2.1 内皮细胞促凝因子 血管损伤时，内皮细胞受到刺激从而打破抗血栓和促血栓作用之间的平衡，导致血栓形成[2]；内皮细胞释放出促凝因子包括组织因子(tissue factor，TF)、胶原(Collagen，Col)、纤维连接蛋白(fibronectin，Fn)、血管性假血友病因子(von wilbrand factor，vWF)、血小板反应蛋白(thrombospondin，TSP)、血小板激活因子(platelet activating factor，PAF)、纤溶酶原激活物抑制物(plasminogen activator inhibitor，PAI)，可通过介导血小板的凝聚作用以及凝血酶的活性参与凝血过程，由血管内皮细胞分泌的凝血因子Ⅴ(前加速素，proaccelerin)和Ⅷ(抗血友病因子，antihemophlic factor，AHF)将直接参与凝血过程的级联瀑布反应，相较于血管收缩因子，内皮细胞促凝因子在凝血、血栓形成过程中发挥的作用更为直接、迅速，相关的研究也更为广泛和透彻。 2.1.1 组织因子 组织因子是由26个氨基酸残基组成的跨膜单链糖蛋白，相对分子质量为47 000，是因子Ⅶ和因子Ⅶa的受体，人组织因子基因位于含有6个外显子和5个内显子的1号染色体上，lp21-lp22。组织因子由3个区域组成：胞外区由219个氨基酸组成，含2个丝氨酸2个赖氨酸3个色氨酸的重复序列，第49与57及第186与209位的半胱氨酸分别形成两个二硫键，胞外区含有4个与Ⅶa连接有关的氨基酸残基，胞质区由21个氨基酸残基组成，含3个丝氨酸残基，被证明有活性功能，是蛋白激酶C的作用底物，跨膜区含23个氨基酸，为一与磷脂结合紧密的疏水结构，已证实组织因子胞外区是与FⅦa结合并激发凝血功能的关键部位[3]，正常情况下，血管内皮细胞并不表达分泌组织因子，因此正常生理条件下组织因子在血液中的含量低，在凝血酶、CD40配体、组胺、血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子α以及氧型低密度脂蛋白的作用下含量将上升。组织因子的基本功能是凝血、促凝，同时在胚胎发育、恶性肿瘤的增殖生长、炎症以及动脉粥样硬化上均有作用，组织因子的非凝血作用基本都是通过蛋白酶活化受体2实现的。 当血管受损等病理性变化发生时，组织因子的作用被认为是外源凝血过程发生的开始[4]，近年来的研究表明，组织因子在内源性凝血过程中同样发挥着重要的作用。当内皮下层暴露出内皮细胞释放出组织因子，与factor Ⅶa结合形成factor Ⅶa/TF复合物，启动血液凝固的级联反应，复合物通过2条途径激活凝血过程：①直接激活factor Ⅹ，形成factor Ⅹa，在磷脂、Ca2+和factor Ⅴa存在的作用下，将凝血酶原转化为凝血酶；②激活factor Ⅶa，从而在磷脂、Ca2+和factor Ⅶa存在的作用下， factor Ⅹa激活factor Ⅹ[5]。组织因子基因层面的研究表明-603A/G和+5466A>G基因的多态性与静脉血栓栓塞没有显著相关性，对于基因层面的研究将成为今后的重点研究方向[6]。 2.1.2 胶原 胶原是一类体内含量丰富的蛋白质，也是一种常见的凝血因子，构成胶原的肽链富含甘氨酸和脯氨酸残基，前者含量近1/3，后者含量近1/4，肽链的序列中含有氨基酸衍生物羟赖氨酸和羟脯氨酸，序列中还含有少量的酪氨酸残基，在一级结构氨基酸呈现(Gly-X-Y)n周期性排列，其中 X、Y 位置为脯氨酸(PrO)和羟基脯氨酸(Hyp)[7]。胶原在机体中的分布广泛且种类较多，动物体内分布于血管内皮细胞中发挥凝血作用的主要是胶原Ⅷ型和ⅩⅢ型[8]；结构上，胶原由3条相互独立的肽链组成三螺旋结构，保证了胶原的稳定性和机械强度，同时对胶原进行交联反应，连接上一些生物活性物质将能够改善胶原的生物相容性、生物稳定性以及易于操作等性能[9]。 血管损伤后，血管内皮细胞胶原蛋白充分暴露，引起血小板发生黏附、聚集和释放，利于止血过程的后续进行。通过结合血小板上GPVI受体发挥作用，促进血小板的聚集，促进血小板释放亚细胞颗粒和分泌物，促进凝血，缩短血栓形成的时间；此外，胶原可以激活内源性凝血途径，诱导凝血酶的产生，凝血酶作用于血液中可溶性纤维蛋白原，使其变为不可溶的纤维蛋白[10]。Lode等[11]研究表明利用pH为4的胶原构建出的支架材料因其良好的相容性在脂肪和骨组织工程中将有较好的应用潜力；以胶原为主要成分的生物材料在伤口敷料、人工皮肤、血管移植物及涂层、心脏瓣膜、骨修复材料、药物运输载体等方面具有广泛的应用[12]。 2.1.3 纤维连接蛋白 纤维连接蛋白相对分子质量约为450 000，由人类第八、第十一对染色体基因编码表达产生。纤维连接蛋白含有多种生物大分子的结合位点，如肝素、胶原等，也能与多种细胞的表面受体结合包括神经元细胞、成纤维细胞等，因此纤维连接蛋白参与了机体众多的生理及病理过程，包括免疫炎症反应、伤口愈合、胚胎发育以及细胞的分化和黏附。纤维连接蛋白是一种二聚体大分子糖蛋白，由两个几乎相同的220-250 ku的亚基经二硫键相连接，亚基上共包括12个typeⅠ、2个typeⅡ、15-17个typeⅢ和一个可变序列Ⅴ区，TypeⅠ序列主要参与胶原蛋白和纤维蛋白结合，TypeⅡ序列同样参与胶原蛋白结合，TypeⅢ序列可与整合素及肝素结合[13]。 当血管损伤后，血小板源性纤维连接蛋白被释放，促进和加强血小板之间的凝聚、血小板对胶原和纤维蛋白(原)的黏附以及凝血物质的释放；同时，血小板释放出溶血磷脂酸(LPA)和鞘氨醇-1-磷酸盐(S1P)，通过纤维母细胞聚集内皮细胞等分泌的外源性纤维连接蛋白[9]，形成纤维连接蛋白-纤维蛋白网络即为血凝块支架，起到恢复血管完整性以及暂时性创伤治愈支架作用，当血浆中外源性纤维连接蛋白减少时，血小板a颗粒中的细胞纤维连接蛋白释放将增加，起到代偿作用，以维持正常的出血时间；纤维状的纤维连接蛋白被吸附到高分子聚合物的生物活性材料上，促进骨形态发生蛋白的表达，在低浓度生长因子环境下也发挥骨组织的生长和修复作用，避免了高浓度生长因子的不稳定性和不良反应[14]。 2.1.4 凝血因子 由凝血因子参与的内源性途径是凝血的一个重要过程，级联瀑布凝血过程以因子Ⅻ的激活起始，血管内皮细胞能够直接分泌的凝血因子包括Ⅴ(前加速素易变因子)和Ⅷ(抗血友病因子)，因子Ⅴ作为辅助因子加速factor Ⅹa对凝血酶原的激活，同时其Leiden突变是西方布加综合征和门静脉血栓患者的重要危险因素，在不同种族之间Leiden突变的患病率有所差异，在中国布加综合征患者中突变较为罕见[15]。因子Ⅷ在血浆中本不具有活性，需要在因子Ⅱa作用下转变为因子Ⅷa，因子Ⅷ将不稳定的纤维蛋白单体转变为牢固的纤维蛋白多聚体，生成不溶于水的纤维蛋白，形成血凝块，同时参与因子Ⅹ的激活，与血管性假血友病因子(vWF)也有特异性的结合位点[16]；对于凝血因子的研究现已进入到了基因层面，凝血因子基因的多态性对多种疾病的发生和发展有着直接的联系，股骨头坏死以及新生儿动脉缺血等疾病均与凝血因子的基因多态性有关[17-18]。 2.1.5 血管性假血友病因子 血管性假血友病因子是一种糖基化蛋白，由巨核细胞合成，在血小板ɑ颗粒、血浆和内皮下连接组织中产生，然后分泌到胞外或在Weibel-Palade小体内储存，血管性假血友病因子基因位于第12号染色体，全长178 kb，含2 831个氨基酸，由D-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2重复序列组成[19]；它具有经典的多聚体结构，相对分子质量从5×105到12×106不等，可以水解为更小的4种蛋白质水解片段而失活；在受到凝血酶刺激下进行分泌，同时作为内皮细胞表面的特征性抗原，在正常情况下，大量的血管性假血友病因子多聚体均储存在内皮细胞或者血小板中，仅有少量血管性假血友病因子游离于血浆中，当血管内皮细胞受损时，储存于Weibel-Palade小体中的血管性假血友病因子加速释放入血，同时血管性假血友病因子合成也有所增加，从而参与凝血过程，这样的调控过程有助于防止正常机体内出现病理性血栓[2]。由于内皮细胞受损时血管性假血友病因子分泌会增加，因此它也是反映内皮细胞损伤的分子标志物[20]。 血管性假血友病因子会引起血管性假血友病，在凝血过程中，血管性假血友病因子主要发挥两方面的作用：作为factor Ⅷ因子的载体和促进血小板黏附聚集，血浆中血管性假血友病因子与factor Ⅷ因子结合之后，可以保护其免受蛋白C及其他物质的抑制作用，防止factor Ⅷ因子的降解；同时血管性假血友病因子能促进factor Ⅷ轻链和重链单体的结合，最终使factor Ⅷ因子定位于血管损伤部位[21]；血管性假血友病因子上与血小板凝集有关的位点有GPIb和GPIbⅡa，血管性假血友病因子与血小板上GPIb受体结合激活了血小板的凝集，血小板黏附于血管内皮下组织，引起血栓的初步形成，并且有促进纤维蛋白原合成的作用，血管性假血友病因子还可促进血小板黏附和聚集使血液黏滞性增加。此外，血管性假血友病因子的特定结构对于其生物学功能及产生、存储和释放有着较为明显的影响[22]；在系统性红斑狼疮患者中，血管性假血友病因子的增加并不反映血小板的活化，而是炎症反应的增加[23]。 2.1.6 血小板反应蛋白 血小板反应蛋白作为一种血小板颗粒的分泌产物被发现，包括血小板反应蛋白1至血小板反应蛋白5，其中对血小板反应蛋白1的研究较多。血小板反应蛋白1是细胞外基质糖蛋白，为一种由血小板ɑ颗粒、成纤维细胞、血管内皮细胞等分泌的同源三聚体，由3条相同的单体通过二硫键连接而成，每条单体含1 152个氨基酸，根据血小板反应蛋白1与其他分子的作用，可将其分为6个功能区：①NH2末端肝素结合区；②与Ⅰ型前胶原同源片段；③含3个重复序列、与备解素同源的Ⅰ型重复区；④含3个重复序列、与表皮生长因子同源的Ⅱ型重复区；⑤含7个结合Ca2+重复序列、与钙调素同源的Ⅲ型重复区；⑥COOH末端细胞结合区[24]。血小板反应蛋白1对血管平滑肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞及炎症细胞均会产生影响，并且与心血管类疾病的关系密切[25]。 当内皮细胞受损或受刺激时，将产生血小板反应蛋白1，释放后储存于血小板颗粒中，血栓形成之初，血小板小颗粒聚集体将血小板反应蛋白1释放入血，与血小板表面Fg相互作用形成并稳定血小板大颗粒聚集体，促进血小板的非可逆性聚集，有报道表明，2/3的急性心肌梗死出现血栓发生在1周内同时伴有血小板反应蛋白以及糖蛋白Ⅳ增多，说明血小板聚集与血小板反应蛋白呈正相关[22]；同时，血小板反应蛋白1还可与纤维连接蛋白、胶原蛋白结合，是尿激酶型纤溶酶原激活剂和纤溶酶原的抑制剂，能够发挥抑制尿激酶型纤溶酶原激活剂介导的纤溶反应的作用。Lin等[26]研究表明血小板反应蛋白家族中的血小板反应蛋白2将可能作为癌症治疗反应的预测性生物标志物。 2.1.7 血小板激活因子 血小板激活因子是一种作用强烈的脂质介质，经磷脂酶A2作用后产生。血小板激活因子来源广泛，嗜酸粒细胞、肥大细胞、白细胞、内皮细胞、血小板、巨噬细胞、嗜碱细胞是其主要来源，血小板激活因子通常以前体的形式存在，一般不储存于细胞内，当上述细胞受到刺激，即发生反应，合成并释放血小板激活因子；不同立体构型决定了不同的生物活性，因而不同细胞之间分泌产生的血小板激活因子功能存在差异，血小板激活因子的作用包括提高血管壁通透性、刺激支气管平滑肌收缩、强烈促进血小板的变形聚集和释放功能等。血小板激活因子的合成包含至少2条相互独立的途径：类似于磷脂酰胆碱合成过程的从头开始合成途径和对膜磷脂结构进行改建的途径，对血小板激活因子有高度特异性的可溶性乙酰水解酶会将血小板激活因子降解为溶血血小板活化因子(Lyso-PAF)，从而被代谢或排出体外[27]。 血小板激活因子在体内的半衰期较短，但对机体的作用广泛而持久，对炎症、脑损伤、休克、胃肠黏膜损害及过敏反应和哮喘均有影响，同时具有很强的促血小板聚集作用，是介导血小板聚集的第三通路的介质[28]，不依赖于环加氧酶催化的花生四烯酸代谢途径和ADP的释放也可诱导血小板的聚集释放，在ADP耗尽以及环氧酶抑制剂处理之后依然能够引起血小板的凝聚，具体机制尚不明确。此外，肾上腺素能协同血小板激活因子促进血小板凝聚，血小板激活因子抑制剂能够对血小板激活因子与肾上腺素混合产生的血小板凝聚起到抑制作用。Hammond等[29]研究通过荧光标记的方法，对血小板活化因子在细胞内的作用机制进行了研究，通过介导钙离子通道的活性以及突触囊泡的胞吐作用从而使细胞钙离子浓度升高，影响机体的各项生理、病理活动。 2.1.8 纤溶酶原激活物抑制物 目前发现的纤溶酶原激活物抑制物包括纤溶酶原激活物抑制物1，2，3和蛋白酶联结素，纤溶酶原激活物抑制物1的活性占99%，发挥主要作用。纤溶酶原激活物抑制物1是一种单链糖蛋白，由379个氨基酸残基组成，纤溶酶原激活物抑制物1基因定位于人体7号，长度约为12.2 kb，包含9个外显子和7个内显子。具有活性的纤溶酶原激活物抑制物1包含3个糖化点，相对分子质量为52 000，主要由血管内皮细胞产生，存在于血小板、平滑肌、肌细胞及心肌等人体组织细胞中，在脾和肝中纤溶酶原激活物抑制物含量较高，而在心肌和脑中含量较低[30]。纤溶酶原激活物抑制物包括底物态、活性态和潜在活性态3种形态，在机体正常生理状况下，有活性的纤溶酶原激活物抑制物1将被很快氧化而休眠失活，因此大多数纤溶酶原激活物抑制物1在体内以潜在激活态的形态存在，血浆中纤溶酶原激活物抑制物1的含量极少，纤溶酶原激活物抑制物的活性或水平对于正常生理功能较为重要，过高会引起血栓形成，过低则容易导致出血。纤溶酶原激活物抑制物1对于组织型纤溶酶原激活物参与的纤溶过程有影响作用，对尿激酶型纤溶酶原激活剂参与生理病理条件下的组织修复、细胞迁移、肿瘤浸润及转移等过程也有作用[31]。 纤溶酶原激活物抑制物1通过与组织型纤溶酶原激活物形成复合物，使组织型纤溶酶原激活物失活，降低血浆中组织型纤溶酶原激活物的含量，同时纤溶酶原激活物抑制物1活性提高，从而减少纤维蛋白降解，降低血栓的溶解和纤维酶原活性而抑制纤溶，间接促进血栓形成，纤溶酶原激活物抑制物1对组织型纤溶酶原激活物的抑制作用仅限于血浆中游离的组织型纤溶酶原激活物，对于已与纤维蛋白结合的组织型纤溶酶原激活物则活性较低或不起作用，纤溶酶原激活物抑制物1与组织型纤溶酶原激活物形成的复合物可将在肝脏的代谢作用下被迅速消除[32]；纤溶系统的失衡有引起动脉粥样硬化的风险，进一步研究表明纤溶酶原激活物抑制物1水平的增加将增加心血管事件的风险，纤溶酶原激活物抑制物1水平可作为心血管疾病的预测性指标，支持了纤溶活性和强度在心血管疾病中的重要性[33]。 2.2 血管收缩因子  生理性的止血过程主要包括3部分：血管收缩、血小板血栓形成及血液凝固，小血管损伤时，将会立即引起血管的收缩，封闭受伤的血管口，当血管破损口不大时，可通过封闭血管破口，阻止出血，在封闭血管的过程中，血管收缩因子发挥了较大作用，但同时收缩血管因子会导致高血压、动脉粥样硬化等疾病的产生，因而具有两面性；由血管内皮细胞直接分泌产生的血管收缩因子包括内皮素(endothelin，ET)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、血栓素(thromboxane A2，TXA2)。 2.2.1 内皮素 内皮素由21个氨基酸残基组成，成熟内皮素相对分子质量大约为2 600，是迄今为止所发现的作用最强并且持续时间也最长的缩血管活性多肽[34]。内皮素家族包括3种亚型，内皮素1、内皮素2和内皮素3，在结构上3个亚型氨基酸稍有区别，内皮素结构与功能关系密切，内皮素1、内皮素2、内皮素3分别在内皮细胞、肾脏和神经系统中表达。血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、肺泡巨噬细胞、多形核粒性白细胞和成纤维细胞等均可分泌内皮素，人血管内皮细胞通过旁分泌途径分泌产生内皮素1，其收缩血管作用最为强烈[35]。机体的刺激如化学和机械刺激将诱导内皮素的合成，还未发现自然状态下内皮细胞可分泌内皮素，对内皮细胞的观察也未能发现有贮存内皮素的致密颗粒结构，人体生理条件下血浆的内皮素浓度很低，在受刺激的情况下内皮素的合成和释放将大为增强，内皮素通过内皮素受体(G蛋白偶联受体家族)发挥作用，内皮素对血管的收缩作用起效缓慢，但持续时间长，是长效的收缩血管因子[36]。内皮素与高血压、冠心病、充血性心力衰竭、心肌肥厚、动脉粥样硬化以及冠状动脉成形术后再狭窄等疾病密切相关。 2.2.2 血管紧张素Ⅱ 血管紧张素Ⅱ是一种多肽物质，在机体中发挥着多种作用包括调节水、电解质平衡、维持机体正常血压等，蛋白序列为Asp-Arg-Val-Tyr-IIe- Pro-Phe，主要为血管内皮细胞及血管平滑肌细胞分泌，血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)也可合成血管紧张素Ⅱ，当内皮细胞血管紧张素转化酶表达增高，血管紧张素Ⅱ含量随之增加并且对内皮细胞会产生损伤，血管紧张素转化酶会灭活缓激肽、水解多种内源性生物活性肽引起血管收缩及内皮细胞功能损害[37]。血管内皮细胞分泌的血管紧张素Ⅱ主要分为两部分，一部分通过内分泌途径进入血液循环，一部分通过旁分泌、自分泌途径等方式直接作用于血管壁平滑肌细胞，引起平滑肌收缩，从而导致血管收缩。血管紧张素Ⅱ能够影响血管内皮细胞分泌其他活性物质，能够促进内皮素的合成，同时，血管紧张素Ⅱ可通过介导钙通道的通透性或血管紧张素受体从而影响血管平滑肌收缩，使血管腔变狭小，辅助整个凝血过程，促进血栓形成。 2.2.3 血栓素 血栓素是血栓素合成酶催化前列腺素环内氧化物(PGH2)同分异构化的产物，参与一系列过程包括血小板聚集、血栓形成、血管平滑肌收缩、内皮功能紊乱、血管痉挛、细胞增殖和动脉粥样硬化等，血栓素可在血小板、巨噬细胞、动脉静脉血管平滑肌细胞、内皮细胞及心房组织局部产生[38]，是血管收缩因子和血小板聚集促进剂，主要以组织附近的自分泌或旁分泌中介的方式作用，通过与特异血栓素受体(TXA2R)结合诱导血小板的变形、聚集和收缩血管。血栓素水平上升也将促使动脉粥样硬化、冠心病和心绞痛。由于血栓素的半衰期短，会迅速转化为无活性的血栓素B2，因此在血栓素的测定上比其他因子更为困难，可用相对应的检测试剂盒进行含量检测。"