Role of Wnt/beta-catenin signaling pathway during tooth root development

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.28.021

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: Wnt/β-catenin signaling pathway plays an important role in tooth development and especially in
the root development, including the initiation of root development, Hertwig’s epithelial root sheath formation, root odontoblast and cementoblast proliferation and differentiation process.
OBJECTIVE: To explain the effect of Wnt/β-catenin signaling pathway on tooth root development.
METHODS: CNKI and PubMed databases were searched for the literatures concerning odontoblast and cementoblast proliferation and differentiation as well as Hertwig’s epithelial root sheath formation mediated by Wnt/β-catenin signaling pathway during root development. Finally 41 eligible articles were enrolled according to the inclusion and exclusion criteria.
RESULTS AND CONCLUSION: During the tooth root development, Wnt/ β-catenin signaling pathway can regulate Hertwig’s epithelial root sheath integrity, so the inhibition of signaling pathway will block Hertwig’s epithelial root sheath formation, further inducing the failure in root odontoblasts and cementoblast differentiation. Loss or overexpression of the signal transduction pathway will inhibit the proliferation and differentiation of odontoblasts, and appear with root dentin formation disorder. Effect of β-catenin signal on cementum differentiation can be regulated by cell origin or developmental stage, surrounding microenvironment and Wnt-related activator and inhibitor concentration, thereby promoting or inhibiting cementoblasts to different exents.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Cell Proliferation, Stem Cells

CLC Number:

R318

He Mei, Wu Jia-yuan. Role of Wnt/beta-catenin signaling pathway during tooth root development[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(28): 4556-4562.

Figures/Tables 1

2.1 Wnt/β-catenin 信号通路 Wnt信号通路是由细胞外的Wnt配体蛋白、细胞膜上的受体、细胞浆内的信号传导部分和核内的转录调控部分组成[11]。Wnt配体蛋白是一类分泌性糖蛋白，在哺乳动物中至少有19种被确定，是激活Wnt信号通路的关键蛋白。Wnt蛋白亦分为两类: ① Wnt1家族，包括Wnt1，Wnt3，Wnt3a，Wnt7a，Wnt7b及Wnt8a等，能有效激活经典信号通路；②Wnt5a家族，包括Wnt4，Wnt5a及Wnt11等，主要是激活非经典信号通路。Wnt信号转导途径主要分为：①经典信号转导途径，β-连环蛋白(β-catenin)是此信号转导途径的重要组成，又称Wnt/β-catenin信号途径；②Wnt/Ca2+信号途径；③GTPases介导的Wnt/JNK信号途径；④Wnt/平面细胞极化通路(planar polarity cell pathway，PCP)。经典Wnt/β-catenin信号通路是通过Wnt配体蛋白和有7次跨膜结构的受体(Frizzled，FZD)家族FZD1-10结合，以及在辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(co-receptors lipoprotein receptor-related proteins 5/6，LRP5/6)协同作用下启动信号传导。轴蛋白(Axin)负性调节经典Wnt信号通路，与糖原合酶激酶3β (glycogen synthase kinase，GSK-3β)、β-catenin、腺瘤性结肠息肉病基因蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)聚集形成一个复合物。在缺乏Wnt配体时，Axin，APC，GSK-3β、酪蛋白激酶(casein kinase，CK2)形成复合物，又称为降解复合物，使胞质内少量β-catenin被GSK-3β磷酸化，后又被蛋白酶降解。当Wnt配体与受体FZD结合，并在LRP 5/6的协同作用下，细胞质内散乱蛋白(dishevelled，DVL)和复合物蛋白被激活，使胞质内β-catenin部分被GSK-3β降解，而大量积聚在细胞质内的β-catenin转移到细胞核，形成活化的T细胞转录因子/淋巴增强子结合因子1(T cell transcription factor/lymphoid enhancer factor，TCF/ LEF1)转录复合物和调节靶基因表达的转录激活因子，如细胞周期蛋白D1 (cyclinD1)和骨保护素(osteoprotegerin，OPG)[12-15]。 2.2 Wnt/β-catenin信号分子牙根发育形成中的表达分布研究发现Wnt/β-catenin 信号参与牙根形成过程并在其特殊的部位表达，其表达具有时间、空间特异性。莫佳莉等[16]学者通过对Barx1，Wnt-1，β-连环蛋白(β-catenin)在SD大鼠磨牙牙胚发育的不同阶段表达进行研究，发现β-catenin 在大鼠磨牙胚中的表达具有明显的时空表达特性，提示在HERS形成前，牙囊细胞中Wnt/β-catenin 信号通路处于抑制状态。而出生后1 d和14 d野生型小鼠下颌第一磨牙牙间充质内β-catenin表达确有所不同，出生后14 d时β-catenin强烈表达于口腔上皮来源的Hertwig’s上皮根鞘和马拉瑟上皮剩余。说明随着牙根发育，HERS中Wnt/β-catenin信号通路被激活，并且信号不断增强[17]。出生2-5周龄C57BL/6小鼠，该鼠龄阶段分别是无细胞牙骨质形成的早期根系发育期和细胞牙骨质形成的后期根系发育期，2周下颌骨第一磨牙HERS中Wnt3a优先表达于HERS，牙乳头组织的成牙本质细胞和牙囊组织边缘区域也检测到其表达。5周龄小鼠HERS中Wnt3a消失，Wnt3a在根尖细胞性牙骨质检测到，而在无细胞牙骨质中未检测到。而且来源于HERS细胞的原发性上皮剩余马拉瑟上皮剩余中Wnt3a表达明显高于牙龈上皮细胞，牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞[18]。不同发育阶段磨牙Wnt/β-catenin 信号表达出现特异性：牙冠发育阶段，β-catenin在成牙本质细胞及上皮来源的细胞强烈表达；冠根过渡阶段，Smad4、Wnt10a在根部成牙本质细胞和其他部位成牙本质细胞特异性表达，β-catenin在所有的成牙本质细胞系细胞包括前成牙本质细胞中表达；牙根发育阶段，β-catenin在成牙本质细胞、HERS细胞和牙周膜细胞中表达，特别是在根部成牙本质细胞中高表达[19]。 Lohi等[20]发现在牙根发育过程中，胞质内对β-catenin 有降解作用的Axin2特异性表达。出生后10 d的野生型小鼠，Axin2在发育的牙根中高表达，主要集中在HERS和牙乳头；出生后12 d，Axin2在发育的HERS和牙乳头中表达；出生后15 d时，成牙本质细胞中Axin2表达减少，牙根部仍然保持较高的表达水平。上述结果提示在牙根发育中，Wnt/β-catenin 信号通路可能处于抑制状态，与前面Wnt/β-catenin 信号在牙根发育阶段的特异性表达结果相反。由于Wnt/β-catenin 信号通路分子机制尚未完全清楚，可能是其它的信号通路也加入调控过程的结果。 2.3 Wnt/β-catenin信号通路对根部牙本质分化形成的调控近几年研究发现Wnt/β-catenin信号通路参与牙根的发育过程并发挥重要作用，Wnt/β-catenin信号活化、抑制或缺失，将会导致HERS形成中断、根部牙本质和牙骨质形成异常，最终引起一系列牙根发育障碍。其发育障碍发生的分子机制是Wnt/β-catenin信号通路对根部牙本质分化形成进行调控，Wnt/β-catenin信号的缺失与过表达对根部成牙本质细胞产生一定程度的影响。 2.3.1 Wnt/β-catenin信号缺失对根部牙本质分化形成的影响 Bae等[19]学者认为在牙冠发育和牙根发育时发挥分化作用的成牙本质细胞有所不同，提出根尖成牙本质细胞的概念，牙冠形成中并没有发现成牙本质细胞，冠颈部形成过程中，牙本质细胞最先分化并分泌细胞外基质、胶原。同时，牙本质细胞信号进一步延伸到HERS。HERS细胞在根部牙本质形成后立刻分离并且进入Malassez上皮剩余(ERM)，位于HERS内侧前成牙本质细胞不断增殖，为牙本质细胞提供细胞来源，在牙根尖部发育过程中HERS保持完好直到根尖闭完成。 HERS通过前成牙本质细胞和牙本质细胞的增殖分化指导牙根的形成，伸长；在牙根正常发育过程中β-catenin在牙本质细胞高表达。实验发现β-catenin基因敲除的突变小鼠，牙本质细胞分化受阻和HERS中断，最终牙冠形态正常，而磨牙无牙根。说明牙本质细胞的分化并启动牙根形成和伸长需要β-catenin信号的存在，但可能对牙冠成牙本质细胞分化无影响。Zhang等[21]研究发现成牙本质细胞内CTNNB1(编β-catenin基因)缺失的小鼠，发现成牙本质细胞β-catenin信号能够调节成牙本质细胞的增殖和分化，该信号缺失导致HERS提前断裂，形成异常。使用特异性标记物K14染色观察HERS细胞增殖分化情况，突变小鼠出生后前8 d HERS细胞开始解离，第8天时HERS细长，不连续；出生后15 d时HERS出现空缺，并且无根面牙本质的形成。还利用BrdU检测CTNNB1突变小鼠HERS开窗过程中的细胞增殖情况，发现成牙本质细胞β-catenin信号缺失对HERS细胞的增殖凋亡的影响较小。 Kim等[22]研究发现牙根的形成与牙胚发育时期成牙本质细胞内β-catenin蛋白表达关系密切，特异性失活小鼠下颌第一磨牙牙胚成牙本质细胞内β-catenin蛋白导致无根磨牙和极薄的切牙形成。实验发现出生后7 d内的前两组小鼠磨牙胚发育没有明显差异；第8天，突变小鼠牙髓细胞凝聚，在颈环区域未见分化的成牙本质细胞、HERS内层细胞以及前成牙本质细胞形成，提示突变小鼠根部成牙本质细胞形成受阻和分化异常；第10天，突变小鼠HERS发生与正常相似的根尖处增生，但HERS内部的牙乳头间充质细胞向前成牙本质细胞分化减少，HERS的内层细胞缺失，外层细胞增生；根部成牙本质细胞产生牙本质过程中，成牙本质细胞分化中断，最终导致根部牙本质形成失败，牙根形成中断。 Zhang等[23]通过对敲除β-catenin基因(CTNNB1)的突变小鼠和野生型小鼠牙齿发育过程进行研究发现，突变小鼠磨牙无牙根，牙周组织结构不完善。突变小鼠牙根发育过程中的成牙本质细胞和成牙骨质细胞内无β-catenin蛋白表达。突变小鼠成牙本质细胞分化相关基因：Ⅰ型胶原α1链(COLIα1)，骨钙素(osteocalcin，OCN)和牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoproteins，DSPP)低表达甚至不表达，根部成牙骨质细胞中骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)低表达。提示其磨牙根部成牙本质细胞和成牙骨质细胞分化受到明显抑制，最终导致根部无牙本质及牙骨质形成。 Lim等[24]及Bae等[25]通过对野生型小鼠和Wnt基因缺失的突变小鼠进行研究，发现出生28 d后的突变小鼠下颌第一磨牙牙本质厚度降低，牙髓腔明显增大，根管腔扩大且牙根短小，随年龄增长根管长度增长的速度仅为野生型的一半；实验还通过免疫组织化学染色发现Wnt基因缺失的突变小鼠β-catenin表达较低，根部成牙本质细胞内Wnt10a和AXIN2表达显著下降，磷酸调节肽在成熟的成牙本质细胞和牙本质基质中表达明显降低，蛋白聚糖在前期牙本质内表达降低。以上结果提示Wnt信号缺失，影响牙本质基质的分泌及成牙本质细胞的两极化。 Lim等[26]发现Wnt信号下调牙本质、牙骨质表达量和特征都会发生异常，Wnt信号下调后，RANKL的表达上调，骨保护素的表达下调，破骨细胞活性增加，成骨细胞活性降低。其磨牙牙根牙骨质在破骨细胞的影响下大量吸收，牙根表面有不同程度的凹陷，在釉牙骨质界最为明显，牙根广泛吸收，根部多部位牙本质牙骨质都被侵蚀。可以认为Wnt/β-catenin信号通路下调后，导致RANKL表达异常，造成骨吸收活动幅度增强，牙根吸收。 Vogel等[27]发现Notum基因敲除的小鼠磨牙牙冠形态正常，但其表面覆盖严重发育不良的牙本质，牙根短小，根部牙骨质缺损导致管壁薄、形状不规则，牙周组织由不规则牙周膜纤维与骨膜连接。Notum作为一种分泌型酶，通过去除部分棕榈酰化Wnt蛋白来调节Wnt信号通路，以上说明在敲除Notum状态下，Wnt/β-catenin信号受阻处于抑制状态，根部牙本质和牙骨质发育形成障碍。 2.3.2 Wnt/β-catenin信号过表达对根部牙本质分化形成的调控 Wnt/β-catenin信号缺失后，通常会导致成牙本质细胞分化障碍，牙根发育不全。同样，wnt信号分子过表达也会导致牙根的发育异常。Bae等[28]证明在牙根发育过程中过表达β-catenin将会影响细胞分化和基质分泌，牙根部牙本质的二聚糖、牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白及Dickkopf相关蛋白1 (Dickkopf related protein 1，DKK-1)表达上调。此外，成牙骨质细胞中核苷酸内焦磷酸酶/磷酸二酯酶1显著下调，根部牙骨质中骨涎蛋白表达下调。最终导致出生4周后β-catenin过表达的小鼠磨牙根长度是同龄野生型小鼠牙根长度的一半，并且其磨牙冠部牙本质形成过度，根部牙本质较薄且矿物质少，但根部牙骨质过度沉积。以上结果提示β-catenin信号对不同牙齿发育阶段成牙本质细胞分化和基质分泌影响不一致，过表达的β-catenin信号对冠部牙本质形成起促进作用且对根部牙本质形成起抑制作用，而对牙骨质形成具有促进作用，以上结果与Bae等[19]学者通过实验提出的β-catenin对冠部牙本质和根部牙本质形成的调控机制有所不同一致。 DKK-1是Wnt/β-catenin信号通路的有效抑制剂，Han等[29]发现过表达DKK-1的突变小鼠出生4、6周时第一磨牙呈畸形，牙冠减小、短根、髓腔/根管腔扩大；第二磨牙比同龄对照组明显较小，第三磨牙缺失；定量资料的分析表明，突变小鼠牙齿全长、根长、牙根/牙齿全长的比值均降低。实验发现牙髓细胞和成牙本质细胞DKK1过度表达，导致成牙本质细胞分化延迟，大量不成熟的成牙本质细胞形成，牙本质小管也明显减少，最终形成较少而又发育不良的冠部和根部牙本质，牙根发育不全。 2.4 Wnt/β-catenin信号通路对根部牙骨质分化形成的调控 Wnt/β-catenin信号通路除了参与成牙本质细胞分化调控外，学者还发现其对成骨细胞成骨和基质的分泌的调控作用。稳定的β-catenin信号能促进根部成牙骨质细胞增殖和分化，根部过度形成牙骨质。其相关的分子机制是β-catenin信号稳定的成骨细胞中Ⅰ型胶原α1链、骨涎蛋白的表达增加，促进成牙骨质细胞的分化，FGF23和牙本质基质蛋白在牙骨质和牙槽骨表达降低，增强牙骨质的形成和矿化[17]。 Osterix (OSX)对牙根部牙本质和牙骨质的形成至关重要，研究发现OSX基因敲除小鼠的冠部牙本质小管和牙本质基质没有明显变化，而在根部牙本质中牙本质基质蛋白和牙本质涎磷蛋白表达下降，成牙本质细胞分化受抑制，导致根部牙本质含有较少的牙本质小管[30-31]。Cao等[32]实验发现OSX过表达成牙骨质细胞中，DKK1的表达急剧增加而β-catenin蛋白与核转运大幅度减少，牙骨质形成相关的重要标志物骨桥蛋白(osteoprotein，OPN)、骨钙素及骨涎蛋白在mRNA和蛋白水平上调，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性增加。以上的结果提示OSX基因过表达使得成牙骨质细胞分化加速，是通过上调DKK1抑制Wnt/β-catenin信号通路导致的。 Nemoto等[18]发现Wnt3a可以通过上调经典的Wnt信号通路，促进牙囊细胞(dental follicle cells，DFCs)ALPL基因表达和增加碱性磷酸酶的活性，无细胞牙骨质牙骨质和细胞性牙骨质需要适当的碱性磷酸酶的存在[33]。Yang等[34]发现Wnt3a可提高与HERS细胞共培养的牙囊细胞的成骨分化相关基因碱性磷酸酶，骨涎蛋白，骨钙素，ACTB和COL1的表达，说明选择性上调Wnt/β-catenin信号可以促进与HERS细胞共培养的牙囊细胞的成骨分化，生成更多的牙骨质。 Liu等[35]学者发现Wnt3a/DKK-1能够上调/下调脂肪干细胞(adipose tissue-deprived stem Cells，ADSCs)中Wnt信号通路：使用同一来源的脂肪干细胞在相同的条件下，通过Wnt3a上调其Wnt/ β-catenin通路后，牙骨质附着蛋白、碱性磷酸酶、骨涎蛋白、骨桥蛋白的表达减少；通过DKK-1下调其Wnt/ β-catenin通路后，CAP、碱性磷酸酶、骨涎蛋白和骨桥蛋白表达明显上调，脂肪干细胞分化为成牙骨质细胞样细胞。 Wnt经典信号通路激活剂LiCl及Wnt3a上调体外培养的成牙骨质细胞内Wnt/β-catenin信号通路后，骨向分化相关基因碱性磷酸酶，骨钙素，骨涎蛋白，Runx2及Osterix 的表达受到显著抑制，而cyclinD1的表达上调。并且DKK1能减弱Wnt3a对Wnt/β-catenin信号通路的上调引起的成牙骨质细胞内核心结合因子2(run-related transcription factor 2，Runx2)和骨钙素表达降低程度。则可以认为上调Wnt/β-catenin信号通路能抑制成牙骨质细胞骨向分化，促进细胞增殖，并可以通过Wnt经典信号通路抑制剂DKK-1减弱这种抑制作用[36]。还有研究发现经典Wnt信号通路的活化对牙骨质再生有诱导作用，通过体内局部注射氯化锂、硬化蛋白抗体和局部注射β-catenin过表达慢病毒载体途径激活经典Wnt信号通路，最终形成大量新生细胞性牙骨质沉积和牙周韧带纤维组织。通过人牙周膜纤维细胞(human periodontal ligament cell，hPDLCs)体外培养实验，发现Wnt信号通路激活剂显著增加矿化物形成和碱性磷酸酶活性，骨钙素、骨桥蛋白、牙骨质蛋白1、CAP显著表达。以上结果提示激活Wnt信号通路可体内诱导牙骨质再生和体外诱导牙周膜纤维细胞分化形成牙骨质[37]。上述两个研究，同样都是上调Wnt/β-catenin信号通路，前者出现抑制成骨细胞成骨分化，而后者却出现相反的调控效应，可能是由于β-catenin对成牙骨质分化调控结果可受细胞的来源或发育阶段，周围所处的微环境及Wnt信号相关激活剂和抑制剂浓度影响。 Bae等[38]学者还发现Wnt信号上调还会影响小鼠根部牙骨质发育类型，使其根颈部无细胞性牙骨质区出现大量与野生型小鼠相似的细胞性牙骨质，尤其是在牙骨质-牙本质交界处，实验还通过增加基质沉积而未激活Wnt信号，发现根颈区未见细胞性牙骨质的形成，由此可以推测Wnt信号通路在细胞性牙骨质形成过程中起关键作用，在牙根发育过程中Wnt信号激活，可使无细胞牙骨质向细胞牙骨质发生转化。 2.5 Wnt/β-catenin信号通路与其他信号通路共同调控牙根发育在牙根实际发育的微环境中，往往是多种信号通路调控的结果，Wnt/β-catenin信号通路在牙根发育中发挥重要作用，并可通过与其他信号通路共同调节牙根的形成和发育。杨珊等[39]发现在成牙骨质细胞加载牵张应力3，6，12 h后，细胞内β-catenin信号蛋白的表达增高，同时发现胞Runx2的表达上升，则可以认为在张应力刺激下，成牙骨质细胞内 Wnt/β-catenin信号通路被激活从而促进成骨细胞的成骨效应；然而使用DKK1抑制成牙骨质细胞内Wnt/β-catenin信号通路活性后，发现胞内Runx2基因的表达下调，说明Wnt/β-catenin信号通路是通过调控成骨因子Runx2的表达，从而促进成牙骨质细胞的成骨效应。同样，在HERS形成时期，Zhang等[21]认为小鼠成牙本质细胞β-catenin信号通过与骨形态发生蛋白信号通路互作保持HERS细胞完整性，进而调节HERS发育形成。β-catenin基因缺失小鼠牙根部位细胞中，骨形态发生蛋白7表达显著上调，而最接近HERS的成牙本质细胞中Noggin和卵泡抑素表达明显减少，最终导致HERS细胞解离，HERS结构异常，牙本质和牙骨质形成障碍。上述研究结果在体外实验中也得到验证。在对根尖牙乳头干细胞(Stem cells from the apical papilla，SCAP)成骨及成牙本质分化的一项研究中发现，抑制根尖牙乳头干细胞的β-catenin表达后，骨形态蛋白9诱导体外培养的根尖牙乳头干细胞中骨钙素和骨桥蛋白的表达减少，碱性磷酸酶活性明显减弱。提示β-catenin基因沉默后骨形态蛋白9诱导根尖牙乳头干细胞成骨及成牙本质分化能力明显下降，Wnt/β-catenin信号在其诱导作用中发挥了重要作用[40]。 Silverio等[41]发现骨形态发生蛋白2通过Wnt/β- catenin信号通路诱导牙囊细胞的成骨分化，上调成牙骨质细胞前体细胞牙囊细胞(小鼠svf4细胞)的经典Wnt信号通路后，骨形态发生蛋白2诱导该细胞分化作用受到抑制。β-catenin基因敲除的小鼠svf4细胞，骨形态发生蛋白2诱导该细胞分化相关的标志表达明显降低，说明骨形态发生蛋白2需要Wnt/β-catenin信号促进该细胞分化成熟；Wnt3a激活Wnt信号通路后使用骨形态发生蛋白2刺激，与对照组未处理的细胞相比，小鼠svf4细胞Runx2，碱性磷酸酶及骨钙素的转录下调。以上结果表明Wnt3a上调Wnt/β-catenin信号后，将抑制骨形态发生蛋白2诱导svf4细胞向成牙骨质细胞/成骨细胞分化。"

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