2.1 内皮祖细胞的生物学特征 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，干细胞是祖细胞的祖先。与干细胞相比，祖细胞是已经程序化的、被确定向特定细胞系分化的细胞。胚胎时期，内皮祖细胞来源于中胚层的卵黄囊的血岛，由血管母细胞分化而来；脐血中的内皮祖细胞起源于胎儿的肝脏；成人外周血内皮祖细胞主要来源于骨髓。Asahara等[2]首次报道在成人外周血中分离出一种CD34+抗原阳性(CD34+)的单核细胞，体外培养时呈梭形，并具有形成管腔样结构的能力，能够表达内皮细胞的特异性抗原，如Flk-1/KDR、Tie-2等，荧光标记的乙酰低密度脂蛋白(Ac-LDL)和荆豆凝集素(UEA-1)染色呈阳性，在动物实验中可参与新生血管的形成。因此，他们认为这种CD34+细胞即为内皮祖细胞。此后，越来越多的证据表明成年人外周血中存在内皮祖细胞。内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，亦称为成血管细胞，具有自我分化和增殖能力，能定向归巢，在特定条件下分化为成熟的内皮细胞[3]。研究表明，存在两种类型的内皮祖细胞，即早期和晚期内皮祖细胞。早期内皮祖细胞主要分泌血管生成因子促进血管新生，晚期内皮祖细胞具有较高的增殖分化潜能，可以分化为成熟的内皮细胞参与血管新生[4]。 内皮祖细胞的鉴定是其生物学研究的开端。由于内皮祖细胞可根据其在个体发育过程中出现的先后顺序分为胚胎内皮祖细胞和成体内皮祖细胞，所以从理论上讲，对内皮祖细胞的鉴定也从这两方面入手。但是，胚胎细胞的取材受到了法律和伦理学的限制，同时它的实际操作性不高。因此，在成熟生物体内寻找和研究内皮样内皮祖细胞成为研究的重点之一。然而，如果要真正从人外周血中分离并鉴定血管母细胞样的外周血内皮祖细胞，目前仍存在困难。原因在于，外周血内皮祖细胞与成熟内皮细胞和造血干细胞之间缺乏特异的表面标记物和功能性检测方法。外周血内皮祖细胞与成熟的内皮细胞表达相似的标记物，如VEGFR-2(KDR、Flk-1)、Tie-1、VE-cadherin和CD34；内皮祖细胞和造血干细胞也分享很多相同的表面抗原标记物，如Flk-1、Tie- 2、c-Kit、Sca -1、AC133和CD34等[5]，它们可能在胚胎发育时期来源于相同的前祖细胞。现在通常采用CD133、CD34和VEGFR-2等几种表面抗原联合的方式对内皮祖细胞进行鉴定[3]。   人内皮祖细胞主要存在于骨髓中，外周血中含量很少，仅占外周细胞0.01%[6]；且随年龄的增长，数量逐渐降低，女性尤甚[7]。除了骨髓和外周血，从胎肝和脐血中也分离出了内皮祖细胞，它主要参与血管的动态维持和生理性重建。在生理或病理因素的刺激下, 内皮祖细胞可从骨髓向靶部位动员、分化、增殖，参与损伤血管的修复[8]。   2.2 内皮祖细胞的临床应用 内皮为衬托于心、血管和淋巴管腔面的单层扁平上皮，在心则称为心内皮(cardiac endothelium)，在血管则称为血管内皮(vascular endothelium)。血管内皮作为循环血液与血管平滑肌细胞间的机械屏障，具有接受、传递信息及分泌血管活性物质等功能，内皮细胞的损伤及功能障碍是许多疾病的始动环节并贯穿疾病发生的全过程。在各种致病因素的作用下，血管内皮层的完整性受到破坏，管壁物质沉积、炎性细胞浸润、管壁硬化和脆化、管腔狭窄是其基本的病理改变。内皮祖细胞可增殖、分化为血管内皮细胞，修复受损血管；且内皮祖细胞取材方便，骨髓穿刺就能得到该细胞；而且自体内皮祖细胞移植避免了免疫排斥及伦理学争议，使得内皮祖细胞在血管再生和心血管疾病的细胞治疗和基因治疗中具有广阔的应用前景。 基于内皮祖细胞治疗的安全性以及在动物实验中取得的阶段性成果，近几年，内皮祖细胞的临床应用研究已经有了相当多的文献报道，主要集中在急性心肌梗死、难治性心绞痛、肢体缺血、慢性肝病等疾病的临床试验[9]。其中Losordo等[10]以内皮祖细胞治疗顽固性心绞痛的研究、以及Kawamoto等[11]以内皮祖细胞治疗肢体缺血的研究已完成临床Ⅰ/Ⅱa期研究，现在已经在进行临床Ⅱb期研究。此外，以内皮祖细胞作为种子细胞的组织工程产品也已开始临床应用，比如：Cebotari等[12]取尸体心脏瓣膜在体外进行去细胞化处理，然后在生物反应器中包被自体的内皮祖细胞再移植回先天性心脏瓣膜功能不全的患儿体内，取得了良好的治疗效果。近年来，内皮祖细胞的生物学特性及治疗作用为缺血性疾病的研究治疗提供了新思路，使内皮祖细胞逐渐成为这一领域新的研究热点。   2.3 内皮祖细胞治疗缺血缺氧性脑损伤的机制 2.3.1 内皮祖细胞与动脉粥样硬化 脑血栓形成是脑缺血最常见的类型，是脑动脉主干或皮质支动脉粥样硬化导致血管增厚、管腔狭窄闭塞和血栓形成，引起脑局部血流减少或供血中断，脑组织缺血缺氧导致软化坏死，出现局灶性神经系统症状体征。在动脉硬化病理过程中，单核细胞、巨噬细胞和T细胞介导的内皮损害，被认为是动脉粥样硬化炎症反应机制的启动因素之一。内皮损害后，血管内膜通透性增加，大量的炎性因子、单核细胞以及平滑肌细胞在内皮下吞噬脂质形成泡沫细胞，进而形成粥样斑块。正常情况下，内皮损伤和骨髓来源的内皮祖细胞处于动态平衡状态，以维持血管内膜的完整性。当内皮细胞严重受损，内皮祖细胞在修复受损的内皮时被消耗，数量明显下降，造成损害-修复之间的失衡，无法阻止动脉粥样硬化的进展。   Rauscher等[13]研究发现内皮祖细胞的减少促进动脉粥样硬化的进展，而通过颈内静脉给予骨髓来源的内皮祖细胞可延缓小鼠动脉粥样硬化进程，并减少动脉粥样斑块的面积。周伟君等[14]的研究证实急性脑卒中患者外周血中内皮祖细胞的数量显著减少，且与血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白呈负相关。而龚海荣等[15]则发现高密度脂蛋白对内皮祖细胞的动员、增殖、分化、迁移和凋亡有正性调节作用，换言之，内皮祖细胞与高密度脂蛋白呈正相关。Xiao等[7]基于人群的研究发现，内皮祖细胞的数量与颈动脉粥样硬化也呈显著负相关。Hamed等[16]认为血管内皮层的完整性及功能活性在预防动脉粥样硬化中起着关键作用；内皮祖细胞之所以使缺血组织血管新生及受损血管再内皮化，很可能限制了动脉粥样硬化的形成；且冠状动脉疾病的危险因素如年龄、吸烟、高血压、高血脂和糖尿病使外周血中内皮祖细胞的数量减少、功能降低，导致动脉粥样硬化形成及进展。因此，修复受损的内皮细胞可预防动脉粥样硬化，进而降低脑血管疾病的发生率。   首先，积极控制动脉粥样硬化的危险因素。因为这些危险因素不仅引起血管内皮损伤，还加速炎性反应，降低循环内皮祖细胞的数量，损害内皮祖细胞的功能，进一步加速内皮损伤，造成动脉粥样硬化进一步发展。其次，骨髓穿刺，体外分离、提取、培养、扩增自体内皮祖细胞至一定数量，然后移植回体内，增加外周血中循环内皮祖细胞，进而预防或治疗动脉粥样硬化。   2.3.2 内皮祖细胞修复受损血管 脑血管损伤常导致脑血流异常，造成脑缺血缺氧。如果脑组织的血液供应中断，2 min内脑电活动停止，5 min后出现严重的不可逆性损害[1]，因此修复受损血管对于挽救缺血缺氧性脑损伤至关重要。内皮祖细胞通过多方面作用修复受损的血管内皮。一方面，内皮祖细胞可定向归巢于内皮受损部位，增殖、分化为成熟的内皮细胞直接修复受损血管。Griese等[17]通过自体移植骨髓来源的内皮祖细胞到兔颈动脉球损伤模型，发现受损血管快速内皮化，且新生血管内膜沉积物显著减少，说明移植的内皮祖细胞在重建血管内皮的完整性方面起重要作用。另一方面，内皮祖细胞表达或分泌营养物质，保护血管或促进血管修复。如内皮祖细胞可表达内皮一氧化氮合酶，抑制内膜增生，增加新生血管内皮的保护性能[18]。内皮祖细胞通过旁分泌作用激活环氧酶2，进而刺激脑血管产生PGI2，增加细胞内cAMP，从而保护血管[19]。   最重要的是内皮祖细胞参与血管新生。血管形成是一个极其复杂的过程，需要很多细胞因子的协同参与。血管发生(vasculogenesis)和血管生成(angiogenesis)是促进新血管生长的两个重要的生理过程。血管发生主要存在于胚胎时期，指内皮祖细胞在原位形成血管。该过程由中胚层血岛中的细胞分化，最终形成毛细血管网，再由毛细血管网形成动静脉网[20]。血管生成是指毛细血管从膨大的小静脉侧长出来的过程。首先小静脉管壁出现小芽，然后被周围的内皮细胞分开，或被横跨的内皮细胞桥分隔，最后形成毛细血管[21]。内皮祖细胞促进新生血管形成的机制是它通过自身的分化、增殖、迁移而形成新生血管，无需依赖原有的血管系统，类似于胚胎时期的血管发生过程，故称之为出生后血管发生(postnatal vasculogenesis)，它与血管生成有着本质的区别。现在，大量的证据表明，出生后不仅存在血管生成过程，也存在着依赖于内皮祖细胞的出生后血管发生过程。   Kocher等[22]在大鼠心肌梗死模型中观察到，内皮祖细胞介导的血管发生绝大部分见于梗死部位中央的胶原沉淀区（无血管或血管减少区），而内皮细胞参与的血管生成则多见于梗死周围区（有血管支持区），证实了这两种血管新生方式在机体上存在差异。Hu等[23]发现大鼠心肌梗死区域新生血管网内存在着移植的内皮祖细胞，且新生血管可以促进缺血区域周围的血液供应并降低心肌纤维化。有报道发现，在新生血管中有约25%的内皮细胞由内皮祖细胞增殖分化而来[24]。   由于年老、糖尿病、高脂血症、严重动脉粥样硬化等情况往往存在内皮细胞功能受损，因此，细胞生长因子介导的血管生成在临床应用方面受到很大限制，而内皮祖细胞介导的血管发生则不受原有血管和内皮细胞功能的影响，这是它的优越之处。同时，内皮祖细胞本身可以分泌血管内皮生长因子等细胞生长因子，并通过自分泌和旁分泌作用促进血管生成过程，有利于新生血管形成。内皮祖细胞介导的血管发生在不同的病理状态下有不同的表现：在肿瘤组织中表现为持续的细胞分化和新生血管形成；在缺血组织中表现为血管趋向成熟、毛细血管和动脉密度增高；在损伤修复组织中则表现为血管的退化及瘢痕组织的产生[25]。这一现象为内皮祖细胞在缺血性疾病的防治研究中提供了充分的理论依据。   2.3.3 内皮祖细胞促进神经功能恢复 脑缺血后内皮细胞为神经发生提供了富含血管的微环境。成年哺乳动物的神经发生主要集中在侧脑室下区(SVZ)和海马齿状回区(SGZ)[26]。脑缺血促进神经干细胞的数量增加且提高神经干细胞的迁移速度。侧脑室下区的神经干细胞以链状形式迁移至纹状体缺血区周围并聚集成簇，但新生的神经元80%以上凋亡，似乎新生神经细胞定居的内环境是其能否存活的关键因素[27]。研究发现脑卒中后成神经细胞沿着新生血管的方向进行迁移，且多定居于新生的血管周围[28]，说明血管系统在神经发生中起重要作用。Minger等[29]用标记有神经干细胞/祖细胞的抗体对死亡前1周的患者进行检测，发现大量的神经干细胞连同血管内皮生长因子阳性细胞及新生血管共同聚集于梗死灶周围，进一步说明脑缺血后神经发生和新生血管形成存在着密切的关联，但两者之间的分子机制仍需进一步探讨。   富奇志等[30]将内皮祖细胞与神经干细胞构建的复合移植体移植入缺血再灌注模型大鼠缺血半暗带，结果发现内皮祖细胞可以促进缺血半暗带神经干细胞的增殖、减少凋亡，且促进缺血半暗带的血管新生。其原因可能是内皮祖细胞能够分泌多种细胞因子，如血管内皮生长因子、粒细胞克隆刺激因子、巨粒细胞克隆刺激因子等[31]，某些因子如血管内皮生长因子可促进神经干细胞的增殖并抑制其凋亡[32]。而神经干细胞分泌的因子如脑源性生长因子、胶质源性生长因子和神经生长因子等，也可以促进新生血管的形成。也就是说血管新生和神经发生具有协同作用。   2.4 内皮祖细胞移植治疗脑梗死的临床前研究 内皮祖细胞作为脑梗死治疗手段的报道多见于动物模型。目前全世界已有大量的动物实验针对内皮祖细胞治疗脑缺血进行了细致、深入的研究，证实内皮祖细胞移植治疗脑缺血是安全的、有效的。Taguchi等[33]以及Willing等[34]在动物模型证实，内皮祖细胞具有促进脑缺血区新生血管形成、增强神经发生并改善其功能的作用。其原因可能为内皮祖细胞修复了因内皮细胞功能障碍破坏的血脑屏障，减少了由于血脑屏障通透选择性破坏引起的并发症；并且，内皮祖细胞可促进形成一个有利于神经发生的富含血管的微环境。   2008年Chen等[35]以兔永久性大脑中动脉栓塞模型作为研究对象，比较自体骨髓基质细胞和内皮祖细胞静脉移植的治疗效果，发现内皮祖细胞的作用机制与骨髓基质细胞不尽相同，其主要通过参与并促进缺血半影区微血管再生，进而达到促进神经功能恢复的效果。他们进一步以内皮祖细胞和骨髓基质细胞单独或联合移植治疗大鼠大脑中动脉栓塞模型，发现治疗组大鼠神经功能的改善可能与移植的干细胞促进营养因子的表达有关，移植组缺血半球碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子的表达明显增高[36]。   Kerr等[37]通过药物抑制大鼠的神经发生或血管生成，以水迷宫游戏考察小鼠对视空间的记忆功能，以此来探讨神经发生或血管生成对学习和记忆的影响。结果发现，接受了血管抑制剂的小鼠在水迷宫中反应迟钝，说明血管生成是动物学习的一个重要因素。这些结果指出血管可塑性对学习和记忆功能非常重要，增加血管的可塑性可改善认知功能和抵御自然认知功能的下降。脑缺血患者大部分存在认知功能障碍及空间忽略，且血管损伤严重，按照这一理论，自体内皮祖细胞移植可以从根本上改善血管的可塑性，理论上可改善患者的学习及记忆功能。   2.5 自体内皮祖细胞移植治疗缺血缺氧性脑损伤 2.5.1 自体移植 在同种异体组织、器官移植时，受者的免疫系统常对移植物产生排斥反应。免疫排斥反应是异体细胞移植治疗中的最大难题。应用免疫抑制剂可在一定程度上降低排斥反应，但效果仍不理想，往往产生很多并发症或不良反应。经基因改造后的胚胎干细胞可保持稳定的基因型，可通过基因改造降低或清除由免疫介质介导的排斥反应，使患者不需长期或终生服用免疫抑制剂[38]。但是，胚胎干细胞的在获取、实验研究和临床应用过程中，不仅亟需解决很多技术难题，而且存在若干伦理学争议，使其在短时间内无法应用于临床研究。内皮祖细胞可取自患者本身，在体外进行分离、培养、扩增至一定数量后进行自体移植，不仅避免了免疫排斥反应及伦理学争议，而且取材方便，骨髓穿刺就能得到该细胞。此外，内皮祖细胞在体外培养增殖速度快，短期内可大量扩增。因此，自体内皮祖细胞移在缺血缺氧性脑损伤中具有广阔的应用前景。   2.5.2 移植时机 目前，脑梗死后进行干细胞移植的最佳时机尚未明确。动物实验因设计和观察上的需要大多采用急性期移植，即30 min到1个月之间，大多选择在1周内进行。但是，动物实验上取得的结果不能简单的类比于人类，人类的脑缺血千变万化，缺血后的神经功能与缺血部位、范围、严重程度相关；即便是同一类型的脑损伤，每位患者的临床表现、恢复程度也不同。另外，脑缺血后神经功能的恢复可能要经历几个月甚至数年。因此，细胞移植必须有利于患者康复，至少无损于人脑的代偿机制[39]。   由于脑缺血区域在卒中后不同时期有各自复杂的病理生理变化，如在梗死后数分钟至数小时的超急性期，由于缺血缺氧、能量耗竭引发的应激反应、兴奋性神经递质和自由基的增加，对神经细胞造成的损伤可持续数天；急性期的炎性反应及细胞凋亡可持续到数周[40]。因此，有学者认为，在急性期进行干细胞移植不利于细胞存活、增殖及分化。但也有学者认为，在急性期进行干细胞移植，可增加细胞因子及神经营养因子的释放，从而对梗死区域的神经细胞起到保护作用[41]。   2.5.3 移植途径 目前，临床上干细胞移植的途径主要有以下几种：①侧脑室注射：经立体定向仪定位后进行侧脑室穿刺，将干细胞直接注射到侧脑室，使之随脑脊液到达病变部位。②脑内局部注射：颅骨切开或经立体定向仪将干细胞直接注射至病变部位。③蛛网膜下腔注射：腰椎穿刺，将干细胞注射至蛛网膜下腔，使其随脑脊液循环至病变部位。④动脉移植：将干细胞通过颈动脉移植，使其随血液循环至病变部位。⑤静脉移植：将干细胞由外周静脉输入，使其通过血-脑屏障到达病变部位。   经立体定向注射时，单次注射细胞量不能过多，故需多点注射，对患者造成的创伤较大，且存在颅内感染、硬膜下血肿、癫痫等并发症。蛛网膜下腔注射避开了血-脑屏障的阻碍，但存在蛛网膜粘连及感染的风险。动脉和静脉移植因操作简单、创伤小、可注射足量的干细胞、并发症少等优点而成为首选。与静脉途径相比，从理论上经动脉移植到达病变部位的干细胞数量应该更多，因静脉移植的干细胞可能有相当部分滞留于其他部位；但动脉移植相对易造成出血及颅内感染的风险。另外，静脉移植较易被大部分患者接受。   Taguchi等[42]将人脐静脉血中分离的内皮祖细胞经静脉注射入卒中后48 h的鼠，发现其在缺血区能诱导血管新生，并提供神经生成的适宜环境。何旭英等[43]通过大鼠尾静脉注射内皮祖细胞后，发现脑损伤后大鼠神经功能恢复较快，且免疫荧光染色显示缺血脑组织的微血管密度明显高于对照组。以上说明经静脉移植的内皮祖细胞能到达缺血部位，进而参与血管再生。至于经静脉移植有多少干细胞最终能够到达病灶部位，尚不清楚。   2.5.4 细胞移植量 内皮祖细胞有强大的增殖能力，理论上可以获取足够多的细胞用于移植治疗。然而，内皮祖细胞在体外传代次数过多会影响其生物学活性，而移植细胞量的增多也会加大对患者安全性的顾虑。另一方面，移植的细胞量过少又难以起到治疗作用。因此，确定合适的细胞移植数量是必要的。另外，脑缺血的部位、范围、严重程度、患者机体情况以及移植部位的不同决定了所需要的细胞数量也不尽相同。因此，目前很难将细胞移植量标准化。一般来说，细胞移植最常使用的移植量为107-109[38]。Chen等[35-36]先后以3×107和3×106的内皮祖细胞移植入大脑中动脉闭塞的兔和鼠模型，均未发现不良反应，且利于血管和神经修复。"