Chinese Journal of Tissue Engineering Research ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (35): 6327-6332.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.35.017
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Li Rui-qi, Zhang Guo-ping, Ren Li-zhong, Li Ya-li, Lü Ya-jun
Received:
2013-04-03
Revised:
2013-06-20
Online:
2013-08-27
Published:
2013-08-27
About author:
Li Rui-qi★, Master, Associate chief physician, Department of Orthopedics, the First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China
li_ruiqi2008@126.com
Supported by:
Key Project of Hebei Medical Science Research, No.20120286*
CLC Number:
Li Rui-qi, Zhang Guo-ping, Ren Li-zhong, Li Ya-li, Lü Ya-jun. Evaluation of bone marrow mesenchymal stem cells for the treatment of osteonecrosis of femoral head[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(35): 6327-6332.
2.1 骨髓间充质干细胞的分离和培养 目前骨髓间充质干细胞的分离方法有:①贴壁筛选法[7]。②密度梯度离心法[8]。③流式细胞仪分离法[9]。④免疫磁珠分选法[9]。贴壁筛选法是根据骨髓间充质干细胞有贴壁生长,而造血系细胞悬浮生长的特性,通过定期换液去除不贴壁生长细胞,收集贴壁生长的骨髓间充质干细胞的方法,其操作简单,但所得细胞纯度不高。密度梯度离心法是根据不同密度骨髓细胞成分,去除掉红细胞,分离提纯骨髓单个核细胞,进行贴壁培养,操作较烦琐,但所得细胞纯度比贴壁法高。流式细胞仪分离和免疫磁珠分选技术需要骨髓量大,实验条件高,获得的骨髓间充质干细胞纯度高,但对细胞活性影响较大,甚至导致细胞完全失去活性。骨髓间质干细胞的体外培养,目前较多的是由加入胎牛血清、双抗的DMEM培养基完成,但需要多次换液和传代,一般取第3代骨髓间充质干细胞应用于临床治疗。 2.2 骨髓间充质干细胞标记及示踪 体外培养提纯的干细胞,体内生长、增殖及分化等情况需有一种长期、稳定、直观又不影响组织细胞形成能力的标记方法,且干细胞移植的疗效和安全性评估也需要进行连续监测。干细胞的示踪技术众多,每一种方法都有其优缺点,选择细胞示踪技术的标准是具有特异性强、灵敏度高、对细胞或机体影响小、标记和检测方法简单易行、标记时间合适等,干细胞的示踪技术仍需要进一步深入研究。 同位素示踪法:同位素示踪法是利用同位素的放射特性对组织细胞进行放射自显影、灰度测定、显微镜观察计数等,能观察细胞形态,判断细胞功能。目前常用示踪标记的核素有3H-、125I-、32P-、99Tcm-,其中以氚标记的脱氧胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)应用最为广泛。氚(3H)标记的脱氧胸腺嘧啶核苷是DNA的合成前体,能够有效地掺入到S期细胞的DNA 中,氚能够放射低能量的β射线,具有良好的示踪作用[10]。放射性同位素作为示踪剂具有以下优点[11]:①灵敏度高。②方法简便。③定位定量准确。④符合生理条件。⑤低毒。但同位素标记存在检测方法复杂、干扰因素多、放射性污染等。 抗原标记法:是利用当细胞处于DNA合成期而同时又有抗溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)存在时,BrdU通过与胸腺嘧啶竞争,特异性地掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列里,经免疫组化染色就可以观察到BrdU在细胞核内的存在。王小蕊等[12]利用BrdU在体外对骨髓间充质干细胞进行标记,观察BrdU阳性标记率,在倒置光学显微镜下观察细胞生长及增殖情况,应用流式细胞仪鉴定细胞表型,并进行成骨及成脂诱导分化,结果显示BrdU标记的准确性和标记率均较高,不影响细胞的形态、生长、增殖与分化功能。用BrdU标记干细胞的优点是[13]:①简单、快速、安全。②对比度高。③BrdU 既可用于活体标记,亦可用于细胞或组织细胞增殖、分化的标记。④无不良反应。⑤可用双标法显示标记细胞的其他特性。但是BrdU也存在标记率不稳定等缺点,而且BrdU的浓度和标记时间对标记率有一定的影响,何种浓度和标记时间为最佳尚无定论[14]。 荧光蛋白标记法:是利用基因载体将荧光蛋白基因导入待标记细胞,通过筛选获得表达荧光蛋白的细胞,可通过荧光显微镜直接观察,而不需反应底物。荧光蛋白可自发产生荧光的蛋白质,主要包括绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白。绿色荧光蛋白基因具有高效、无毒、稳定、易于检测等特性[15],被广泛用于移植干细胞在体内示踪等方面的研究。 荧光染料标记法:荧光染料标记是使用某些能够结合到细胞膜或细胞内不同组织上的荧光染料进行观察。常用的主要有PKH26、4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)、1,1’-双十八烷-3,3,3’,3’-四甲基吲哚碳花青-高氯酸盐(DiI)、羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)等。PKH26是一种具有亲脂性的红色荧光染料,能够与细胞膜的脂质区域稳定结合,细胞膜能发出红色荧光,不影响细胞的活力[16]。DAPI是一种可与DNA特异性结合的在紫外光的激发下发出浅蓝色荧光的荧光染料,适用于短期的标记示踪[17]。CFSE是一种可穿过细胞膜后,不可逆地与细胞内具有非酶促水解作用的梭基荧光素二醋酸盐基团结合,偶联到细胞蛋白质上的荧光染料,CFSE可用于活细胞标记[18]。DiI是一种易嵌入生物质膜内并在膜内作侧向扩散运动的亲脂性长链碳花青染料,从而标记整个细胞[19]。 MRI对比增强剂标记法:目前在细胞示踪研究中应用较多的主要是磁标记细胞MRI示踪成像技术,是在体外将待移植细胞用MR增强剂标记后移植,然后利用磁共振成像对细胞进行追踪。目前研究较多的,较为理想的磁共振示踪剂是超顺磁性氧化铁,经过转染剂修饰后,能有效进行细胞的磁标记。常用的转染剂包括鱼精蛋白(PRO),多聚赖氨酸(PLL),树状聚体(dendrimer),Lipofectam及FUGENETM等,灵敏度高;磁标时间长[20]。 2.3 骨髓间充质干细胞的成骨成软骨分化能力 骨髓间充质干细胞在不同诱导因素的作用下能够向成骨成软骨分化。程明等[21]联合应用地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C对分离培养的骨髓间充质干细胞进行骨诱导,诱导21 d后茜素红染色阳性,提示有钙结节形成,表明骨髓间充质干细胞具有向成骨细胞分化的能力,可分化为骨。Pittenger等[22]取原代培养3代以内骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向诱导,采用微球体诱导方式,即在体外以转化生长因子β1或转化生长因子β3为主要诱导因素,辅以维生素C、脯氨酸等添加剂诱导骨髓间充质干细胞,使其向软骨细胞方向诱导分化,此种方法为体外研究骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化开辟了新途径,可分化为软骨。 骨髓间充质干细胞成骨成软骨分化过程中常用的细胞因子有碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、成骨生长肽(osteogenic growth peptide,OGP) 核心结合因子α1(core binding factor-α1,Cbf-α1)、骨形态发生蛋白(bone genetic protein,BMP)、转化生长因子β(transforming growth factor -β,TGF-β)及胰岛素样生长因子(insulin like growth factor,IGF)等。 2.4 骨髓间充质干细胞治疗股骨头坏死 髓芯钻孔减压联合骨髓间充质干细胞注射移植治疗股骨头坏死:Hernigou等[23]对116例189 髋坏死之股骨头髓芯减压后,将自体骨髓离心后得到单核细胞注入股骨头。5-10年随访发现,Ⅰ、Ⅱ期145髋有9髋需要再次手术行髋关节置换。Gangji 等[24]对Ⅰ、Ⅱ期13 例18 髋股骨头坏死患者分别行单纯髓心减压和髓心减压加骨髓单核细胞移植,发现骨髓移植组患者疗效明显优于单纯髓蕊减压组,该疗法优点是微创治疗,保存更多的血供。但此方法仍存在一系列问题:减压区骨皮质外有出血形成血肿的可能,血肿形成有可能导致延迟伤口愈合,易于发生感染;在骨髓间充质干细胞提取液的注射过程中有泄漏的可能。 刘长安等[25]进行动物实验,采用液氮冷冻法制备兔股骨头坏死模型,然后随机分为2组,实验组髓芯减压钻孔后植入复合自体骨髓间充质干细胞的明胶海绵颗粒,空白组钻孔后单纯植入明胶海绵,X射线和组织学结果显示实验组钻孔区2周时有大量的成骨细胞,4周时充满新生骨小梁结构,8周时钻孔区内骨小梁成熟,小梁有骨髓组织填充;而对照组在8周时只在边缘形成骨小梁结构。王江泳等[26]采用液氮冷冻法制作兔股骨头缺血性坏死模型,然后随机分成自体细胞移植组和同种异体细胞移植组,在髓芯减压钻孔后分别植入含有自体或同种异体骨髓间充质干细胞的明胶海绵,植入8周时两组的钻孔区均出现骨小梁结构,骨小梁趋于成熟,可以看出同种异体和自体骨髓间充质干细胞移植均对兔股骨头缺血性坏死有良好的修复作用。 介入加骨髓间充质干细胞治疗股骨头坏死:治疗股骨头坏死的关键是恢复股骨头的血液供应,旋股内外侧动脉是供应股骨头的主要血管。介入治疗是将骨髓间充质干细胞联合溶拴剂、扩血管药物及骨生长药物直接作用于股骨头滋养血管,使骨髓间充质干细胞沉积于股骨头终末滋养动脉,发挥成骨及成血管作用,改善股骨头的血供。有研究表明,介入治疗后血管造影显示,股骨头供血区动脉增多和增粗,血流速度加快,治疗后的血供增加20%-110%[27-28]。 杨晓凤等[29]制备兔股骨头坏死动物模型,通过DSA介入,动脉注入骨髓间充质干细胞,细胞移植后4周移植组兔股骨头区供血动脉较对照组明显增多,移植后12周股骨头软骨、板层骨及骨小梁明显修复。有研究者采用介入疗法治疗了5例股骨头坏死患者,将自体骨髓干细胞注入治疗侧旋股内、外动脉及闭孔动脉内,治疗后随访1年,结果显示5例股骨头坏死患者的临床症状明显缓解,髋关节Harris评分显著提高,但髋关节活动度无明显改变,未发生严重并发症[30]。以上结果说明通过介入移植骨髓间充质干细胞治疗股骨头坏死是一种安全有效、便捷的方法,还可以免除开放性手术的痛苦,为治疗早期股骨头坏死开辟了新的思路。 基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗股骨头坏死:骨髓间充质干细胞具有易于被外源基因转染且稳定表达的特性,所以将转染了目标基因的骨髓间充质干细胞,与不同载体材料复合后植入股骨头坏死区可治疗股骨头坏死,这种将生物技术、组织工程技术及基因转染技术相结合的方法,为股骨头坏死的治疗提供了新的途径。 陆斌等[31]通过结扎旋股内外侧动脉和液氮灌注法建立了羊股骨头无菌性坏死模型,将转染了骨形态发生蛋白2基因的自体骨髓间充质干细胞与 磷酸三钙多孔材料复合物植入骨缺损处,16周后取材,结果发现植入区松质骨标本和软骨下骨的最大抗压强度、弹性模量均与正常骨接近,显著大于未治疗组和转染对照基因的对照组,说明转染骨形态发生蛋白2基因的自体骨髓间充质干细胞移植可促进坏死股骨头的修复,可能是因为转染基因的干细胞可持续表达骨形态发生蛋白2,促进了该部位和周围的新骨生成,改善了松质骨和软骨下骨的力学性能。Xiao等[32]联合人重组骨形态发生蛋白2的骨髓间充质干细胞培养的支架材料干预,组织学也提示有正常骨修复,提示骨形态发生蛋白2基因转染的骨髓间充质干细胞移植是治疗股骨头坏死的有效途径。崔大平等[33]观察VEGF-165联合骨形态发生蛋白2体外修饰骨髓间充质干细胞移植治疗兔股股骨头坏死效果:不同时间点血管数量及修复区新骨面积比显著高于对照组。提示VEGF-165联合骨形态发生蛋白2基因转染加强了骨髓间充质干细胞成骨作用,提高了新生骨的数量与质量,加快了股骨头坏死的修复。但是基因转染骨髓间充质干细胞移植到体内后是否会发生突变和导致肿瘤或者畸胎瘤可能是临床治疗中最令人担忧的问题,虽然没有人报道,因此必须建立可靠的技术方法和评价体系。 骨髓间充质干细胞的组织工程技术治疗股骨头坏死:组织工程是应用生命科学与工程学的原理与技术,在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上,研究开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科[34]。其基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种具有优良细胞相容性并可被机体降解吸收的生物材料上形成复合物,然后将细胞-生物材料复合物植入人体组织、器官的病损部位,在作为细胞生长支架的生物材料逐渐被机体降解吸收的同时,细胞不断增殖、分化,形成新的并且其形态、功能方面与相应组织、器官一致的组织,从而达到修复创伤和重建功能的目的。 Livingston等[35]将培养扩增后的骨髓间充质干细胞与支架材料复合用于犬骨缺损修复,8周后植入物几乎每个孔中都含相当量的新骨,而且受体骨与植入物的界面上也有大量新骨生成,形成跨缺损区的一个骨连续带;16周后骨缺损逐渐修复,这充分证明了骨髓间充质干细胞 修复骨缺损的能力。孙伟等[36]将纳米晶胶原基骨与骨髓间充质干细胞复合制备细胞-材料复合体,然后将其植入兔双侧股骨头内骨缺损区填充,植入后4周骨缺损区即有明显的成骨反应和新骨形成,股骨头内填充细胞-材料复合体的复合材料组骨小梁结构形成,植入后12周股骨头的骨缺损区基本修复。结果说明纳米晶胶原基骨材料有较好的生物相容性,适合骨髓间充质干细胞黏附、生长、增殖和分化;纳米晶胶原基骨材料也具备适当的可降解性,能在降解过程中逐渐被新骨替代;同时该材料还有较强的传导成骨作用,复合骨髓间充质干细胞后能促进骨缺损的修复,是修复兔股骨头骨缺损的良好移植材料。"
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