2.1  甲状旁腺激素  甲状旁腺激素是由甲状旁腺主细胞合成并分泌的一种含有84个氨基酸的直链肽，相对分子质量为9 500，其生物活性决定于氨基端的第1-27个氨基酸残基。其作用主要是升高血钙和降低血磷，是调节血钙和血磷水平最重要的激素。 2.1.1  甲状旁腺激素相关信号通路  甲状旁腺激素受体分为3类：甲状旁腺激素受体1，甲状旁腺激素受体2，甲状旁腺激素受体3。其中，甲状旁腺激素受体1主要分布于肾脏和骨骼，与甲状旁腺激素结合后启动cAMP-PKA、PLC等多个胞内信号途径。Guo等[1]研究发现甲状旁腺激素受体1基因突变鼠，腺嘌呤环化酶可激活，但PLC信号途径不能被激活，10周后出现骨小梁骨量低，证明了甲状旁腺激素受体1对激活PLC途径，维持骨代谢平衡发挥重要作用。 2.1.2  甲状旁腺激素与骨代谢  持续间歇应用的甲状旁腺激素作用于骨骼系统，会出现骨形成和骨吸收双重作用。 甲状旁腺激素作用于靶细胞膜，活化腺苷酸环化酶系统，增加胞质内cAMP及焦磷酸盐浓度，从而导致血Ca2升高。当血Ca2+浓度降低时，可加快Ca2+在肠道的吸收，在肾的重吸收，促进破骨细胞和骨细胞调节的骨Ca2+的释放，从而使Ca2+水平恢复正常，对骨代谢平衡产生影响[2]。 甲状旁腺激素促骨形成作用基础是小剂量和间歇使用。小剂量甲状旁腺激素可刺激骨细胞分泌胰岛素样生长因子和转化生长因子，促进成骨祖细胞增生分化。而间歇使用主要是使小梁骨增加[2]。 大剂量甲状旁腺激素促进前破骨细胞和间质细胞转化为破骨细胞，成骨细胞功能受抑制，且增加破骨细胞数量和活性，从而多种水解酶和胶原酶分泌增加，大量乳酸和柠檬酸等酸性物质产生，促进骨基质和骨盐的溶解。成骨细胞可表达甲状旁腺激素受体1，与甲状旁腺激素结合后，增殖分化加强，并产生骨基质以及分泌生长因子、细胞因子如RANKL等，破骨细胞则否。RANKL与前体破骨细胞或成熟破骨细胞上相应受体结合后，可刺激前破骨细胞成熟和骨吸收[3]。所以，甲状旁腺激素的作用首先是促进骨形成，其次是通过成骨细胞与破骨细胞之间的相互作用，增加骨吸收。在用药1个月后开始新骨形成，用药达6个月以后骨的吸收也增加，18-24个月是骨代谢的平衡时期[4]。 2.1.3  甲状旁腺激素与骨折风险  重组人甲状旁腺激素可预防骨质疏松骨折发生及降低再骨折风险。Neer等[4]研究发现重组人甲状旁腺激素1-34治疗绝经后骨质疏松妇女19个月后，降低椎体骨折风险达65%，非椎体骨折40%。甲状旁腺激素降低椎体骨折风险的作用大于非椎体骨折，原因可能在于小梁骨比皮质骨更易受重组人甲状旁腺激素的影响。 2.1.4  甲状旁腺激素联用骨吸收抑制剂  甲状旁腺激素可单用，亦可与雌激素、降钙素、二膦酸盐或活性维生素D等联合应用。Black等[5]研究发现甲状旁腺激素联用雌激素时，疗效强于二者单独使用；而联用阿仑膦酸盐时，疗效并不强于单独应用，而且阿仑膦酸盐能减弱重组人甲状旁腺激素的促骨合成代谢作用，因此不建议同时服用。另一方面，单剂量唑来膦酸联用重组人甲状旁腺激素每日皮下注射相对于每种药物单独应用时，全髋关节和脊柱骨密度增加更明显更快速，所以这种联用方式对高骨折风险的骨质疏松患者更有益。但多数学者不建议重组人甲状旁腺激素与双膦酸盐类药物同时使用，可先后使用。在重组人甲状旁腺激素停止使用的第1年内，因骨吸收的持续作用，造成人体关键部位4%的骨量丢失，所以也可在重组人甲状旁腺激素使用结束后序贯使用抗骨吸收药物[6]。 2.1.5  皮下注射重组人甲状旁腺激素的局限性  皮下注射是重组人甲状旁腺激素常见给药方式。尽管重组人甲状旁腺激素耐受性比较好，在临床使用中依然存在一些不良反应，如血钙过多，恶心呕吐，头昏头痛，肌阵挛等。但重组人甲状旁腺激素1-84发生血钙过高的风险相对较低[6]。另外，重组人甲状旁腺激素与骨肉瘤的发生有关，使用因此受限制[7]。      重组人甲状旁腺激素对非椎体骨折的作用有限，因长期使用，快速耐药反应发生，药效逐渐减小；随时间的延长骨吸收代谢作用被激活、骨形成作用下降等诸多因素，使其不能完全满足临床需求。重组人甲状旁腺激素对骨质疏松的治疗时间，在美国限定在24个月内，欧洲规定为18个月[7]。因此，需要进一步实验研究不同的重组人甲状旁腺激素的给药途径，以及如何促进内源性甲状旁腺激素的分泌。 2.1.6  重组人甲状旁腺激素皮下注射外的其他新型给药方式  无论是重组人甲状旁腺激素1-84，还是重组人甲状旁腺激素1-34，皮下注射后，均可迅速达到最高药物浓度，但却同时存在作用时间短的问题。长期注射难免带来一些治疗不良反应。      Cosman等[8]研究发现在皮肤上贴上一种带显微操作针的贴片时，重组人甲状旁腺激素可自行经皮吸收。实验结果表明，对绝经后骨质疏松妇女，40 μg重组人甲状旁腺激素1-34经皮吸收时，腰脊柱骨密度增加程度与皮下注射时相同，但全髋关节骨密度增加程度相比而言更显著。由此可以看出，经皮吸收方式相对每日皮下注射而言可能对骨皮质微结构的改良更有益。 某随机对照临床试验Ⅰ阶段研究了重组人甲状旁腺激素的新型口服给药方式。伴随应用100或      200 mg 5-CNAC吸收促进剂时，随口服重组人甲状旁腺激素1-34剂量的增加，血中甲状旁腺激素浓度增加，与皮下注射结果类似。经呼吸道吸收方式目前也正在研究当中，效果尚不明了[9]。 2.2  甲状旁腺相关肽  甲状旁腺相关肽缘于最初  36个氮基酸序列及功能与人甲状旁腺激素高度相似而得名。甲状旁腺相关肽可连接并激活甲状旁腺激素受体1 [10]。甲状旁腺相关肽对50-75岁绝经后骨质疏松妇女的骨合成代谢促进作用，实验组每日皮下注射400 μg甲状旁腺相关肽1-36，腰椎骨密度增加4.7%，没有观察到明显不良反应[11]。有实验研究了甲状旁腺相关肽的治疗窗，中毒剂量以及是否能作为单纯的骨合成代谢促进药物。该实验给予41名中年绝经后骨质疏松妇女剂量不断增加的可耐受范围的甲状旁腺相关肽1-36，实验结果表明大剂量用药对内环境矿物质的稳定无不良影响，且未发现严重不良反应。当给予最大剂量750 μg/d时，少数患者出现轻度血钙过多的不良反应，但可能是甲状旁腺相关肽激活1,25-(OH)2-Vit D导致的肠吸收Ca2+增加，而不是甲状旁腺相关肽对破骨细胞骨吸收的直接作用所致[12]。甲状旁腺相关肽类似物BA058皮下注射治疗骨质疏松患者1年后，关键部位如脊柱，髋部骨密度的增加比重组人甲状旁腺激素更快且显著，血钙过多的风险减小。BA058已进入Ⅲ期临床试验，而且经皮贴片吸收方式正在研究当中。由此可见，甲状旁腺相关肽也可作为一种骨合成促进剂。 甲状旁腺相关肽作用时，骨吸收生化指标1型胶原蛋白羧基端和氨基端以及脱氧吡啶啉未见明显变化，但骨合成指标降钙素和P1NP升高[13]。结果表明重组人甲状旁腺激素与甲状旁腺相关肽作用机制可能不同，配体和受体结合的开关机制不同，从而导致下游信号传导的差异。因此认为甲状旁腺相关肽与重组人甲状旁腺激素不同，选择性地刺激骨形成，不伴随骨吸收作用的激活甚至降低骨吸收过程。甲状旁腺相关肽某种程度上优于重组人甲状旁腺激素，有希望发展成为一种纯粹的骨合成促进剂，但甲状旁腺相关肽的长期应用效用及安全性需要更多实验来明确。 2.3   Calcilytics对骨合成代谢的作用 2.3.1  Calcilytics增加内源性甲状旁腺激素的分泌  钙敏感受体是甲状旁腺细胞膜表面表达的7次跨膜的G蛋白偶联受体超家族C家族的成员。细胞外Ca2+是其主要配体和激动剂。两者结合后，通过G蛋白激活磷脂酶C(PLC)-IP3通路及酪氨酸激酶-丝裂原蛋白激酶通路，引起内质网或肌浆网释放Ca2+，以及细胞外Ca2+内流，使细胞内Ca2+增加。当Ca2+浓度升高时可抑制甲状旁腺激素的分泌，相反，当血Ca2+水平低时，钙敏感受体活性减小，从而起刺激内源性甲状旁腺激素合成及分泌入血的作用[11]。 这一信号系统易受小分子钙敏感受体变构调节剂的控制，如负向调节剂Calcimimetics可治疗血钙过多及继发性甲状旁腺亢进，正向调节剂Calcilytics可诱导甲状旁腺激素的合成和分泌[14]。Calcilytics的短时作用可模拟人体血钙过少状态，且不依赖于细胞外Ca2+的浓度，进而促进内源性甲状旁腺激素的爆发性分泌。除这种快速作用之外，Calcilytics应留有足够多的空间及足够低的容量分布，以及时适应于皮下注射用甲状旁腺激素的药代动力学过程，减少血钙过多、骨再吸收等副作用的发生风险。另一方面，如果口服方式使用，Calcilytics可能比重组人甲状旁腺激素更为方便[15]。 除通过甲状旁腺中钙敏感受体间接作用于骨平衡外，Calcilytics 和Calcimimetics还可直接影响骨细胞。因为钙敏感受体同样表达于成骨细胞和破骨细胞的细胞膜表面，可能对调节细胞的募集，分化及生存有一定作用[16]。 2.3.2  Calcilytics类似物  Calcilytics类似物近年来逐渐引起研究者的关注。首次应用的Calcilytics类似物是NP-S2143，由于其半衰期长，NP-S2143对切除卵巢的大鼠模型接连使用5周时，可引起血中甲状旁腺激素水平至少4 h的持续升高，且骨更新程度增加，但骨密度并未相应升高。基于骨形成及骨吸收作用被激活的实验发现，考虑同时应用抗骨吸收药物17-β雌二醇，此时骨量有所增加[17]。Ronacaleret是一种NP-S2143类似物，但减少了后者非靶向作用以及缩短了半衰期。第一个关于应用Ronacaleret的多中心随机双盲对照试验测试了其对596名低骨密度绝经后骨质疏松妇女的药物疗效。12个月后，相对于空白对照组而言，Ronacaleret组和重组人甲状旁腺激素组骨更新相关生化指标均有所提高，而阿仑膦酸盐组降低。且Ronacaleret组使血甲状旁腺激素升高的作用更长久更稳定。然而，Ronacaleret组腰椎骨密度增加程度显著低于其他实验组，全髋骨密度反而降低[18]。因此中断了该复合物对骨质疏松治疗的临床实验研究[19]。     单剂量短效复合物SB-423562(一种新型Calcilytics类似物)静脉注射使用及其前体药物SB-423557口服应用时，也可引起内源性甲状旁腺激素的短暂释放增加，类似于注射重组人甲状旁腺激素所起的作用。对切除卵巢的老鼠模型，口服应用SB-423557，可增加骨形成作用，提升骨机械强度[20]。     药物ATF-936是另一种Calcilytics类似物，口服单剂量后，可有效而快速地提升甲状旁腺激素的含量。对成年实验大鼠，8周内每日口服应用ATF-936时，胫骨近端骨密度显著增加，骨小梁及皮层骨厚度提高。而且，ATF-936可被人体良好耐受[18]。 2.3.3  Calcilytics药物局限性  虽然Calcilytics治疗骨质疏松有一定疗效，但其临床应用同时也存在一些局限性：①Calcilytics治疗窗很小，使用时难以控制。②由于钙敏感受体也表达于肾脏、脑等甲状旁腺以外的器官，治疗作用外的非靶向作用难以避免。③一旦Calcilytics使钙敏感受体失活，甲状旁腺分泌小泡释放内容物甲状旁腺激素及嗜铬粒蛋白，后者具有抑制甲状旁腺激素的进一步释放和其他一些副作用[21]。目前关于Calcilytics治疗骨质疏松的相关研究仍在进行，对其通过调节甲状旁腺激素从而促骨合成代谢的作用，研究者尚未达成统一意见。 2.4  Wnt/β-连环蛋白信号传导通路相关骨合成促进剂 2.4.1  Wnt/β-连环蛋白与骨代谢  Wnt家族是由一系列富含半胱氨酸保守序列的分泌型糖蛋白构成。Wnt/β-连环蛋白信号传导通路是参与骨代谢调节的经典通路。当Wnt与frizzled蛋白、低密度脂蛋白受体相关蛋白偶联受体5/6(LRP5/6)结合时，β-连环蛋白次磷酸化作用，通路被激活，利于成骨前体细胞向成骨细胞转化，成骨细胞增殖及分化功能加强，破骨细胞活性未改变，骨合成代谢活跃。多种物质可高度调节Wnt/β-连环蛋白信号传导通路,如硬化蛋白(sclerostin)，Dickkopf( Dkk) 家族，分泌型的Frizzled相关蛋白(Frizzled－related protein，sFRP) 家族，糖原合酶激酶(glycogen synthase kinase-β，GSK3β)等[22]。由于Wnt信号通路与多种组织细胞的生命过程有关，相对于细胞内的调控因子而言，细胞外的一些分泌性蛋白更有可能成为骨细胞特异性作用靶点。 2.4.2  抗Selerostin抗体  SOST基因编码的一种分泌型糖蛋白骨硬化蛋白(Sclerostin)是成熟骨细胞的蛋白产物，仅在成骨细胞和骨细胞中表达。骨质疏松及其他多种骨代谢病患者体内Sclerostin蛋白水平升高。Sclerostin可作为Wnt通路的特异性抑制因子，结合LRP5/6后下调Wnt信号，多数还可竞争性与骨形态发生蛋白受体结合，下调骨形态发生蛋白的活性，协调骨代谢过程，抑制骨形成。另外，Sclerostin还可以增加成骨细胞的凋亡蛋白酶活性，进而诱导成骨细胞的凋亡。因此sclerostin有望成为骨质疏松的新型治疗靶点[23]。 研究者敲除老鼠Sclerostin基因后，发现将导致高骨量，且小梁骨及皮质骨均显著增高[24]。抗Selerostin抗体不仅增加正常雌性大鼠的骨量和骨强度，还可逆转切除卵巢导致的大鼠骨量丢失。将抗Selerostin抗体注射进成年雄性大鼠体内时，骨形成增加，长骨、腰椎骨的骨量及机械强度也有所提高。在骨愈合模型中，抗Selerostin抗体对骨形成的作用也很明显，可显著促进骨折愈合[25]。因此，抗Selerostin抗体有望成为新型骨合成促进剂。     Padhi等[26]在第一阶段临床试验中，测试AMG785(一种抗Sclerostin 的单克隆抗体)对健康男性及绝经后骨质疏松妇女的作用。1个月后，单剂量10 mg/kg皮下注射的骨形成指标增加水平相当于重组人甲状旁腺激素每日注射使用6个月，而且骨吸收水平降低。这种抗吸收作用与Wnt通路介导的骨保护素表达增加有关。另外，应用AMG785后，腰椎和全髋骨密度的增加水平类似甚至超过重组人甲状旁腺激素的作用。由此可以看出，Wnt通路中内源性抑制因子的拮抗药可促进骨形成，且不伴随骨吸收增加。 2.4.3  Dkk1抑制剂  DKK家族参与胚胎结构形成，并与骨代谢及肿瘤发生密切相关，由Dkk-1，2，3，4 以及Dkk-3 相关基因soggy构成。其中，DKK-1含有2个富含半胱氨酸的结构域，可与LRP5 和LRP6 共受体结合，形成内吞小体，进而阻止Wnt－Frizzled复合体形成，或直接结合LRP5/6形成三聚体后促进其内化，封闭Wnt通路信号，抑制Wnt/β-连环蛋白经典转导途径，增加破骨细胞的发生。 目前抑制Dkk-1作用的药物研究对象主要包括抑制Dkk-1表达的反义寡核苷酸和Dkk-1单克隆抗体。Wang等[27]研究发现Dkk-1的反义寡核苷酸可有效终止卵巢切除术诱导的大鼠骨量丢失及骨机械强度下降，并一定程度上增加成骨细胞数量。抑制Dkk-1的表达可延迟糖皮质激素性骨质疏松的发  生。Dkk-1中和调节抗体通过阻止肿瘤坏死因子调节受损的骨形成作用，抑制骨细胞死亡和破骨细胞活动，保护肿瘤坏死因子过表达大鼠骨的炎症性丢失。而且，Dkk-1抑制剂可逆转风湿性关节炎性骨破坏为骨形成性骨关节炎，骨赘的形成归因于Wnt通路的局部受激[28]。但是，Dkk-1抑制剂对骨质疏松患者的安全性和有效性有待进一步实验研究证明，它比Sclerostin抗体更少受限于骨的微环境，且Dkk-1对骨外组织发育也是必须的，所以可能增加药物的非靶向作用[29]。 2.4.4  sFRP抑制剂  分泌型的Frizzled相关蛋白(Frizzled-related protein，sFRP) 家族是Wnt信号通路的一种常见生理抑制剂，在各种组织中广泛表达，能对破骨细胞及成骨细胞的分化及功能起调节作用。有效地抑制 sFRP可程序式激活Wnt通路经典和非经典信号转导途径，从而可能引起骨质疏松患者骨量的潜在性增加。      sFRP家族中Sfrp1与骨质疏松关系最为密切。Sfrp1基因显示与骨密度及骨盐含量相关的多态性，Sfrp1基因敲除鼠的骨折修复加速，成骨细胞凋亡受抑制，骨形成作用增加，骨密度上升。Sfrp1系统性超表达抑制了成骨细胞功能及甲状旁腺激素的合成代谢作用[30]。因此，sFRP也可能成为增强Wnt通路的有效靶目标，但经典与非经典转导途径的双重激活可能导致骨密度不良反应方面不同的临床结果。 2.4.5  锂和糖原合酶激酶(glycogen synthase kinase-3β，GSK3β)抑制剂  GSK3β可在多种细胞类型中表达并起作用，缺乏对骨骼的特异性作用，但GSK3β抑制剂对骨质疏松的治疗仍可能有用。锂是一种通常使用的非特异性GSK3β抑制剂，以非受体依赖的方式激活Wnt通路，进而增加骨量。临床试验中，锂盐减少骨形成和吸收指标水平，却能有效增加骨密度。而且，锂能一定水平降低骨折风险，停止使用时骨折风险反而增加。这是否与锂对骨的直接作用有关尚不清楚。锂能影响Ca2+平衡，造成其他一些非骨骼系统副作用[31]。所以，锂作为一种骨合成作用促进剂，应用可能受限。 一些特异性的小分子抑制剂，如60328131-8，也能引起GSK3β的失活。其可促进切除卵巢大鼠的骨形成，增加股骨、胫骨骨量和骨机械强度。新型GSK3β抑制剂AR28可诱导β-连环蛋白的核转移，2周后可见骨量增加，可能与促进脂肪源性间充质干细胞分化为成骨细胞有关[32]。 2.4.6  Wnt通路激活药物的局限性  虽然Wnt通路激活药物是种很有前景的骨形成促进剂，但安全性问题特别是可能的致瘤作用及不受控制的骨形成存在的隐患如颅内压增高，听觉视觉受影响等不容忽视。 Wnt通路的异常激活与多种肿瘤尤其是结肠癌有关。一些研究表明，部分内源性Wnt通路抑制因子的去除，如Wnt 抑制因子1(WIF1)，可导致骨肉瘤的发展。Sclerostin或Dkk1抗体相关临床试验也未见明显的致瘤性。氯化锂对硬化性骨化病的长期治疗中，患者的肿瘤易感性未见明显增加[33]。但致瘤性作为主要的不良反应，仍需要密切关注。 2.5  甲状旁腺激素通路与Wnt信号通路之间的相互作用  Wnt信号通路有助于调节甲状旁腺激素的骨合成促进作用。敲除鼠Lrp5基因后，甲状旁腺激素的骨合成促进作用减弱。 有学者表明甲状旁腺激素可抑制GSK3β，稳定β-连环蛋白[34-35]。当甲状旁腺激素与其相应受体结合时，甲状旁腺激素受体1和Lrp6可形成复合物，进一步导致β-连环蛋白破坏复合体的降解[36]。甲状旁腺激素作用于骨细胞，减少Wnt通路抑制因子sclerostin和Dkk1的表达[37]。这种内源性抑制因子的减少导致相应细胞中自分泌Wnt信号通路的传导增强[38]。所以，两个通路之间的其他相互作用还有待实验进一步研究证明。 2.6  活化素(activin)抑制剂   活化素(activin)与Ⅰ型受体(ActRⅠA，ActRⅠB)或Ⅱ型受体(ActRⅡA，ActRⅡB)结合后，可拮抗人造骨细胞的分化，抑制破骨细胞的形成和骨吸收。所以，抑制内源性activin的作用可相应促进骨形成，阻碍骨吸收[39]。 ACE-011是一种可溶性ActRⅡA诱导受体，皮下注射入人体后，连续使用3个月，可发现促骨形成-抗骨吸收二重复合体形成，从而发挥双重作用。在药物ACE-011的Ⅰ阶段临床试验中，患者可较好地耐受，且骨形成生化指标水平增高[40]。ACE-011可升高血细胞比容，如果安全性在可接受范围内，可成为一种新型的促骨形成抗骨质疏松药物。"