干细胞比例增加[82]。此外，肿瘤干细胞表面标志物CD44可与EGFR相互作用，促进头颈部鳞状细胞癌的进展[83]。 (4)Notch信号通路：Notch信号在干细胞增殖、分化和自我更新等过程中起着重要的作用[84]。在哺乳动物中已经报道了4个Notch受体(Notch 1-4)和5个Notch配体(Jagged-1、Jagged-2、Delta-1、Delta-3和Delta-4)。当Notch受体被激活时，在细胞内的Notch(NICD)将从质膜中释放并转移到细胞核中，NICD与CSL转录因子一起诱导其靶基因的表达，如HES1、Hey1[85]。利用抗体或抑制剂抑制Notch1表达可抑制多种肿瘤的生长和肿瘤干细胞功能[86-87]。此外，Notch1抑制可降低头颈部鳞状细胞癌的肿瘤发生和肿瘤干细胞的自我更新能 力[88]。然而，也有研究报道Notch1可能是头颈部鳞状细胞癌的抑癌基因[89]。 2.3.3   影响口腔鳞状细胞癌干细胞的非编码RNA   在与肿瘤干细胞相关的各种分子中，非编码RNA (ncRNAs)被认为是获得和维持癌症干性的关键分子。越来越多的研究表明，这些ncRNAs的异常表达可以作为癌症的替代诊断标记甚至治疗靶点。 (1)Let-7家族：目前已知有12种不同的人类let-7家族成 员[90]。两个关键的RNA结合蛋白(LIN28A和LIN28B)被证明直接与Let-7前体蛋白结合来抑制let-7家族的生物学功能[91]。 此前已有研究发现，Lin28B/Let-7通路可以正向调控Oct4和Sox2的表达；此外，Let-7还诱导正常口腔鳞状细胞癌细胞向具有肿瘤启动和自我更新特征的肿瘤干细胞转化[92]， 并且Let-7a的过表达能够使ALDH1阳性的头颈部鳞状细胞癌细胞中Nanog表达下调[93]；在口腔鳞状细胞癌干细胞中异位过表达Let-7c和Let-7d可分别通过抑制IL-8和EMT标记物的表达来抑制肿瘤干细胞干性和肿瘤耐药[94-95]。总之，这些发现表明Let-7家族是口腔鳞状细胞癌干细胞的抑制因子。 (2)MicroRNA-200家族：miR-200的失调与肿瘤的形成有关。miR-200家族可通过直接靶向ZEB1或ZEB2调节肿瘤上皮-间充质转化[96]。长期以来，研究人员一直认为ZEB/miR-200反馈环控制着肿瘤干细胞的状态[97]。 在口腔鳞状细胞癌中，miR-200家族表达下调[98]，在头颈部鳞状细胞癌中，miR-200c/miR-141与ZEB1相互作用，过表达miR-200c/miR-141可抑制迁移能力[99]，减弱肿瘤的增殖和转移能力[100]。研究认为miR-200c、ZEB1/ZEB2和Bmi1之间的相互作用决定了口腔鳞状细胞癌干细胞的命运[101-102]，而p53突变可能损害miR-200c下游转录的激活，导致口腔鳞状细胞癌干细胞特征增强。 2.3.4   天然化合物靶向干预口腔鳞状细胞癌干细胞   近几十年来，包括口腔鳞状细胞癌在内的多种癌症类型中，天然化合物被越来越多地认为是靶向肿瘤干细胞的有效药物[103]。 有研究分析了120种来自天然产物Set Ⅱ的化合物，以确定这些化合物对黑色素瘤肿瘤干细胞群体细胞活力、细胞周期阻滞、细胞凋亡、基因表达、克隆存活和标签保留的影响，细胞毒性不高的化合物，如苔藓虫素1、西霉素A、伊律丁M、米舍拉明B和戊酮昔芬林等，可显著降低ABCB5阳性细胞的数量，该研究中选择的化合物差异改变了黑素细胞/黑色素瘤特异性小邻苯二甲酸相关转录因子和原癌基因c-MYC的表达[104]，对探讨天然化合物靶向治疗口腔鳞状细胞癌的研究具有重要的借鉴作用。 植物多酚姜黄素是一种有效的抗癌化合物，在体内外对顺铂诱导的头颈部鳞状细胞癌干细胞均有抑制作用[105]，此外使用姜黄素还能通过靶向非小细胞肺癌的肿瘤干细胞亚群来增强顺铂的疗效[106]。然而，姜黄素抑制肿瘤干细胞的具体机制仍然未知，其临床引用价值还有待进一步研究。 "