Tissue-engineered cartilage scaffold materials: present and future

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.021

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: As is known to all, cartilage tissue engineering has three elements, seed cells, scaffold materials, and cytokines. Scaffold materials play an important role in cartilage tissue engineering.
OBJECTIVE: To search and review the literatures about tissue-engineered cartilage scaffold materials in the last decade, and to discuss problems and the development direction of the scaffolds.
METHODS: A computer-based search of relevant articles published from 2006 to 2016 was conducted in PubMed and CNKI using the key words of “cartilage tissue engineering, natural scaffold materials, synthetic scaffold materials, composite scaffolds, nanometer materials" in English and Chinese, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Scaffold materials in cartilage tissue engineering have different sources and kinds. Natural materials, synthetic materials and nanometer materials have their own advantages and disadvantages. Any single material is difficult to meet the clinical requirements of the cartilage. Material compounds with different proportions can be used to prepare scaffolds with good mechanical properties, high porosity, good compatibility and degradation. But there are still some problems, such as excessive speed of scaffold degradation and excessive cell growth. The current research is in in vitro experimental stage mostly, and the application in clinic has not been enforced yet due to small size and lack of a long-term follow up.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Cartilage, Tissue Scaffolds, Tissue Engineering

CLC Number:

R318

Zhou Yong, Zhu Wei-min, Peng Liang-quan, Wang Da-ming, Liu Wei, Xu Xiao, Wang Da-ping. Tissue-engineered cartilage scaffold materials: present and future[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(10): 1604-1610.

Figures/Tables 1

2.1 天然高分子材料目前许多天然高分子已被用于软骨修复。其中一些材料，如胶原、透明质酸及纤维蛋白等已用于临床。现用于软骨损伤修复研究的天然高分子材料有胶原、右旋糖苷、藻酸盐、壳聚糖、血纤蛋白、硫酸软骨素等。大多数天然高分子材料具有良好的生物相容性、可降解性和易溶解等优点。但天然材料也有力学强度差、免疫原性及潜在的传递动物病原体风险等不足。胶原蛋白在哺乳动物组织中来源丰富，是一个有吸引力的材料，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型胶原。胶原蛋白是一种生物蛋白，甘氨酸和氨基酸含量较高。胶原蛋白易降解，免疫原性低且易与细胞结合。这些软骨组织工程的特性使其成为一个有价值的材料[6]。Ⅱ型胶原是软骨组织的主要成分，其降解产物可完全被机体吸收，并有保护细胞的作用。黄彰等[7]通过软骨细胞与Ⅱ型胶原复合，经过管帽结构构建成细胞-支架复合体，植入有直径4 mm软骨缺损兔的膝关节内，12周后可见组织工程软骨与周围正常软骨高度、颜色和质地均相近，表面光滑，覆盖整个缺损区，与正常软骨间界限几不可辨。然而基于胶原的水凝胶也面临降解速率过快的问题，这会导致凝胶的力学性能不稳定[8]。透明质酸作为一种天然高分子聚合物，拥有良好的耐磨性及抗压缩性能，被广泛用于组织工程。其主要分布在人体关节部位，通常透明质酸被制成一种可注射水凝胶来填补缺陷或退化区域的软骨组织[9]。透明质酸凝胶较弱的机械性能、较高的膨胀性能、光滑表面结构及不抗酶解等也制约了其在组织工程学上的应用。因此，为提高其作为组织工程支架的可能性，需进行必要的化学改性来弥补其缺陷，选择其他生物材料与之复合是一种较好的方法[10]。Jaipaew等[9]构建不同比例的蚕丝/透明质酸复合水凝胶，并与人脐带间充质干细胞共培养，通过检测细胞活性、组织化学、免疫活性及对支架进行电镜扫描与力学测试等，检测ColⅡa、Agg及Sox9的表达量，得出蚕丝/透明质酸复合支架在软骨组织工程及骨科手术中是很有意义的。壳聚糖已被广泛应用于多种组织工程研究，其结构与天然黏多糖相似，是一种带有正电荷的生物可降解氨基多糖[11]。壳聚糖表面是亲水性的，因此它能够促进种子细胞的黏附、增殖和分化，病理性炎症反应率和诱发感染及内毒素率低，同时抗菌能力好，使其成为最重要的生物材料之一[6]。由于其与黏多糖结构相似，壳聚糖已被广泛用于支架的制作。杨萌等[12]将滑膜间充质干细胞与壳聚糖支架材料复合，于SD大鼠体内共培养，8周后细胞向材料中心生长，几乎布满整个支架材料且Ⅱ型胶原呈阳性表达。Rami等[13]研究证实，壳聚糖浓度、乙酰化程度及凝胶化过程都对最后形成的凝胶理化性能、机械性能有至关重要的影响。由高度乙酰化的壳聚糖制备的凝胶是软的，力学性能差；而由低程度乙酰化的壳聚糖制备的凝胶拥有更好的弹性、细胞黏附及在恢复组织新生血管方面更好。藻酸盐已被广泛应用于医药行业，最常见的应用是细胞的包装及药物的控释[14]。藻酸盐易成胶、低毒性且易于获得，这是其被广泛应用的原因。藻酸盐水凝胶可在缺乏有机溶剂的情况下，通过低温交联的方法制成不同形状的水凝胶。一些研究显示，将藻酸盐与软骨细胞共培养并注射于研究区域，4周后软骨细胞存活良好，并且产生与软骨相一致的细胞外基质蛋白。Gonzalez- Fernandez等[15]研究证实，海藻酸钠水凝胶可封装表面生长因子转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2，在封装的水凝胶内，转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2成功转染了骨髓间充质干细胞，并通过对Ⅱ型胶原及硫酸糖胺聚糖的检测证实骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。因天然高分子材料具有良好的生物相容性及可降解性而被广泛应用于软骨组织工程研究中。但是，单一或几种高分子材料复合制成的支架材料往往有力学性能差和降解速率不可控的不足。人体关节软骨在活动时会受到各个方向的压力及剪切力，并且软骨修复大概需要3-6个月，在这个过程中如果支架材料一旦发生坍塌或降解，将明显影响软骨修复效果。天然高分子材料往往有不同的异构体，不同异构体之间的性能也不尽相同，制备过程中需对材料有足够的认识。 2.2 人工合成材料人工合成支架材料是指应用物理化学等方法合成的可替代细胞外基质的高分子聚合物，主要优点为材料来源不受限制，可根据需要对其化学、物理及生物学性能进行调控。但人工合成材料的组织相容性较天然支架材料差。人工合成材料主要分为无机材料和有机材料。常用于软骨组织工程研究的人工合成材料有聚己酸内酯、聚羟基乙酸、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚及聚乙烯醇等。聚己酸内酯是由己酸内酯的均聚物和共聚物通过开环、加聚得到的半结晶性的线性聚合物，其特点是低降解率、高孔隙率并可调、无毒性及亲水性较低。Vikingsson等[16]将聚己酸内酯支架与软骨下骨锚定系统复合植入山羊膝关节软骨缺损处，并与单纯的微骨折术对比。4.5个月后，75%的缺损都完全或大部分完全修复，并且聚己酸内酯支架复合软骨下骨锚定系统对组织的修复效果好于微骨折术，同时避免了行微骨折手术的必要。聚乳酸是一种可降解的被广泛研究的人工合成材料。聚乳酸以3种形式存在于大自然中，分别是左旋聚乳酸、右旋聚乳酸及外消旋混合物。Cohen等[17]制作聚羟基乙酸-聚乳酸支架并于内部填塞藻酸盐，发现其产生的蛋白多糖及Ⅱ型胶原的表达远远大于Ⅰ型胶原。薄冬营等[18]以左旋聚乳酸为原材料，与1，4-二氧六环/水均匀混合，制备了具有分级多孔结构的组织工程支架，后又与细胞复合，通过扫描电镜检测可明显看到细胞黏附在支架微孔上，并且伸入大孔内部。Nava等[19]通过溶剂浇铸-颗粒浸泡的方式制备聚乳酸-三亚甲基碳酸酯复合支架材料，严格控制支架孔径大小及孔隙率。他分别制备3种不同孔径及孔隙率的支架材料，第1种孔径大小50-100 μm，平均75 μm；第2种孔径100-150 μm，平均125 μm；第3种孔径在150-200 μm，平均175 μm。将3种不同的支架材料分别与牛的软骨细胞复合培养 14 d，通过组织切片、PCR、western-blot及扫描电镜观察得出，在第1组中总DNA含量最高，糖胺聚糖蛋白含量最高，而在第3组中发现胶原含量最高。他还发现孔径大小与细胞密度呈正相关，与细胞代谢活性及细胞外基质的合成呈负相关。他还建议在开始复合培养时，尽量选择圆形、较小孔径的支架材料。聚乳酸-聚羟基乙酸共聚为聚羟基乙酸与聚乳酸按照一定比例混合形成的共聚物，是一类典型的可完全生物降解合成材料。因其具有优良的生物相容性和可降解性，获得FDA批准应用于临床研究。然而，聚乳酸-聚羟基乙酸共聚的降解产物呈现弱酸性，有可能导致急性或者慢性的炎症反应[6]。Morille等[1]构建聚乳酸-聚羟基乙酸共聚微球，缓慢释放转化生长因子β3，并与人间充质干细胞复合，在骨关节炎模型中测试软骨再生情况。得出这种模式可有效在关节炎环境中原位再生软骨，并且这种携带转化生长因子β3的微球可让人间充质干细胞存活30 d，而这可保护软骨而足以让它再生。 Pan等[20]分别制造拥有相同或不同孔隙率的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚支架，并且首次比较不同孔隙率支架材料对体内骨软骨缺陷的修复效果。将支架和骨髓间充质干细胞复合体植入到新西兰白兔股骨髁软骨缺损处，12周后，宏观外观、断面图、苏木精和曙红染色、甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色和特性的基因的实时聚合酶链式反应结果显示，所有实验组均表现出良好的软骨修复效果，在骨层中77%孔隙率和软骨层中92%孔隙率的支架材料修复效果最佳，这是由于该种支架材料最大程度地模仿了天然软骨和软骨下骨的生物力学。研究举例说明软骨组织工程虽然允许支架有广泛的孔隙率，然而其中有一些孔隙组是最佳的。它也表明，在实际的生物材料设计中，应考虑到与自然组织生物力学的匹配，这是说明孔隙率对支架材料来说特别重要。聚乙烯醇本质上是由聚醋酸乙烯酯水解得到的，在水中呈现可溶性晶体结构。聚乙烯醇的使用可追溯到上个世纪，在工业、商业、医学及食品行业，聚乙烯醇都作为一种终端产品，如油漆、树脂和食品的外包装。通常聚乙烯醇与其他一些高分子聚合物混合，如天然聚合物及具有亲水性的聚合物[21]。聚乙烯醇是一种力学性能好、降解快、无毒及亲水性好的高分子聚合物，并且已获得FDA批准可用于医疗、食品行业[22]。Vikingsson等[23]将聚己酸内酯支架浸泡在聚乙烯醇溶液里，冷冻-融化6个周期，制作成水凝胶-支架复合体，并测量它的理化及生物学性能。得出复合支架的力学性能良好，10 000周期的压缩实验后无明显形态学变化。聚乙烯醇提供了适合细胞生长的环境。这一研究表明支架能够维持负载，并且当软骨细胞长入支架内，也不改变其力学性能。 Sheykhhasan等[24]通过制备不同来源的支架材料，如纤维蛋白支架、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚支架及海藻酸盐支架，来评估天然支架材料与人工支架材料在充当细胞外基质方面有什么不同。将人脂肪间充质干细胞分别复合支架共培养2周，从细胞增殖、分化及细胞形态学，以及检测细胞向软骨分化的基因这几个方面来评估支架的性能。结果显示，纤维蛋白支架材料组细胞分布均匀，能够高表达软骨形成基因。根据此研究结果，Sheykhhasan认为天然高分子支架材料可提供合适的环境来促进干细胞向软骨细胞分化。人工合成材料具有天然材料所不具备的优势，如力学强度好、降解速率可控等，但其也有生物相容性差、降解产物易引起炎症反应等诸多缺点。目前研究者往往是通过物理或化学改性，或是降低其比重来减轻其降解产物对机体的刺激。笔者通过阅读文献发现，大多数研究者是通过寻找不同材料之间的组合，或者是研究不同材料的比例，往往忽视了材料本身的作用，是为种子细胞提供黏附、增殖及分化的场所，充当细胞外基质。支架材料孔径大小对细胞的影响也是相当大的，但目前较少学者研究。 2.3 复合材料理想的、符合现代临床应用的支架材料应符合如上文所说的几个条件。目前尚无一种材料能同时具备以上条件，一种成分构成的支架材料很难符合软骨组织工程及临床上对支架材料的要求。为解决单一的原材料的不足，现在往往将多种材料按不同的比例进行混合，互相弥补不足，尽可能满足临床及组织工程的要求[25]。如生物玻璃-壳聚糖-聚己酸内酯复合支架、壳聚糖-明胶/聚乳酸-聚羟基乙酸共聚复合支架、壳聚糖-聚磷酸钙复合支架、磷酸三钙-明胶复合支架等。付维力等[26]制作不同配比的壳聚糖-聚磷酸钙复合支架，并与新西兰大白兔第3代半月板细胞复合，通过体内实验、体外实验及MTT法得出，壳聚糖/聚磷酸钙三维多孔支架材料无毒性，具有良好的生物降解性及细胞相容性，并且有助于半月板细胞的生长。 Arahira等[27]制作磷酸三钙-明胶复合支架并与兔骨髓间充质干细胞复合，得出胶原与磷酸三钙复合提高了支架的孔隙率，并且单纯磷酸三钙支架浸泡在培养基里容易造成多孔结构的坍塌。复合支架比单纯的磷酸三钙支架更能作为成骨细胞的标记物。复合支架的抗压模量、力学强度及吸收能量受到细胞增殖及细胞外基质形成的影响。 Fengxuan等[28]制备了壳聚糖-明胶/聚乳酸-聚羟基乙酸共聚水凝胶-支架圆锥形复合体，壳聚糖-明胶水凝胶装载转化生长因子β1，聚乳酸-聚羟基乙酸共聚支架材料装载有骨形态发生蛋白2。体外细胞实验提示，复合支架可促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞和成骨细胞分化；体内实验提示，壳聚糖-明胶/聚乳酸-聚羟基乙酸共聚分级支架多相组合物和空间双重生长因子递送有助于软骨-骨界面组织缺损的修复。 Tao等[29]通过结合热致相分离技术和淋盐技术将聚乳酸及脱乙酰壳聚糖构成拥有不同孔径的复合支架，该支架孔隙率94%，并拥有微孔及大孔，与聚乳酸单一材料组成的支架相比，前者在力学性能及蛋白吸附能力上有明显改善。体外实验也提示该复合支架支持细胞的增殖和渗透。 Song等[30]利用组织工程技术将猪松质骨和脱乙酰壳聚糖-明胶凝胶支架复合，猪松质骨和凝胶支架分别模拟骨和软骨。随后与脂肪来源的干细胞复合培养，并且检测支架材料的孔隙率、降解率及溶胀率，以及进行红外光谱及扫描电镜扫描，通过死/活染色鉴定细胞活性及增殖。结果得出，这种双层结构的复合支架材料比单纯一种材料制备的支架更适合细胞的黏附、增殖。 Levingstone等[31]制备了一种多层结构的支架材料，这种材料最下面一层骨层，是由Ⅰ型胶原、胶原蛋白基质与羟基磷灰石混合冷冻干燥而成；中间层是由Ⅰ型胶原与透明质酸钠混合，反复冷冻干燥而成；最上面是软骨层，由Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和透明质酸钠通过冷冻干燥而成。制作山羊动物模型，在山羊横向滑车脊和内侧股骨髁造缺损区，缺损深度达软骨下骨。实验分为3组：空白组、多层支架组及人工合成支架材料组。植入后2周、3个月、6个月及12个月，制成膝关节标本，通过大致外观、CT及组织切片等来评价软骨及骨修复效果，在多层支架组可见结构良好的软骨下骨小梁和透明状软骨组织形成。 Wang等[32]制备了不同比例的胶原蛋白-蚕丝蛋白复合支架材料，通过评估支架材料的孔隙率、吸水率及细胞增殖等，确定了支架材料的最佳比例为胶原蛋白：蚕丝蛋白等于7∶3。再用双乳化溶剂挥发法将转化生长因子β1封装于聚乳酸-聚羟基乙酸共聚溶液中，洗涤、冷冻干燥成聚乳酸-聚羟基乙酸共聚微球。将复合支架材料及聚乳酸-聚羟基乙酸共聚微球植入兔膝关节软骨缺损处，12周后，取兔膝关节标本做组织切片染色。结果显示，兔膝关节软骨修复良好，从组织学及细胞学可看出缺损处填满软骨，与周围组织界限不明显。对比显示，承载含有转化生长因子1的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚微球的复合支架组修复效果更佳。 Liao等[33]制备了一种多材料复合而成的新型支架材料，它是由甲基丙烯酸化硫酸软骨素、聚(乙二醇)甲基醚-ε己内酯丙烯酰氯及石墨烯氧化物多种材料复合而成。通过检测复合支架材料的孔径、孔隙率、溶胀能力、压缩模量、电导率及体外细胞增殖实验，得到最佳比例的支架。动物实验行新西兰大白兔全层软骨移植，分别于术后6，12，18周取兔关节制作标本，并行CT及组织学切片染色。结果表明，实验组软骨细胞形态、分布最好且形成连续的软骨下骨，厚度适宜。实验表明，该复合多孔支架材料在软骨组织工程应用中潜力巨大，可应用于其他组织工程研究。目前最常见的复合支架通常是由天然材料和人工材料复合而成，人工材料在力学性能及降解速率可控性上有明显优势，但在生物相容性、细胞毒性等方面还有不足之处。现有学者提出不同孔径及孔隙率对细胞的黏附及增殖有较明显影响[19]。将两者按照一定比例混合，取长补短，可制备不同孔径、孔隙率及匹配组织降解速率的复合材料。还有一些研究者模仿软骨的层次，制备多层支架填于缺损处。这也是目前研究的方向。 2.4 纳米材料纳米材料是指三维中有一维或多维处于纳米级尺度，具有优良组织相容性、机械性能的一种材料。纳米支架材料与天然细胞外基质的结构最为相似，具有优良的组织相容性及机械性能，在组织工程化支架结构的研究及运用中得到了重视[34-35]，其目前主要的制备方法有静电纺丝、自组装技术和相分离技术等。 Kon等[36]构建骨软骨纳米仿生支架，它是一种多孔三维3层结构的复合支架，分为软骨层、中间层及骨层，并进行了体内试验。包括1例多发软骨损伤合并前交叉韧带损伤患者的病例报道，并且支架未复合种子细胞应用于羊和马的体内[37-38]，结果显示缺损部位骨和软骨有良好的修复和再生，患者手术后半年MRI显示移植部位信号跟正常软骨信号类似，术后1年随访提示患者关节无明显疼痛，活动无明显受限。 Kon等[39-40]对30例关节软骨缺损患者行上述纳米支架移植，并对其中29例跟踪随访，行IKDC及Tegner评分；其中的24例行MRI检查并行MOCART评分。IKDC主、客观评分均显示出良好的临床效果；MRI结果显示，70%的软骨缺损都能够完全填充，但软骨下骨及骨质层只有7%和47%的填充。这一研究表明骨软骨纳米仿生支架在促使骨和软骨修复具有显著意义。 Xue等[41]制备聚乳酸-聚羟基乙酸共聚支架及聚乳酸-聚羟基乙酸共聚-纳米羟基磷灰石复合支架，体外实验提示，细胞在纳米支架材料上的活力及增殖明显优于单纯聚乳酸-聚羟基乙酸共聚支架。体内实验选取大鼠模型，将两种支架材料置入膝关节软骨缺损处，12周后行组织学检查，纳米支架组软骨缺损处填充了大量黏多糖及Ⅱ型胶原，证实这种新型纳米支架材料可能在临床上应用于软骨修复。为了模仿软骨的天然纳米结构，Bhardwaj等[42]引入一种新的支架，叫做XanoMatrix，这种支架材料来源于非生物的细胞基质。将其与聚对苯二甲酸乙酯和醋酸纤维素混合，这种支架材料拥有良好的机械性能及与细胞外基质类似的纳米结构。XanoMatrix支架材料提供软骨细胞生长和增殖理想的表面结构。研究证实，这种支架材料拥有较大的细胞疏水性、立体表面结构及足够的抗张强度。这些特性使得这种新型纳米支架材料成为治疗软骨缺损的理想材料。纳米支架材料负载有羟基磷灰石、磷酸钙等，可控制细胞的黏附、增殖及调节细胞外基质的形成。纳米材料也可控制支架的降解，以促进组织再生。纳米材料也存在两个问题亟需解决，第一，缺少临床转化，为了减少手术创伤，纳米支架材料需要从很小的创口递送至创面，目前尚无良好的办法去实现；第二，纳米材料另一个挑战时缺乏短期及长期毒性评价，特别是新开发的纳米材料。总的来说，纳米支架材料已经成为软骨组织工程的重要组成部分，但必须进行进一步的研究以评价其临床可用性。"

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