2.1   放射性损伤治疗现状   放射性组织损伤的治疗方法目前主要包括放射防护剂(药物性预防)、干细胞移植(异种造血或骨髓间充质干细胞等)、组织工程化类器官移植等。基硫醇类化合物氨磷汀氨作为第1代辐射防护剂，可通过清除辐射产生的自由基来减少辐射对机体的损伤，是目前FDA批准应用于临床的小分子辐射防护剂，其药效高但会导致低血压等不良反应[5]。在急性放射综合征相关的中性粒细胞减少症中，粒细胞集落刺激因子及长效制剂聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子(PEG-rhG-CSF)是目前FDA已批准的2种细胞因子类药物。此外，最新研究探讨了粒细胞集落刺激因子最佳剂量策略[6]，对于小剂量放射损伤，细胞因子治疗作用显著[7]，对于大剂量或致死性的放射损伤，受照者体内残留的干细胞极少，靠自身难以实现组织修复以及功能重建。虽然造血干细胞及骨髓间充质干细胞拯救放射性造血系统损伤已取得不错的效果，但存在供者来源短缺、过程耗时较长以及不适合急性放射性损伤治疗等缺点，因此需要找到更为有效的治疗方法。 过去一些报道称间充质干细胞具有抗辐射性[8-9]，并且证明了即使在受到大剂量照射下，干细胞的生物特性也不会改变[10]。间充质干细胞作为骨髓龛的重要组成部分，不仅具备造血功能[11]，还能促进放射损伤后造血功能恢复[12]。此外，在修复放射性组织损伤(如脑、肝脏、肾、肠道、肺部、唾液腺、骨组织等)的研究中，间充质干细胞移植也显示出巨大的再生潜力[13]。尽管细胞疗法还缺乏临床案例，但研究者们仍认为间充质干细胞能够成为一种新的治疗方法。然而，目前越来越多的研究表明，除了伦理上的担忧外，间充质干细胞及其他干细胞不仅具有致瘤潜力和免疫排斥风险[3]，还有异位分化及阻塞远端微血管等缺点[14]。因此干细胞疗法远非研究终点。 近年，在放射性涎腺模型研究中，组织工程类器官展现了一些治疗优势，植入的类器官中保存了腺泡细胞蛋白的表达、细胞极性、分泌功能的结构和位置，此外，研究还发现植入体内的类器官对神经递质有反应。最新的体外3D技术培养类器官则是其研究热点，它能克服2D培养过程中造成的功能部分丧失问题，更加有效地缓解放射性涎腺损伤[15]。 但是，组织工程化人工类器官仍存在许多问题，如植入后生长存活、血管、神经再支配及植入细胞的成瘤性等。因此，类器官移植也有待进一步研究。 目前研究证实干细胞的治疗效果很大程度上归功于旁分泌效应物。在这些效应物中，细胞外囊泡作为细胞间通信交流的的重要介质，不仅发挥着重要的生理功能，同时也参与多种疾病的发生与发展。近年，利用不同来源细胞外囊泡治疗相关疾病的研究层出不穷，并显示出独特优势。细胞外囊泡携带了干细胞的生物活性物质，可替代干细胞发挥修复治疗多种器官及组织损伤的功能(如放射性组织损伤)。细胞外囊泡的应用避免了干细胞直接移植存在的多种潜在风险，且细胞外囊泡免疫原性低又便于保存和运输，还具有通过预处理增加治疗潜力等优势。此外，通过干细胞永生化培养技术，可以实现大规模细胞外囊泡制备的可能。因此，基于以上这些发现，细胞外囊泡有望在再生医学领域中成为一种新的无细胞治疗策略。    2.2   细胞外囊泡及其类型   细胞外囊泡是膜封闭的囊泡，是细胞正常生理的一部分以及在获得性异常期间从细胞中自然释放。它们在细胞内和细胞间的通讯中起着重要作用[16]，包括调节免疫应答、细胞增殖、细胞迁移、血管形成和癌症进展以及其他生物学过程[17]。细胞外囊泡的运输和转移会影响其靶细胞内的各种生理功能，有时甚至是病理功能[17]。细胞外囊泡的作用取决于其内容物向受体细胞的传递，进而改变细胞的生物学过程[17]。细胞外囊泡含量随生成细胞的不同而变化，它们从中获取脂质、核酸和蛋白质[18]。根据其生物发生、释放途径、大小、含量和功能，细胞外囊泡可大致分为外泌体、微泡和凋亡小体[16]。 2.2.1   外泌体   外泌体(30-150 nm，平均100 nm)是通过内体膜的内陷产生的。首先，质膜向内萌芽导致早期内体的形成，随后通过多泡体内部的限制膜向内萌芽，形成腔内囊泡，然后再与质膜融合，形成外泌体。外泌体包含RNA(mRNA和miRNA)、脂质(胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺、磷脂和葡聚糖)和来自细胞的蛋白质[19]。外泌体的含量(例如核酸、蛋白质、代谢产物)影响受体细胞的生物学反应。外泌体还被认为具有去除细胞中过量和/或不必要的成分以维持细胞稳态的作用，同时还与放射性组织损伤、免疫反应、心血管疾病、病毒致病性、中枢神经系统相关疾病和癌症进展有关。外泌体是从多细胞中分泌的，可能促进或限制疾病的发展[20]，还可能被用作传染病的生物标志物用于预防感染。因此，基于以上外泌体的内在特性，在许多疾病防治中可能具有更多的潜在用途。 2.2.2   微泡   微泡/微粒(100-1 000 nm)随着膜的突出而发展，最终形成直接分离的凸起。它们主要包含高度浓缩的血浆和胞浆相关蛋白[21]，包括细胞骨架蛋白、热休克蛋白、整联蛋白以及含有翻译后修饰(例如糖基化和磷酸化)的蛋 白[22]。它们参与局部和远处细胞之间的细胞间通讯，并且在临床环境中与外泌体高度相似。因此，它们也可以被工程化以将治疗成分(包括短干扰RNA、反义寡核苷酸、化学治疗剂和免疫调节剂)传递至所需靶标[23]。 2.2.3   凋亡小体   细胞凋亡小体(>1 000 nm)的特征是细胞内的细胞器存在于被凋亡细胞释放的膜囊泡中。它们含有完整的细胞器、染色质和少量糖基化蛋白[23-24]，有助去除垂死的细胞，还充当抗原呈递的关键调节剂[25]，因此正在成为免疫调节的关键参与者。 对于细胞外囊泡的传播途径研究，目前认为可能存在以下途径：①旁分泌机制：干细胞通过分泌生物活性物质以旁分泌的方式作用于局部和全身细胞。这些活性分子不仅包括可溶性因子，还包括最近作为细胞间通讯机制出现的细胞外囊泡。细胞外囊泡充当在原始细胞和受体细胞之间转移分子的媒介，从而改变后者的表型和功能[26]。例如在研究胎儿信号引发分娩的机制中，MENON[27]发现衰老细胞中损伤相关分子模式标记(DAMP)被包裹在细胞外囊泡中并传播到远处，引起产妇子宫组织炎症变化，触发产妇分娩。②体液循环：几乎所有类型的细胞都会释放细胞外囊泡并在体液中循环。目前细胞外囊泡已在大多数体液，如血液、尿液、唾液、痰、母乳、精液和脑脊液被观察到[28]。细胞外囊泡中包含多种生物活性物质，例如mRNA、miRNA、DNA和蛋白质，它们可以转移到受体细胞中，导致表型改变。已知这些细胞外囊泡在许多病理、生理功能中起关键作用。基于细胞外囊泡具有独特的特性，如高生物相容性、安全性和纳米级直径，可实现有效的载药量和较长的血液循环半衰期。无论是旁分泌还是体液循环途径，细胞外囊泡识别并结合到受体细胞后，它的作用机制目前有2种：一种是细胞外囊泡上的蛋白质结合并激活受体细胞上表达的受体，而受体细胞并不摄取细胞外囊泡；另一种是细胞外囊泡通过与质膜的直接融合或主动内吞作用将其所携带的内容物转移至受体细胞内，从而在受体细胞内发挥重要的生物学作用[29]。因此，来自细胞表面的细胞外囊泡介导的信号传导和细胞外囊泡内容物向细胞转移都可以引发受体细胞的生物学功能效应。尽管目前可通过差速离心、过滤、免疫亲和、层析、流式细胞分选、密度梯度离心选取不同密度区域等多种手段大致分离不同的细胞外囊泡亚群，但是这些方法都不能完全纯化到特定的亚群，并且存在一定的局限[30]，通常得到的是富集某一个亚群同时带有其他细胞外囊泡亚群。因此，就目前科学技术而言，想要彻底提取并纯化细胞外囊泡以及阐明其内容物的功能意义还无法实现。为了细胞外囊泡领域取得更大的进展，需要以包括分子、细胞和功能表征在内的综合性方式进一步研究，并尽可能区分不同的细胞外囊泡亚型。在未来的研究中，科学家可以跟踪存在于许多不同细胞外囊泡类型中的通用可溶性内容物，以确定信息交换是否会产生显著的生理作用和生化效应(如药物递送后的治疗)，为细胞外囊泡可能作为治疗靶标及诊断的标志物提供坚实的理论基础。 2.3   细胞外囊泡与放射性组织损伤   2.3.1   细胞外囊泡(主要是微泡)与放射性血管损伤   在放射损伤研究中，放射造成的血管损伤在不同生物体的多种组织器官中已被普遍发现。放射会诱导血管内皮细胞功能障碍，其特征是内皮屏障渗透性增加，内皮细胞与基底膜分离以及内皮细胞凋亡[31-32]。血管内皮细胞功能障碍和细胞凋亡会导致放射后损伤部位炎症以及纤维化。一方面，在血管内，放射会诱导血栓前状态，其特征在于血小板积聚、微血栓形成以及炎症细胞对内皮细胞的黏附增加，随后内皮细胞进入血管周围间隙[33]。从结构上讲，对脉管系统的放射会导致血管剂量依赖性破坏，特别是影响组织微血管系统[34]。细胞外囊泡可以产生于内皮细胞损伤条件下，包括放射性损伤。体外实验已证实放射会触发血小板剂量依赖式的释放微泡。此外，还有研究发现放射会诱导组织因子的表达，并增强人类外周血单核细胞衍生微泡的促凝能力[35]。这些发现可能解释了放射增强血液血栓形成的可能机制。另一方面，炎症也是血管放射性损伤主要后果之一。现在，来自体外和体内研究的新证据表明，微泡表现出多种促炎活性，例如内皮细胞、血小板和白细胞的微泡不仅促进白细胞的黏附和迁移，还促进促炎细胞因子以及其他细胞类型微泡在体外的释放[36-37]。有研究证实了放射触发单核细胞和内皮细胞剂量依赖性微泡的释放，其中值得注意的是，CD31+和CD41+微泡被视为反映内皮细胞功能障碍程度的有价值的替代标记物，而CD14+微泡则被视为增强血管炎症的促炎因子[38]。虽然细胞外囊泡与内皮细胞功能障碍之间的关系尚不完全清楚，但可以明确的是，在放射诱导血栓和炎症形成过程中，微泡是该疾病机制的一部分并且与血管功能障碍的发病机制高度相关。 2.3.2   细胞外囊泡与细胞的旁观者效应   有研究表明，放射直接诱导细胞DNA损伤，包括单链和双链断裂、微核形成、突变、姐妹染色体交换、miRNA谱改变、氧化应激诱导的细胞死亡等[39]。此外，邻近的“旁观者”细胞以及受照射的子代细胞也会受到影响。这些发生在子代细胞非靶向的影响被称为基因组不稳定性，而发生在非照射部位邻近或远处细胞的影响，则被称为局部或全身旁观者效应[40]。放射诱导旁观者效应是“旁观者”细胞通过接受直接照射细胞的信号分子导致的，这些DNA损伤反应途径的激活需要照射细胞分泌的旁观者效应物(如P53)。放射诱导旁观者效应可能涉及多种途径，信号传导可通过细胞与细胞的接触(间隙连接)或分泌的可溶性分子转移来进行[39]。目前有报道称放射性诱导的基因组不稳定性部分由细胞外囊泡介导[41-42]，例如，在照射后细胞外囊泡可以激活氧化应激途径[43]，且该过程是由DNA损伤激活的P53转录因子所介导的[39]。此外，通过细胞外囊泡还可以部分介导全身其他幼稚细胞的旁观者效应[38]，例如，细胞外囊泡携带的miRNA (如 miR-21、 miR-34c、miR-1246)和蛋白质在放射诱导旁观者效应中起重要作用[41-45]。虽然近年来有一些报道显示了放射可以诱导细胞外囊泡内容物改变以及细胞外囊泡分泌mtDNA参与了放射诱导旁观者效应信号的介导等[41，46]，但细胞外囊泡介导放射性组织损伤的机制十分复杂且研究仍处初级阶段，因此进一步的研究是有必要的。 2.4   细胞外囊泡与放射性组织损伤修复   放射损伤的第一步是放射诱导的能量聚集，之后产生活性氧介导放射性组织损伤。有报道称，细胞外囊泡是活性氧的生产者和消除者[47]。有研究发现干细胞来源细胞外囊泡可以抑制活性氧并降低氧化应激，从而改善放射性组织损伤。例如在放射性大鼠骨损伤模型中，Zuo等[48]报道了骨髓间充质干细胞来源细胞外囊泡可以减轻放射诱导的氧化应激并促进抗氧化的表达，从而减轻放射骨丢失。此外，在放射性造血系统损伤实验中，ZHANG等[49]发现血清外泌体miRNA不仅部分介导了C-kit+细胞活性氧降低，而且还增加了造血干细胞活性，从而改善造血干细胞的损伤。最近还有研究报道，在放射线(主要是紫外线)导致的皮肤细胞衰老实验中，DENG等[50]发现人脐带间充质干细胞来源细胞外囊泡(hucMSC-EVs)和真皮成纤维细胞来源细胞外囊泡(Fb-EVs)均显示较强的抗氧化性。一方面，这是因为研究者们发现二者均可促进人真皮成纤维细胞的细胞外基质蛋白胶原1型和抗氧化剂蛋白(如谷胱甘肽过氧化物酶1)的表达，并降低基质金属蛋白酶1的表达；另一方面，研究者还发现2种细胞外囊泡不仅可以显著抑制紫外线诱导产生的活性氧、细胞凋亡和细胞周期阻滞，还能增加皮肤成纤维细胞增殖，显著降低衰老细胞的百分比，从而保护皮肤成纤维细胞免受紫外线诱导的光老化。 相比细胞外囊泡miRNA在其他组织损伤修复作用的广泛研究而言，其修复放射性组织损伤的研究还较少。有证据显示，干细胞通过细胞外囊泡转移特定的miRNA亚组可以部分逆转放射损伤。如鼠造血细胞系(FDC-P1)暴露于500 cGy辐射导致其生长抑制、DNA损伤和细胞凋亡，给予鼠或人间充质干细胞来源细胞外囊泡后得到缓解。进一步分析发现，经荧光电穿孔转染的PDC-P1细胞中富含间充质干细胞来源细胞外囊泡miRNA，miRNA过表达可部分介导逆转放射性损伤，如miR-221、miR-451和miR-654-3p的过表达刺激细胞生长，而miR-210-5p、miR-106b-3p和miR-155-5p的过表达阻止放射诱导的细胞凋亡[9]。值得关注的是，最近有研究者发现，在外周血单个核细胞群和内皮细胞共培养的实验中，辐射不但能诱导外周血单个核细胞来源细胞外囊泡的释放，改变它的组成(蛋白质和miRNA)及增加抗凋亡物质，还能增强内皮细胞对细胞外囊泡的吸收，重要的是，摄取了细胞外囊泡的内皮细胞凋亡率明显降低[51]。考虑到放射对细胞外囊泡内容物的改变以及抗凋亡物质的增加，研究者们推测造成内皮细胞凋亡率降低的原因可能是多种因素的共同结果，如细胞外囊泡中某些miRNA减少(miR-23A-3P、miR-451A)或增加(miR-101-3p)可以抑制内皮细胞凋亡[52-54]。 除了细胞外囊泡可通过抑制活性氧及转移miRNA亚组来修复放射性组织损伤以外，研究发现细胞外囊泡还可通过调控靶细胞内蛋白质发挥修复作用。BAULCH等[55]首先发现颅内移植干细胞衍生的微泡可以减轻放射诱导的脑部神经病理损伤，并改善大鼠认知障碍。SMITH等[56-57]发现人神经干细胞来源细胞外囊泡与人神经干细胞移植效果等同。进一步鉴定发现，这是由于人神经干细胞来源细胞外囊泡提高了海马内胶质细胞源性神经营养因子表达，降低突触后蛋白PSD-95发挥的作用。有研究显示，经单磷酰脂质A处理的巨噬细胞衍生外泌体增强了生精细胞DNA修复活性和抑制DNA损伤，该外泌体中含粒细胞集落刺激因子和MIP-2蛋白，这2种蛋白部分参与了逆转放射性睾丸损伤[58]。同样，在急性放射综合征研究中[59]，经高浓度脂多糖预处理的间充质干细胞来源外泌体可以介导增强巨噬细胞源细胞因子分泌(如白细胞介素10、白细胞介素15和FLT3L蛋白)和吞噬活性，并促进体内造血组织的修复，提高了急性放射综合征患者的存活率。在恢复放射性造血干细胞实验中，还发现原代内皮细胞来源细胞外囊泡富含金属蛋白酶组织抑制因子，它部分介导了放射后造血干/祖细胞膜联蛋白V1和程序性凋亡细胞水平下降，加速了造血干细胞再生并延长了存活时间[60]。 总之，细胞外囊泡作为信息载体可以促进放射性组织损伤修复，但其机制十分复杂，仍有待研究者们进一步探索和完善。 2.5   细胞外囊泡与WNT信号通路   WNT蛋白是细胞外富含半胱氨酸的糖蛋白大家族，它们在细胞增殖、分化、代谢和干细胞维持等过程中发挥重要作用。最近有报道称细胞外囊泡携带的WNT蛋白可以发挥放射性组织损伤修复作用。在放射性骨损伤模型中，放射除了产生活性氧并导致DNA双链断裂外，还会导致骨髓间充质干细胞优先分化为脂肪细胞，给予间充质干细胞来源外泌体后骨髓间充质干细胞表现出β-catenin表达增加趋势，并且优先分化为成骨细胞，这证明细胞外囊泡是通过激活WNT信号通路，恢复骨髓间充质干细胞的分化潜能，从而调控放射性骨丢失。此外，细胞外囊泡的内容物还可以通过调控WNT/β-catenin信号传导，促进干细胞自我更新和增殖，特别是对干细胞微环境稳态起到至关重要的作用。如在小鼠放射性肠道损伤模型中[61]，通过骨髓巨噬细胞源囊泡传递WNT蛋白后的巨噬细胞培养基可以改善辐射胃肠综合征，并提高Procn基因(一种合成WNT蛋白至关重要的基因)缺陷的小鼠生存率。此外，纯化的细胞外囊泡不仅可以促进肠道干细胞自我更新和增殖，还使得肠隐窝细胞免于放射毒性。经鉴定发现，诱导再生的巨噬细胞中表达经典WNT5a，WNT6和WNT9a，这说明其可以通过激活WNT/β-catenin信号途径，促进肠道干细胞再生，维持肠稳态，改善放射性肠道损伤。 2.6   细胞外囊泡在放射性组织损伤中的生物分布和代谢   在放射性组织损伤模型中，目前仅有少量研究专注于细胞外囊泡在体内的分布。有趣的是，细胞外囊泡在体内分布非常类似于间充质干细胞在非放射性组织损伤模型中分布，即静脉注射细胞外囊泡后，在肝脏和脾脏分布最多，在脊柱、股骨和胫骨的骨髓中分布较少，在肺、心脏和肾脏中检测不到[9]。这种特定的积聚可能是不同细胞类型对间充质干细胞来源细胞外囊泡的摄取所致。例如在放射性鼠骨髓损伤研究中，CD11b阳性细胞和F4/80阳性细胞(单核细胞/中性粒细胞/巨噬细胞)摄取间充质干细胞来源细胞外囊泡明显增加，而B220细胞(B淋巴细胞)摄取不明显[61]。值得注意的是，相比间充质干细胞有明显的肺部滞留，而静脉输注的间充质干细胞来源细胞外囊泡在肺部几乎检测不到。最近WEN等[61]用DID标记人肺成纤维细胞衍生囊泡时，发现肺部可以检查到大量肺成纤维细胞衍生囊泡积聚，同时骨髓中积聚也显著增加，这说明细胞外囊泡不仅有特异的积聚性，而且细胞外囊泡的来源对其分布也有重要影响。通过研究还发现，增加细胞外囊泡注射次数和每次注射细胞外囊泡的剂量以及增加放射剂量，都会导致肝脏、脾脏和骨髓中细胞外囊泡的摄取增加，影响细胞外囊泡生物分布[61]。 在放射性组织损伤模型中，关于细胞外囊泡在体内代谢研究也罕有报道。在鼠骨髓放射损伤实验中，发现注射间充质干细胞来源细胞外囊泡后1 h即可在损伤骨髓部位检测到，聚集到骨髓的细胞外囊泡在24 h内没有明显减少[61]。一方面说明间充质干细胞来源细胞外囊泡与间充质干细胞有相似特性，能主动趋化到损伤部位聚集；另一方面说明在放射性组织损伤模型中，间充质干细胞来源细胞外囊泡24 h内仍能在体内检查到。 由此可见，在放射性组织损伤模型中，细胞外囊泡在体内的分布和代谢与间充质干细胞既有共同点，也有不同点。细胞外囊泡做为放射性组织损伤治疗的一部分，其研究才刚刚开始，由于它的分布和代谢在一定程度上会影响治疗的效率，因此值得更多的被研究。 "