Application and advantages of tissue engineering technique in the treatment of infected bone defects

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.28.019

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: There are many treatment methods for infected bone defects, but there is no first stage treatment method, which has the characteristics of sustained-release, anti-inflammation, osteogenic activity, bone conduction and degradable absorption.
OBJECTIVE: To investigate the research progress of bone tissue engineering technique in the treatment of infected bone defects.
METHODS: A computer-based retrieval of PubMed, WanFang and CNKI databases was conducted for the articles published from 2000 to 2016, concerning the basic and clinical research on the local application of antibiotics; basic research on infected bone defects with sustained-release of antibiotics; basic studies on the source of seed cells and the osteogenic mechanism; and scaffold materials. A total of 55 eligible articles were included for result analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Topical application of antibiotics exhibits different effects in the treatment of osteomyelitis. The development of bone tissue engineering has brought new hope for the treatment of bone defects, and in the meanwhile, selection of excellent seed cells has become a hot and difficult research. A rational combination of antibiotics, seed cells and scaffold materials may provide a new treatment strategy for infected bone defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Bone Diseases, Infectious, Anti-Bacterial Agents, Tissue Engineering

CLC Number:

R318

Wang Bu-xiang, Yang Tie-yi, Zhao Zhen-qun, Guo Shi-bing. Application and advantages of tissue engineering technique in the treatment of infected bone defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(28): 4543-4549.

Figures/Tables 2

2.1.1 直接在感染部位放置药物纱布条浸润抗生素溶液，或将抗生素直接放置于病灶[19]。这是最常用的给药方法，简单有效，可以在病灶快速达到有效的药物浓度[18]，但是介于药物没有进入循环代谢，一些抗生素的作用会显著降低，另外，有效的药物浓度保持时间短，不一定能达到灭菌疗效。目前，它主要用于浅表创面换药，不能应用于复杂的骨感染病例。 2.1.2 闭式灌洗法 1970年Willenegger发表了抗生素灌注治疗骨感染的方法。在某些深部手术术后需要持续灌洗时，可在灌洗液中加入抗生素用于预防或治疗。此方法现已广泛应用于临床，易于控制抗生素的浓度和更换抗生素，该方法使骨髓炎的治愈率显著提高[18]。但是在临床应用中，发现其许多不足：①容易堵塞，造成积液，冲洗不彻底，遗留残株，易复发[20]；②灌洗治疗时间长，可能需要多次手术清创；③药物不经过血液循环，到达的范围有限，对范围较大的感染效果不理想；④进、出管口可出现窦道，存在2次感染可能，引流管留置过久逆行感染发生率高；⑤冲洗的数量和时间不易控制，过度清洗可能会导致体内活性成分损失[18]。此外，有研究人员用碘伏代替抗生素，而且效果更佳[19]。 2.1.3 介入加体外微泵疗法利用Seldjnger方法穿刺健侧股动脉或肱动脉，在病变供血动脉内放置导管端进行造影。观察病灶局部供血动脉，确定导管位置。随后找到离病变最近的供血动脉血管，将导管放入其中，利用微量泵缓慢注入抗生素。根据药敏试验选择抗生素，无药敏试验者选择广谱抗生素[21]。这种方法有2个显著的优点：①在治疗过程中可以根据药物敏感性结果使用敏感抗生素，克服了局部用药的单一缺点；②抗生素的注入量可以严格控制，保证了局部有效浓度。为了深入探讨介入疗法的作用机制，樊晓海等[22]做了一系列动物实验。总结如下：①病灶中药物浓度比正常组织高，在治疗后的0.5，1，2 h差异有非常显著性意义(P < 0.01)，治疗后2 h和静脉给药0.5 h差异有显著性意义(P < 0.05)；②此种疗法血液中的药物浓度远远低于静脉给药时的药物浓度(P < 0.01)。介入治疗组病灶中药物含量比较高，3 h差异仍有显著性意义。由此可见，介入治疗显著提高病灶抗生素的浓度和延长作用时间。慢性骨髓炎的介入治疗方法简单、实用，疗效可靠，缩短了治疗时间，减轻了患者的痛苦。通过造影技术可以了解感染周围血管情况，对吻合血管的选择具有指导意义[21]。但是该项技术仍需在感染部位留置导管，因此，与留置导管冲洗有许多相似的缺陷。 2.1.4 局部药物释放系统的应用 Buehoh在1970年第一次用抗生素-骨水泥复合体针对全髋置换术后感染进行治疗或预防。1972年，庆大霉素-聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥珠链问世，用于治疗骨与软组织的感染效果非常明显。在此之后，聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥珠链商品化，并在欧洲获得大力推广。抗生素缓释系统以一些特殊的材料为基础，这些特殊的材料可以携带抗生素，并通过缓慢地释放出抗生素，持续维持药物的有效杀菌浓度，已被广泛应用于治疗慢性感染性骨缺损。对病灶进行彻底处理后，将抗生素缓释系统放入病灶处，与传统抗生素灌注冲洗相比较，可减轻患者痛苦，并促进局部皮肤组织修复，且抗生素缓释系统的载体在一定程度上有修复骨缺损的作用，有利于骨组织重建。由此可见，抗生素缓释系统治疗慢性骨髓炎有明显优势，而整个系统中最重要的就是需要有合适的载体。一个合适的载体必须能够承载足够的药物，释放药物速度和慢性感染周期相符合，可缓慢降解。此外，载体还需具有一定的强度[23]。 2.2 种子细胞骨组织工程的核心是选择合适的种子细胞，这已成为近年的重点和热点。良好的种子细胞必须要满足以下条件：①符合患者需求，取材容易，来源广泛，对机体损伤小；②能够快速在体外增殖且易于稳定表达成骨细胞表型；③在病灶内能存活下来并且成骨活性依然存在；④快速成骨，且无致瘤性等特点[24]。 2.2.1 成骨细胞是一种可以直接成骨的细胞，增殖能力很强，可以合成并分泌骨基质，并促进骨基质矿化形成骨组织。该细胞内含有多种生长因子，包括骨结合素、纤维黏连蛋白、骨钙素等，并且碱性磷酸酶含量较高，可合成并释放Ⅰ型胶原，具有很强成骨能力。同时在移植入生物材料后具有较强的增殖和分化能力，在动物和临床试验中得以证实[25]。陈伟良等[26]将在体外增殖获得的人成骨细胞放入松质骨支架内，观察到成骨细胞在支架的孔隙内生长良好。取异体脱钙松质骨作为支架，细胞能在其内黏附并生长，进一步证实了成骨细胞具有较强的增殖和分化能力。研究指出用自体同源血清培养的成骨细胞增殖速度和细胞表型均存在优势[27]。尽管与其他种子细胞相比，成骨细胞具有很多优点，但仍存在以下问题：①取材受限，而且可造成对供体损伤，缺乏大量获取的途径；②培养液尚无统一的标准；③增殖能力较弱，限制了其在临床大规模的应用[28]。 2.2.2 骨髓基质细胞 1867年，Cohnheim在伤口愈合的研究中，提出骨髓中存在一种可以向非造血细胞分化的细胞。陆续又有科学家们研究发现这种细胞可以分化成不同的组织。1869年，Goujon发现自体红骨髓异位移植后具有成骨作用，也证实了这个观点[29]。骨髓基质细胞具有来源广泛、损伤小、增殖能力强等优点，它在一定条件下可以分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞[30]。骨髓基质细胞同时包含两种细胞系：定向性骨祖细胞系和诱导性骨祖细胞系。定向性骨祖细胞有分化成骨的干细胞特性，无需特殊物质诱导。诱导性骨祖细胞处于未分化状态，在骨髓和间叶组织中可以见到，它无法单独分化为骨细胞，需要骨形态发生蛋白等给予诱导。目前常用的成骨诱导剂有地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠，各有不同的作用。地塞米松有利于骨髓基质细胞分化为成骨细胞，抑制细胞增殖；维生素C和β-甘油磷酸钠促进细胞合成胶原、增强碱性磷酸酶活性和促进钙盐沉积。此外还有其他的一些诱导剂，例如富血小板血浆含有大量的生长因子，包括血小板衍生生长因子、转化生长因子β等，能够促进骨髓基质细胞增殖，加速矿化物沉积[31]；此外，骨形态发生蛋白和碱性成纤维细胞生长因子能较好地诱导骨髓基质细胞分化为骨细胞[32]。近年来，以骨髓基质细胞为种子细胞的组织工程骨用于骨缺损修复取得了较为满意的效果。宋会平等[33]以骨髓基质细胞构建组织工程骨，可以较好地修复骨缺损，由此进一步证明了骨髓基质细胞可以作为优良的种子细胞。然而值得一提的是虽然骨髓基质细胞在骨组织工程方面的研究已取得了很大的进展，其应用的安全性仍存在一些疑惑：①骨髓基质细胞的特性以及它本身的作用机制仍没有被研究清楚。如何有效获取纯的骨髓基质细胞仍是一个难题；②骨髓基质细胞在合适的条件下才能正常增殖和分化。需进一步研究使骨髓基质细胞即能按照需求分化，又能避免肿瘤的形成；③尽管已经研究发现了一些载体材料，但都存在一定的缺陷；④骨髓基质细胞的作用受到周围环境条件的影响，而对这种影响的研究非常少。 2.2.3 胚胎干细胞是一种发育全能性、高度未分化和无限增殖性的细胞。与其他种子细胞相比，胚胎干细胞具有很多优势[34]。胚胎干细胞在体外也能分化成血细胞、神经元以及其他类型的细胞[35]。虽然理论上胚胎干细胞具有分化全能性，但是只有在特定的环境条件和诱导物质的作用下，才能向骨细胞分化。骨形态发生蛋白能促进骨组织形成，它可以使未分化的间充质细胞增殖减慢，促进其向成骨细胞分化，使其具有跨种属诱导成骨的能力[36]。转化生长因子是成骨过程中极为重要的因子[37]。类胰岛素样生长因子在骨基质中含量很丰富，目前已知的胰岛素样生长因子主要是胰岛素样生长因子1和胰岛素样生长因子2，通过自分泌或旁分泌的形式促进成骨细胞增殖和Ⅰ型胶原的形成，这种作用具有剂量相关性。一些实验表明胰岛素样生长因子1在机械负荷刺激骨形成的过程中也起到一定的作用[38]。胚胎干细胞具有较好的分化潜能以及成骨能力，Tielens等[38]将小鼠胚胎干细胞培养于含白血病抑制因子的可降解大孔微载体上，2周后细胞仍具有多向分化潜能，将培养了一两周的细胞转移到分化培养基上，2周后观察到成骨性分化。胚胎干细胞来源有限，获得相对困难，细胞的保存尤为重要。Han等[39]比较未分化小鼠胚胎干细胞在不同聚α羟基酯支架上的生存能力。通过观察存活细胞数和Oct-4免疫反应性，发现聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物支架能更好地保存未分化细胞，且经0.1 mol/L KOH表面处理聚α羟基酯支架上存活的细胞数增加。尽管胚胎干细胞具有明显的优点，但是其应用也存在很大的局限性，仍有许多问题急需解决。现阶段对胚胎干细胞的研究仍处于起步阶段．对胚胎干细胞的分化及调控机制还不清楚。除此之外，在伦理方面也遇到了很大的质疑和争论[40]，这些不利因素都对胚胎干细胞的研究造成了不小的困难。 2.2.4 基因修饰种子细胞基因修饰种子细胞是指在基因工程技术的指导下，将编码特定功能的基因转染至种子细胞，使种子细胞具有合成特定功能因子的能力，进而在种子细胞的增殖分化中起到促进作用，降低免疫原性，促进血管化，有利于组织修复。骨髓基质细胞：骨髓基质细胞增殖能力很强，目的基因容易导入，因此是较为理想的靶细胞。骨髓基质细胞本身可能有骨形成蛋白4的转录，而用骨形成蛋白4基因转染骨髓基质细胞，可提高骨形成蛋白4的表达，利用自分泌和旁分泌作用加速骨髓基质细胞分化为成骨细胞[41]。肌源性干细胞：有研究用骨形成蛋白4基因转染肌源性干细胞，发现肌源性干细胞在向成骨细胞分化过程中产生大量的骨形成蛋白4，既能促进骨分化，又能抑制肌性分化，此外，能够使免疫活性小鼠产生大量新生骨[42]。证明转染骨形成蛋白4基因的肌源性干细胞以自分泌形式释放骨形成蛋白4，在体内对骨诱导产生了有力的刺激，促进了骨组织的形成。另外肌源性细胞也拥有成骨能力，Shen等[43]通过体外基因治疗，证明了在转基因载体细胞的选择方面，肌源性干细胞比肌源性细胞更优越，因为前者具有低免疫原性和体内高存活能力。基因修饰细胞是最引入注目的种子细胞，但其需依赖高端的基因修饰技术和各种严格条件，这也是限制其进一步发展和应用的主要因素。基因修饰的细胞不仅需要有高效的修复能力，易于获取，长期传代，生物活性稳定，易于获得靶基因，并且要在一定时间内持续表达目的基因。而基因修饰技术目前尚不成熟，需解决一系列的问题[44]。 2.3 支架材料 2.3.1 不可吸收载体类多聚体类：目前研究最多的不可吸收多聚体是聚甲基丙烯酸甲酯。它作为抗生素载体最早用于骨关节感染的治疗。20世纪70年代以来，庆大霉素-聚甲基丙烯酸甲酯复合物即所谓的骨水泥珠链已成为感染性骨缺损的重要治疗方法。迄今，该用药方法仍在国内外得到广泛应用[45]。局部应用抗生素珠链优点如下：①可以形成局部较高的抗生素浓度；②不经过血液循环系统，不良反应小；③易于护理；④治疗费用低。不足之处：①细菌被自身产生的多糖-蛋白质复合物包裹，黏附在聚甲基丙烯酸甲酯上，抗生素无法穿透此包膜；②聚合过程中会释放大量的热能，会导致抗生素失活；③难以分解吸收，需再次手术取出；④承载抗生素的量有限，刚开始药物浓度可以很高，然后逐渐降低至治疗水平以下；⑤聚甲基丙烯酸甲酯降低了细胞对细菌的杀灭作用；⑥无法控制药量和更换药物。无机盐类：①羟基磷灰石：是目前最常见的钙磷陶瓷人工骨，因结构与骨质中无机质成分相似，具有良好的诱导成骨性和生物相容性，研发的多孔羟基磷灰石是吸附抗生素的良好载体，目前最常用的方法是将抗生素吸附于载体的孔内和表面，将此复合物植入骨缺损处，具有良好的抗菌和诱导成骨效果。研究表明负载抗生素的羟基磷灰石复合骨治疗感染性骨缺损的效果优于传统的抗生素用药[46]。纳米级羟基磷灰石的研发更是将羟基磷灰石复合抗生素的应用推向了一个新的高度；②磷酸钙：是一种人工骨替代材料，属于自固化性羟基磷灰石类，能与自身骨组织融合，逐渐拥有活性而参与人体代谢。陈红卫等[47]对8例慢性骨髓炎患者先进行彻底清创，然后放入磷酸钙-万古霉素复合物，在11-35个月的随访时间内无一例复发，其认为在病灶清除后，Ⅰ期植入磷酸钙骨水泥-抗生素复合物是治疗感染性骨缺损比较有效的疗法[48-49]。 2.3.2 可吸收载体类为了克服不可吸收载体的不足，研究的方向转向可降解抗生素载体。可生物降解材料有多聚体类、生物型载体，主要通过渗透压作用、微孔扩散和聚合物降解的方式释放抗生素。可降解的聚酯高分子是由具有相同结构的小分子通过特定的集合反应而生成，降解无需特殊水解酶，最终的产物为无害的二氧化碳和水。理想的载体所具备的特征是：①排异反应小，对局部无毒害作用；②对缺损组织修复无不良影响，可被降解；③缓慢释放抗生素；④对抗生素的抗菌作用无不良影响。移植骨类：包括自体骨、同种异体骨和异种骨。移植骨吸附抗生素不仅具有抗菌作用，还有利于骨的爬行替代，完成骨的修复(图1)[50]。抗生素通常以粉末的形式加入到松质骨粒中或将骨组织浸泡在抗生素溶液中，制备抗生素释放系统。硫酸钙和松质骨粒是已获得批准可临床应用的载体材料。磨粒松质骨于1984年开始作为抗生素载体，实验研究发现抗生素释放形式为一级动力学形式，抗生素释放时间超过3周，局部有效抗生素浓度大于杀菌浓度在3周以上[51]。袁志等[51]研制了抗感染重组合异种骨(ARBX)，实验表明ARBX具有高效诱导成骨作用和很好的抗生素控释作用，在局部可维持长达30 d的有效抗菌浓度。骨移植替代物类：包括磷酸三钙、羟基磷灰石、硫酸钙等。此类材料在提高局部抗生素浓度的同时，避免了疾病的传播，具有良好的骨传导性和生物相容性。硫酸钙的降解速度几乎和骨生长速度同步，且能完全降解，理论上能将所承载的抗生素完全释放，因此硫酸钙作为抗生素载体应用最广泛。实验研究表明，病灶局部抗生素浓度高，可有效治疗和预防感染，不经过血液循环，对肝肾等器官的毒性甚微，而且随着硫酸钙的吸收，会有新骨的形成，有利于骨缺损的修复。蛋白类材料类：包括胶原海绵、纤维蛋白原、纤维蛋白等，临床已单独或复合应用，此类材料大多是从自体、同种异体以及异种生物组织中提取。胶原海绵抗生素缓释系统的研究较多。高秋明等[52]利用纤维蛋白胶原复合骨形态发生蛋白和庆大霉素制作缓释药物系统治疗慢性骨髓炎，方法简便易行，未见不良反应。该类材料作为抗生素载体在骨科感染方面的应用没有抗生素骨水泥或移植骨普及。合成聚合物：包括聚羟基丁酸戊酯、聚酐、聚乙醇酸交酯、聚乳酸、聚己酸内酯等，具有以下特性[53]：①材料无毒性；②炎症反应少，可完全生物吸收或降解，无脏器内聚集，无需再次手术；③降解时间和速度可以人为控制，取决于相对分子质量的大小和植入物体积大小；④可在聚合物中添加其他药物，以获得更全面的治疗。体内外实验研究证明，聚乳酸和聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物抗生素缓释系统可持续释放6-8周的抗生素，而且具有良好的可降解性和组织相容性。药物释放模式、释放量与植入材料的种类和大小有关[54]。微球和微粒包囊技术制作抗生素微粒，能够达到抗生素的局部缓慢释放。实验表明，妥布霉素的聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物微粒植入兔骨髓炎模型，病灶局部释放抗生素可持续至少4周，材料降解并不影响骨的生长，治疗效果十分明显[55]。复合材料：由以上各种材料复合而成，例如羟基磷灰石-硫酸钙-壳聚糖，硫酸钙-羟基磷灰石，磷酸钙-明胶等，这类材料的特点：①通过调整各组分的比例来调整药物的释放时间和速度；②材料可提供骨诱导所必需的理化特性。"

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