The research and application of cardiovascular path in congenital heart disease

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.026

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: Tissue-engineered cardiovascular patch plays a decisive role in the surgical treatment of congenital heart diseases. Its construction strategies are rich and flexible. This kind of patch has a wide range of application in basic and clinical research.
OBJECTIVE: To review some progresses in the surgical application of cardiovascular patch in congenital heart disease and the methods to construct the tissue-engineered cardiovascular patch.
METHODS: PubMed, Medline, CNKI and ClinicalTrials.gov were searched by computer for articles related to classification, design, basic and clinical research of tissue-engineered cardiovascular patch were published between January 2001 and December 2016. The keywords were “cardiac tissue engineering, pericardium patch, stem cell, congenital heart disease, congenital heart conditions, CHD” in English and “cardiac patch, vascular patch, cardiovascular patch, congenital heart disease” in Chinese. Finally, 32 articles were included in result analysis
RESULTS AND CONCLUSION: With the development of human stem cell biology, materials science and testing technology, the tissue-engineered cardiovascular material is expected to achieve standardization and industrialization management. However, subsequent problems need to be solved, for example, the specific implementation of a three-dimensional vascular design strategy, the loading proportion of a variety of seed cells, pre-clinical quality control and industrial management standards, as well as the close international cooperation that can promote the overall healthy development of the industry.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Heart Diseases, Biocompatible Materials, Tissue Engineering

CLC Number:

R318

Mi Fang, Yu Li-mei, Zhao Chun-hua. The research and application of cardiovascular path in congenital heart disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(10): 1635-1640.

Figures/Tables 1

2.1 先天性心脏病的发病情况和治疗现状先天性心脏病是出生缺陷中最常见的一类(占全部活产的1%)[1]，中国是世界上先天性心脏病发病率较高的国家之一，发病率占全部活产婴儿的0.7%-0.8%；每年有15万-17万先天性心脏病新生儿患者，约10万患者需要手术治疗[2]。一般先天性心脏病中仅有极少数类型可以自然恢复，部分良性先天性心脏病常由于缺乏症状而被漏诊，如最常见的室间隔缺损(所有先天性心脏病的50%)[3]，其余约20%的房间隔缺损和其他有危及生命的患者均需要手术干预[4]，这些先天性心脏病患者随着年龄的增大并发症逐渐增多，病情逐渐严重，选择何种方法治疗以及正确的手术时机主要取决于其先天畸形程度。自1964年Dotter等开创血管介入治疗以后，随着实验、临床、介入材料和手术仪器的创新进展，尤其是1997年Amplatzer封堵器的临床应用，使先天性心脏病介入治疗的种类和数量迅速增加，经导管介入治疗的主要指征如年龄、缺损大小、形态、合并症等要求逐渐拓宽，许多特殊类型的房间隔缺损(atrial septal defect，ASD)、动脉导管未闭(patent ductus arteriosus，PDA)、室间隔缺损(ventricular septal defect，VSD)可通过介入治疗手段获得根治，许多介入治疗替代了传统的外科开胸手术，先天性心脏病传统治疗方法发生了根本性转变。与此同时，镶嵌治疗的思路使得先天性心脏病从单纯手术治疗或单纯介入治疗转向手术和介入共同治疗，这种外科治疗和介入治疗相互结合、联合应用的治疗模式称为镶嵌治疗。二者相互支持，互为保障，协同治疗某些复杂的先天性心脏病。不同于成年人心血管疾病的是，一般需手术治疗的先天性心脏病常需要直接使用自身或外源性的组织材料来修复畸形和缺损或扩大狭窄的结构，从而最大程度上还原到正常的结构以维持心脏和大血管的重要生理功能，以法洛氏四联症为例，有不到50%的患者术中进行了右室流出道的修补[5]。目前的生物补片多用于心脏、大血管的修补和钙化预防，如主动脉瓣置换、右室流出道修补等，亦有主动脉置换过程中常见的瓣环钙化、瓣周囊肿等需用补片辅助修复的手术。由于修补材料自身的缺陷和来源受限等原因，临床上在面临较大范围的组织缺损修复时仍存在诸多问题，且因部分先天性心脏病患儿畸形程度不同，常需要在几年之后施行计划内的二次手术，首次术中心脏和大血管的损伤和长时间手术操作会增加术后粘连[6]，延长了患者再手术的时间，增加了开胸难度，心外膜粘连作为首次心脏手术后最常见的并发症逐渐受到临床关注，心包缺损带来的远期并发症也逐渐引起重视，心外膜粘连极大地增加了后续手术的难度，延长了手术时间，也易导致胸骨后组织结构意外损伤，引起难以控制的出血或心脏损伤，影响患儿愈后和生存率。Guo等[7]报道，在二次胸骨切开术中，大血管损伤的概率为2%-6%；合并出血时，患者死亡率高达39%。因此，避免在胸壁、心包和心肌之间形成粘连是非常有必要的，尤其是在相对年轻、可能产生各种并发症的患者和未来可能会接受分期手术的小儿患者。心外膜粘连的预防也与其他身体部位不同，由于心脏是一个不断运动的悬垂器官，必须防止心包在所有三维平面中的粘连，并积极重建其周围的解剖结构。目前临床上对由这一系列手术带来的心包缺损大多不做干预，一是由于术后诸多情况使得缝闭心包不能如愿，二是大块缺损后直接缝闭心包会造成张力过大而压迫心脏及其移植物，导致血流动力学异常，引起回心血量和心排量受限。首次心脏外科手术后有27%-40%的患者出现房颤，相关并发症还有栓塞、血流动力学异常、室性心律失常等，虽然术后心房颤动的病因有很多，但是病理生理学显示，炎症标志物和炎症递质的存在与其有极大的相关性，这些物质的存在可能与血栓形成前内皮细胞损伤、内皮功能障碍以及房颤患者血小板活化有关[8]。这些研究成果对探索新的治疗方法以降低术后粘连和并发症方面有指导性意义。多年来，聚合物(聚四氟乙烯、涤纶等)、异种移植替代物(如牛心包补片)和自体心包等一直是先天性心脏病手术中最常用的修补材料。然而，人工合成材料或脱细胞材料不能随着患儿的发育继续生长，常需要二次手术更换，与周围组织有着不匹配的力学性能，缺乏收缩性，可能导致心脏输出功能异常；有的甚至会引起免疫反应，在移植部位产生炎症反应和纤维化改变。取自自体心包的替代材料虽然有良好的韧性和延展性，但取材来源有限，不能完全满足临床需求；另外一些补片需要负载具有导电性能的细胞，缺乏导电性的材料可导致折返环路周围的去极化，持续的去极化会进一步导致心律失常、心房纤颤等并发症。与此同时，科研人员也开始逐渐探索运用心包替代材料解决术后粘连的问题。对膨体聚四氟乙烯补丁、戊二醛固定的牛或猪心包补片、硅胶、凝胶材料等进行了动物模型实验[9-11]。随着研究的不断深入，近年来研究的重点已转向研发生物可吸收预防粘连材料[12]，如聚乳酸等[13]。然而，临床上还没有实现常规应用心包替代材料，也缺乏可靠的证据证明它们在临床中的实际作用。综上所述，理想的组织工程心血管补片，应当来源充足，易于处理，生物相容性好，耐久性强，无抗原性，不与周围组织产生粘连，不产生血管斑块和血栓，不带来与其有关的并发症，具有一定的韧性和抗拉性，最好能达到与同源自然组织相匹配的机械强度，心肌组织还应当有一定的电传导性，此外，心包替代物还应具有贴合性良好，血液和渗液不易积聚于皱褶中产生粘连等特点。 2.2 组织工程心血管补片的设计策略目前组织工程心血管补片已采用的基本设计策略有两种，每种方法都各有优点和缺点。第一种方法主要预计将种子细胞负载于支架上，种子细胞要在支架内生长并最终取代支架，支架需提供必要的机械支撑并要求有一定的顺应性[14-16]。利用该设计思路设计的组织工程补片包括常规植入的一些脱细胞支架组织，在外科手术中，已经用于治疗某些先天性心脏疾病，纠正心肌实质的畸形等[17]。然而，这种设计思路的组织工程补片未能良好地控制细胞与生物材料之间、细胞与细胞间的黏附和信号沟通问题，未能良好地整合基底膜的功能。第二种设计策略更适合分层结构清晰的血管组织[14]，主要思路为分层构建支架各层并整合组建。搭载在支架上的细胞能够分泌自身的细胞外基质，理论上没有细胞组件的细胞也能够长成和原生组织极为相近的组织。细胞的定位生长可以由铺设于基层的细胞层来控制[16]。这种方法的关键点在于：二维空间生长的细胞层从基板分离后应用于较大组织结构中的无细胞支架技术[14]。这种方法使细胞损伤较小，细胞间结构能够完善保存。尤其需要注意的是，在组织工程血管的设计和构建上，对材料的耐久性和机械强度有很高的要求[18]。心血管组织主要由胶原纤维和弹性纤维维持支架的机械强度和柔韧性，并且在原生组织中还有一个很重要的结构：基底膜，基底膜有大量蛋白质纤维和水合糖胺聚糖链网状纤维，有细胞附着点，能够支持细胞生长[19]，原生组织中的细胞可以根据体内环境动态维护和改造由结构支架和基底膜构成的细胞外基质[20]，更有些情况需要支架上能够负载与自身组织匹配的具有收缩性和传导性的心肌细胞或内皮细胞，它们能够随着患者的发育共同生长，从而促进心脏和大血管的功能恢复[21-22]。 2.3 组织工程补片支架常用材料水凝胶作为组织工程的载体早已被学术界公认，解决水凝胶技术问题主要有3个关键点：水凝胶的来源、铸造模具和锚固结构。目前水凝胶主要来源有Ⅰ型胶原蛋白、基底膜、纤维蛋白和它们的混合物；在凝胶过程中，水凝胶包裹细胞，根据模具的三维形态支撑其位置，允许2个以上锚定点种植组织并逐渐形成雏形组织的机械张力。天然来源的水凝胶能刺激种子细胞生长，促成细胞间连接，减少水分时可以收缩，机械稳定性较低，不能制作大型组织工程补片，但易于自动化生产和标准化测量，非常适用于药物筛选等体外实验[14]。以海藻酸钠、胶原蛋白，明胶海绵，聚乳酸/聚羟基乙酸复合材料等为来源的预制多孔固体基板也能够负载种子细胞，技术优势是能够设计为任何所需要的三维结构。组织工程补片可以动员和聚集原生细胞，通过调整植入补片的机械性能，如弹性、压缩性、密度和降解速率等，选择性地黏附和增殖特定类型的细胞[23]。丝纤连蛋白水凝胶已被证明能够提高材料的生物活性，聚集原位内皮细胞，促进血管生长[24]；也可以通过化学手段预先在生物材料上负载一些生长因子等生物分子，促进负载的细胞向特定类型的细胞转化或增殖迁移[25]。最具代表性的成果是用胶原海绵制作出了慢性电起搏器这种具有三维组织结构和功能的组织工程材料，其原因可能是由于天然材料相比于人工聚合材料能够为细胞提供一个更好的生长环境[26]。Syedain等[25]用纤维蛋白凝胶培养人成纤维细胞进行动脉移植，机械拉伸测试显示细胞移植补片能够承受羊股动脉50%以上的压力。相比于水凝胶，经过处理后的脱细胞生物材料，保存的是天然的生物结构和细胞外基质，有助于细胞重塑和细胞外基质的聚集，可以提高材料的生物相容性和细胞黏附增殖的能力，降低宿主免疫反应。负载成纤维细胞的组织工程纤维蛋白心脏瓣膜与同种异体移植的瓣膜有相似的力学性能，并且能够控制和改善细胞再生潜力。Weber等[27]报道，在狒狒体内，负载人成纤维细胞的类纤维蛋白凝胶心脏瓣膜的动态拉伸效果优于脱细胞移植对照组。因此水凝胶是目前组织工程补片中最重要的种子细胞载体。 2.4 组织工程补片常用种子细胞早在1998年，研究人员便利用塑料培养瓶中培养的心肌细胞，分离出一个单层细胞片结构，结合温敏型涂层材料，在室温下将几种细胞生成的单层细胞片叠加起来，尝试制作完整的组织工程心血管支架。但由于心肌细胞并不能够正常扩增，所以科学家考虑使用能够转化为心肌细胞的细胞，从文献中可知，目前的细胞来源包括：胚胎干细胞、诱导多能干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、脐血干细胞、羊水来源干细胞等[14,28-29]。干细胞做为再生医学中组织工程化体系中重要的种子细胞，在多种动物模型体内进行了实验，如心血管缺陷小鼠模型体内血管生成实验[30]，各类缺血和梗死模型等。负载骨髓间充质干细胞的组织工程补片做为功能性血管移植物被成功移植后，已经开展了临床试验[31]。研究较多的是诱导多能干细胞，其来源广泛，不受伦理限制，解决了免疫排斥问题，体细胞转化效率也在不断改进，研究热度经久不衰。但目前仍然面临的问题是心肌细胞在支架中的分布和比例问题，只负载单一种子细胞的组织工程心脏组织，难以控制心肌细胞和非心肌细胞的比例，最后获得的补片质量难以满足临床需求。正常心肌组织由40%的心肌细胞和60%的非心肌细胞构成[4]，而非心肌细胞支持心肌细胞生长，是心脏组织的重要结构。一项划时代的研究是使小鼠心脏完全脱细胞(SDS和Triton X-100灌注)，只保留结缔组织和血管，利用完整的心脏支架负载人多能干细胞来源的多能心脏祖细胞，这项研究证明了脱细胞支架结合人诱导多能干细胞源性心血管细胞可以获得组织工程心脏组织，只是重建的心脏细胞分布不均匀。还有一些经过特定目的基因转染的种子细胞也被逐渐应用于组织工程补片，如Boccardo等[32]利用基因修饰的骨髓间充质干细胞控制血管内皮生长因子体外诱导血管生成。同时，心肌细胞培养成熟程度也是影响组织工程心血管补片质量的重要因素。体外培养条件对组织工程心血管补片最终成熟程度有很大的影响，例如培养时间、培养基条件、氧和营养物质的供应等，制作组织工程心血管补片时应当优化各项条件并将优化后的条件结合应用。由于心脏代谢异常活跃，在心脏发育的不同阶段中，心肌细胞代谢程度不同。这些代谢变化在心肌细胞增殖分化的中末期有重要的影响，成人心脏主要是由脂肪酸的氧化代谢供能(碳水化合物只占能量供应很小的一部分)，而胎儿的心脏主要靠糖酵解供能，标准培养基以葡萄糖为基础，不含脂肪酸，一般需要添加脂肪酸和体积分数为5%-10%的胎牛或马血清，但目前的研究并未明确这些成分用于代谢的量是多少，也不明确血清对心肌细胞培养的影响。"

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