How to make animal models of intervertebral disc degeneration that fully simulate the human intervertebral disc degeneration?

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.027

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: The pathogenesis of intervertebral disc degenerative disease has not been determined. To establish the ideal animal model of intervertebral disc degeneration is an important approach to study the pathogenesis or treatment of the disease.
OBJECTIVE: To review model selection, modeling method and the advantages and disadvantages of the studies concerning various animal models of intervertebral disc degeneration.
METHODS: We retrieved Wanfang database, China National Knowledge Infrastructure database, PubMed database and FMJS database for articles on animal models of intervertebral disc degeneration in vivo and in vitro published in recent five years all over the world.
RESULTS AND CONCLUSION: The present literature shows that small and medium-sized animals are now commonly used animal model. Building methods can be divided into two major categories of in vivo and in vitro models. The in vitro model revealed mechanism of intervertebral disc degeneration by the cell or tissue culture from the cellular and molecular levels. In vivo model, different kinds of physical or chemical methods are used to intervene intervertebral disc, causing the intervertebral disc degeneration, proving the mechanism of intervertebral disc degeneration by the process of intervention. However, pathogenesis of human intervertebral disc degenerative disease is complex and has not been determined, so the current animal models are not comprehensive simulation of human intervertebral disc degenerative disease.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

Key words: Intervertebral Disk, Intervertebral Disk Degeneration, Disease Models, Animal

CLC Number:

R318

Ba Mu-deng, Aierken Amudong, Meng Xiang-yu. How to make animal models of intervertebral disc degeneration that fully simulate the human intervertebral disc degeneration?[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(18): 2940-2946.

Figures/Tables 1

2.1 模型动物的选择模型动物的选择是动物模型实验的重要基础工作，正确选择模型动物将对模型构建起到事半功倍的效果。模型动物的选择应参照一下标准：①模型动物的椎间盘应与人类有较好的相似性。②模型动物具备良好的可重复性。③模型动物应具备可操作性和经济性[3-4]。目前应用于构建椎间盘退变模型的动物有十几种，如鼠类、大白兔、犬、猪、羊、牛以及灵长类等。猴、猩猩等灵长类动物作为人类近亲，其椎间盘在生理构造和生物力学方面和人类椎间盘有较好的相似性，然而目前的动物实验研究受到动物来源、实验经费、实践操作以及伦理道德等方面的限制，灵长类动物极少被应用于构建椎间盘退变模型。大型哺乳动物也存在价格昂贵、饲养困难等缺点。目前动物模型的选择多选择大白兔以及大鼠等小型动物，该2种动物具有物种纯正、来源多、易饲养及价廉等优点。四足动物的脊椎生理构造及生物力学特性与人类相差甚远，不能良好模拟人类椎间盘退变的病理过程，为此研究者设计人为强迫直立行走，植入体内椎体间加压装置或椎间盘离体培养加压进行研究，并获得较好的研究成果。四足动物的椎间盘虽然和人类椎间盘缺乏比拟性，但对椎间盘的发病机制以及治疗做出了巨大贡献[5]。 2.2 体外椎间盘退变模型的研究 2.2.1 细胞培养模型细胞体外培养所建立的模型，可避免复杂的生长环境对组织细胞的影响，可区分单一或协同效应对细胞的作用，更重要的是可以人为控制实验条件以达到实验标准化[6]。体外培养椎间盘细胞主要分为单层平面培养和三维培养两种模式。单层平面细胞培养模型：细胞单层平面培养是是最常见的培养方法，是用培养板、培养瓶等培养皿培养细胞，细胞以贴壁模式生长于培养器皿中[7]。椎间盘组织主要由纤维环、髓核及软骨终板构成[5]，因此对椎间盘退变的细胞培养模型主要有纤维环细胞培养、髓核细胞培养以及软骨终板细胞培养。多数学者认为细胞学改变是椎间盘退变的必然表现之一，因而探索椎间盘退变的机制则必须有实用的细胞模型[8]。郭志良等[9]为研究建立体外培养大鼠椎间盘成纤维细胞模型，采用特殊酶分离成纤维细胞，并对其进行单层细胞培养，并通过不同化学染色方法来鉴定其细胞表型，结果显示该方法可以成功培养大鼠椎间盘纤维环细胞，并符合纤维环细胞特性。国外学者Park等[10]为研究糖尿病与椎间盘退变性疾病的关系及葡萄糖浓度对脊索细胞的损害剂量-时间效应，通过在不同浓度葡萄糖中进行单层平面培养脊索细胞，并比较它们在不同条件下发生的增殖、凋亡情况以及酶和蛋白质的表达能力。实验结果显示，比较对照组，脊索细胞在高浓度的葡萄糖条件培养下其增殖明显减少，而发生凋亡的细胞增加，蛋白质及酶的表达减少，这种趋势随时间延长及浓度增加而扩大。这种现象说明离体培养的脊索细胞在葡萄糖浓度升高的条件下会发生生物活性的降低，提示在人体血糖升高的条件下脊索细胞可能发生相似的生物活性变化。三维立体细胞培养模型：虽然单层细胞平面培养具有培养简单、易操作、费用低、可大量应用等优点，但其单层模式可能无法正常提供组织生长发育所需的环境条件，进而影响细胞生理功能。近年来，三维立体体外培养成为较常用的培养方法，其培养细胞的基因表达及细胞功能活动等方面与单层平面培养细胞有明显差异，而与体内细胞更为相似，可为细胞提供类似体内的生长环境。三维立体细胞培养常用的支架材料有藻酸盐凝胶、琼脂糖凝胶和胶原等[11-12]。有分析称通过三维小球聚集培养、微载体旋转立体培养等方法培养髓核细胞可以使其数量增多，并且肝细胞生长因子可以促进髓核细胞的增殖[13]。体外细胞培养有助于了解单种细胞的生理特性，并根据不同病理条件下的反应来研究疾病的细胞学发病机制。体外培养的细胞环境不同于体内生长的细胞环境，因此细胞培养模型仅能作为研究椎间盘退变发病机制的参考。 2.2.2 椎间盘器官培养模型椎间盘器官培养模型能够利用椎间盘自身的三维结构，确保椎间盘细胞及细胞基质生理性的完整，使细胞之间、细胞与基质间的生理联系成为可能，有助于细胞表型表达。器官培养模型同样具有细胞培养条件的优点，即可调控的优点，这对于研究器官生物信号转导和椎间盘对干预条件的反应有很重要的意义。与体内研究相比，椎间盘器官体外培养有效控制力学、化学条件并对培养器官采取干预措施。这点在体内动物实验研究中是基本不可能实现的，也存在伦理学争议[14]。国外学者Markova等[15]认为虽然已经在已知的椎间盘退变分子基础上取得了很多进展，但现在仍然缺乏一种临床前期模型来研究导致椎间盘退变的生化和分子的改变。为了模拟椎间盘退变结果，Markova等用大鼠的椎间盘分别在细胞因子溶液和限制血清中做离体培养，并利用定量反转录酶聚合酶链反应以及蛋白印记来比较分析实验组和对照组的不同的基因表达。结果显示诱导发生了上千种基因的表达，影响到细胞运动、细胞周期、细胞的发展、凋亡、增殖等多种细胞功能。其中包括已知的能够影响椎间盘退变的基因。该大鼠椎间盘离体培养模型利用细胞因子暴露法来诱导广泛的基因表达改变，Markova等认为这个离体动物模型是研究椎间盘退变病因学以及评价新的治疗方法的有价值的工具。国外学者Furtwängler等[16]利用牛尾椎间盘注射间充质溶解素、含血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶4和丝氨酸蛋白酶三种蛋白水解酶，1-4 d在压力负荷下培养，4-8 d在零负荷膨胀条件下培养以避免组织脱水，发现3种蛋白水解酶既不会明显改变基质降解，也不会对基因表达起到主要转变作用。但是，细胞活性显著减少，丝氨酸蛋白酶减少了椎间盘的高度，这明确与氨基葡萄糖和DNA含量改变呈一一对应关系。提示这些酶的高剂量应用或者联合使用很可能是椎间盘退变的必要因素。体外模型的研究因离体细胞或器官生命力逐渐衰竭的影响，研究结果可能会随时间推移发生偏移。因而椎间盘器官培养仅适合于短期研究[17]。长期影响的研究则必须在椎间盘退变体内模型中进行研究。 2.3 体内椎间盘退变模型的研究 2.3.1 改变力学特性模型椎体是动物机体的主要承重系统之一，其中椎间盘发挥了重要的缓冲及承重作用。因此椎间盘在正常生理条件下即处于一定量的机械力学负荷下。椎间盘由于缺少相应的机械力学刺激，或高强度、高频率的动态和静态的压缩负荷下，会导致椎间盘生理功能和结构性质的改变[18]。说明椎间盘退变与力学环境密切相关。机械压缩法模型：有研究发现椎间盘轴向压缩超出生理范围可以引起椎间盘的退变，由此机械载荷因素为始动因素而致使椎间盘退变的概念应运而生[19-20]。椎间盘的机械荷载使纤维环等结构发生损害，并发生一系列不可逆转的细胞学反应，而这些变化又因营养代谢通路的缺失，年龄增长，修复机制受损等因素进一步加重椎间盘退变，这明确了机械载荷因素与椎间盘退变存在着密切的关联[21]。不成熟髓核组织含有脊索细胞，人体椎间盘中成熟脊索细胞消失并被类软骨成熟髓核细胞取代被认为是椎间盘退变的早期表现[1]。国外学者Guehring等[22]认为研究脊索细胞的消失原因对研究椎间盘退变具有重要意义，其研究组进行随机对照实验，对实验组大白兔椎间盘通过手术植入加压装置，术后对比正常兔椎间盘与椎间盘受压模型的脊索细胞以及类软骨成熟髓核细胞组织学计数。结果显示脊索细胞对抗机械压力的能力弱于类软骨成熟髓核细胞，提示椎间盘压力负荷递增以及因终板结构改变造成的营养受限能够诱发脊索细胞的缺失。国内学者熊蠡茗等[23]同样进行类似随机对照实验，利用自制的克氏针加压装置贯穿大白兔椎体，轴向施加10 kg压力，结果显示随加压时间的延长实验兔的椎间盘的退变程度逐渐加重，加压1，2及4周组普遍出现轻、中度椎间盘退变，加压8周组均出现重度椎间盘退变。该实验结果说明轴向压力负荷可高效诱导椎间盘退变，在研究轻中度椎间盘退变方面具有优势。椎体不稳法模型：脊柱的关节稳定与平衡是靠椎体、椎间盘、韧带、肌肉、肌腱等组织的复杂的静力平衡和动力平衡来维持的[24]。通过手术破坏维持椎体平衡组织，或对椎旁局部肌肉持续刺激，造成椎间盘受力不均而导致异常生物力学改变可诱导椎间盘的退变[25]。 Peng等[26]进行动物实验研究软骨终板钙化与椎间盘退变的相关性，实验切除大白兔颈棘上、棘间韧带并分离颈椎后旁两侧的肌肉，该手术造成了颈椎力学上的失衡，进而造成椎间盘退变。通过病理学检查评定椎间盘退变程度和软骨终板钙化层的厚度。结果分析得出软骨终板钙化层的厚度与椎间盘退变程度呈明显相关性。实验结果说明颈椎软骨终板的不断钙化和骨化导致颈椎间盘营养发生障碍，这可能是导致颈椎间盘退变的关键因素。国内学者夏冬冬等[27]进行相关研究，通过手术对大白兔其第4、5两节腰椎植入自行研制的加载装置，可对之间的腰椎间盘施加50 N的剪切力，持续1个月后，大白兔的椎间盘纤维环组织排列紊乱、正常髓核细胞明显减少，说明一定的剪切力可导致动物椎间盘退变。被动直立法模型：人类的椎间盘退变性疾病在自然界中具有独特性，人类的直立行走行为所造成椎间盘压力增大被认为是椎间盘发生退变的重要因素[28]。因此对于四肢行走的哺乳动物，直立行走会明显改变椎间盘的生物力学，对椎间盘组织产生很大影响。直立行走动物模型能够更贴近人类脊椎的生物形态，能够更好地模拟人类椎间盘退变[29]。国内学者张超等[30]认为目前缺乏一种符合人类椎间盘退变规律的动物模型，并进行了相关实验研究。实验将将兔子固定在PVC管中并随机分组，实验组直立喂养，对照组正常喂养，结果显示第4周实验组比较对照组核磁检测无明显差别，病理检查提示髓核蛋白多糖降低；第8，12周实验组核磁检查较对照组椎间盘明显退变，病理检查提示髓核蛋白多糖明显降低。结果证实大白兔在直立位下因椎间盘受自体重力负荷影响造成退变。也有学者将大鼠双侧前肢从肩关节截肢以剥夺其上肢功能，强迫大鼠直立行动，并成功检测到大鼠椎间盘发生退变[31]。借鉴剥夺上肢功能的思路，将支配实验动物上肢的神经切断，造成失神经模型，亦或是建模的思路之一，目前并没有发现文献报道。椎间融合模型：椎间融合作为治疗椎间盘突出所造成的血管、神经以及脊髓压迫相应症状具有显著疗效，并广泛应用于临床[32-33]。椎间融合消除了所融合椎间盘的活动性，所融合椎间盘的相邻椎间盘的活动性则代偿性增加，国内外学者普遍认为这种代偿性活动性增加会加速邻近椎间盘的退变，近年已有许多研究报道这一现象[34]。国外学者Higashino等[35]将雌性新西兰大白兔的L3-4、L4-5两个椎间盘后外侧进行融合，12个月后：①邻近融合椎体尾端的椎间盘高度明显减少，头端的邻近椎间盘高度发生了较小程度的降低。②MRI显示实验组头尾端邻近椎间盘的信号强度相较对照组发生严重损失。信号强度的消失明显表现在尾端的邻近椎间盘，信号强度与融合的椎间盘相似。③组织学分析显示尾端邻近椎间盘发生了严重的退变，髓核和软骨终板缺少活细胞；头端邻近椎间盘髓核可以看到存活的细胞（尽管很少），还有存在活细胞的比较正常的软骨终板。在这个大白兔模型试验中，通过对椎间盘高度的测量、核磁共振检查以及组织学检查显示，邻近融合椎间盘的头尾两端椎间盘均发生了退变，尾端的椎间盘退变更为明显。 2.3.2 椎间盘组织损伤模型椎间盘损伤动物模型是采用手术方式将纤维环、髓核、终板进行损伤，造成相应的病理改变，进而造成椎间盘退行性变[36-37]。纤维环损伤法模型：纤维环位于椎间盘周围部，由纤维软骨组成，其纤维互相交叉、紧密分层围成同心圆状。纤维环的作用十分显著，能够稳定脊柱并保持一定活动度，保存髓核组织的水分并维持其位置和形状，最主要的是纤维环能够吸收震荡能量，减轻椎间盘的压力[38]。椎间盘退变形疾病是结构学和生物学改变联合引起的病理现象。通过椎间盘的应力分布改变导致纤维环损伤，这影响到了椎间盘的强度和完整性。国外学者Gregory等[39]实验结果显示，椎间盘的退变加重了纤维环层面的之间的层离潜力。鉴于这种纤维环退变发生的重大改变，临床干预治疗不仅要致力于髓核的再水合和再生，还要把修复和加强纤维环来限制髓核突出作为治疗重点。考虑到目前椎间盘退变的治疗包括了髓核的生物再生，纤维环残余的包裹新生髓核组织的能力就变得尤为重要了。国内学者张闻力等[40]比较了椎间盘纤维环粗针穿刺法、髓核抽吸法以及终板损伤法诱发椎间盘退变的效果，发现3种手术方法均可引起椎间盘退变，并随时间推移而加重，其中髓核抽吸法和终板损伤法相比纤维环穿刺法，引起椎间盘退变的时间较短、退变程度也较重。软骨终板干预模型：椎体上下面的骨骺板停止骨化后形成的轻度凹陷的骨板，即为骨性终板。椎体终板的中央覆盖一层终生存在的透明软骨，为软骨终板[41]。软骨终板具有营养椎间盘等多种功能。既往的研究表明用骨水泥封阻成年动物软骨终板的营养通路，其结果并没有明显造成椎间盘退变。目前接受椎间盘成形的患者日趋年轻化，因此对未成年人软骨终板的相关研究是有必要的。Kang等[42]实验对未成年猪的腰椎椎间盘进行手术干预，将其软骨终板用骨水泥密封，3个月后通过核磁及组织学检查，证实椎间盘发生了退变。实验最终提示未成年猪的腰椎软骨终板营养通路被封闭之后将造成对应椎间盘的退变，值得注意的是通过实验结果推测，目前临床手术对未成年人或年轻人软骨终板进行干预可能会影响邻近椎间盘的活力。酶化学物质法模型：将酶化学物质注射入动物椎间盘中可以使之产生椎间盘退变的效果，这也是国内外研究者常用的建立椎间盘退变模型的方法之一[43-44]。有国内学者为建立模拟人类椎间盘退变规律动物模型，应用N端相对分子质量30 000纤连蛋白片段对28大白兔椎间盘进行干预，实验通过X射线透视下用微量注射针及微量注射器将纤连蛋白片段注射如大白兔椎间盘内，发现随时间推移髓核细胞数量明显减少，并出现纤维环排列不规整，蛋白聚糖染色变浅甚至消失等，明确提示椎间盘内注射纤连蛋白片段将引起椎间盘退变，该法可作为研究椎间盘发病机制及防治的实验模型[45]。国内学者李左安等[46]进行随机对照动物实验，研究吸烟与椎间盘退变的相关性。实验对大鼠进行间断被动吸烟处理，吸烟时长2，4，8周不等，并设有实验组吸烟8周停止吸烟4或8周，相应时间点进行组织病理学检查判断椎间盘退变程度，以及通过免疫组化染色观察白细胞介素1β及白细胞介素1受体Ⅰ的表达，观察吸烟因素对椎间盘的影响，和去除吸烟因素后椎间盘产生的变化。结果显示吸烟后大鼠的椎间盘发生不同程度的退变，并与吸烟时间呈正相关，白细胞介素1β及白细胞介素1受体Ⅰ的表达也随吸烟时间的延长而增加；吸烟8周后停止吸烟数周的大鼠椎间盘的退变发生修复现象。该实验表明大鼠被动吸烟过程中吸入烟碱类物质，诱导椎间盘组织产生相应的炎症反应，尤其是白细胞介素1家族信号系统的表达，可能与椎间盘退变有密切关联。 2.3.3 其他模型自然退变模型：人类椎间盘间隙变窄、骨赘形成以及椎间盘退变是伴随年龄增长的普遍现象。但很少有适合于研究年龄相关的颈椎间盘自然退变的动物模型。国外学者Gruber等[47]使用沙鼠，一种公认的会随年龄增会发生腰椎间盘退变的鼠类，来研究其颈椎间盘自然退变的影像学和组织学变化，并比较是否与腰椎不同。最终通过影像学和形态学得出结论沙鼠的颈椎会随年龄增长而发生退变。 Clouet等[48]的实验则使用不同月龄的新西兰大白兔，在不同时段用影像学、组织学等多种方法检测实验兔椎间盘，比较各组大白兔的椎间盘影像学和组织学特征，最终得出兔的椎间盘随着月龄的增加而发生了明显的组织学上的改变。Sowa等[49]则观察同一组大白兔随月龄增长其椎间盘发生的变化，最终影像学和细胞学检查均发现大白兔椎间盘发生了显著改变，但同时指出这种普通老化动物模型发生核磁改变的退变在时间上要远远慢于其他的损伤退变模型。另外在髓核的基因表达分析研究中发现，老化模型与损伤模型之间具有显著差异。这些结果表明老化和损伤因素均能为椎间盘退变性疾病提供独特的动物模型。基因敲除模型：骨代谢的调控关系到多种调节因子，目前熟知的几种如骨保护素、核因子κB受体活化因子配基及其受体对骨代谢起到重要作用。体内骨质含量的动态平衡平衡是由核因子κB受体活化因子配基介导的骨吸收过程及核因子κB受体活化因子受体介导的吸收抑制过程来维持的[50]。既往的研究已经证实骨保护素基因敲除小鼠会表现出明显的骨关节炎和骨质疏松表型。郝晓东等[51]发现出生8周后该基因敲除的小鼠出现了椎间盘软骨终板退变，软骨终板细胞的排列呈不规则状，软骨终板及纤维环的外层可见有骨髓腔组织进入，提示骨保护素基因对维持椎间盘的正常结构和生理功能起到重要作用。椎间盘会因该基因的缺失而发生退变。自体髓核移植法：目前认为髓核组织因密闭于椎间盘内与自体免疫系统隔绝而不被识别，突出的髓核组织将受到自体免疫系统的攻击，所产生的免疫反应也被认为是椎间盘突出疼痛的重要因素之一。有研究证明腰椎间盘突出症患者的患部髓核边缘有明显的炎症和自身免疫反应[52-54]。国内学者徐宝山等[55]通过手术方法将髓核移植于坐骨神经旁，模拟坐骨神经痛模型，发现存在由移植髓核引起的全身及局部异常的自身免疫反应，并因此引起疼痛。低温等离子消融：低温等离子消融，又称多昵尔低温消融，是第4代物理治疗技术, 医学界专家一致认为数字化等离子治疗技术，代表了当今的最高治疗水平。多昵尔低温消融的基本原理是利用低温等离子射频的能量，在以较低的温度下对组织进行切除，从而避免对周围组织的损伤[56-57]。有研究将低温等离子技术应用到建立椎间盘退变模型中，发现低温等离子消融可使大白兔椎间盘出现椎间盘退变，而且早于单纯穿刺方法，证明低温等离子消融比传统方法能更快建立椎间盘退变动物模型，此法是可靠可行的[58]。"

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