2.1  血管内皮生长因子结构及其在牙髓再生中的作用  血管内皮生长因子是由相对分子质量为17 000-22 000的同源二聚体通过二硫键连接而成的糖蛋白，其相对分子质量为34 000-45 000，与血小板源性生长因子有一定的同源性。人类血管内皮生长因子的基因为单一基因，长约14 kb，定位于染色体的6p21.3上，由7个内含子和8个外显子交替构成。血管内皮生长因子家族主要包括血管内皮生长因子A、B、C、D及胎盘生长因子等。血管内皮生长因子A根据其氨基酸末端长度分为血管内皮生长因子206、189、165、145及121，共5种异构体。 牙髓再生是借助生物学手段，采用组织工程原理实现受损牙髓以及根尖周组织的再生与修复，使牙髓继续发挥营养、感觉、防御等功能[2]，尤其在牙髓血管生成以及神经保护与再生方面，血管内皮生长因子发挥至关重要的作用。在血管生成过程中，血管内皮生长因子促进细胞增殖、迁移及干细胞的内皮细胞向分化，减少内皮细胞凋亡，促进细胞外基质降解，增加血管通透性[3-6]。目前已有利用载血管内皮生长因子微球和牙髓干细胞在体内实现牙髓再生及血管形成的报道[7]。血管内皮生长因子还可直接刺激神经前体细胞增殖或通过刺激内皮细胞释放神经营养因子促进神经再生，并通过促进神经节轴突再生以及干细胞向许旺细胞分化，进而促进许旺细胞生长、存活而保护神经[8-12]。此外，血管内皮生长因子还可促进牙髓干细胞的成牙本质细胞向分化[13]。因此，血管内皮生长因子未来有望为牙髓血管生成、牙本质形成、神经再生等问题提供新的治疗途径。 2.2  牙髓干细胞的分泌活性  牙髓干细胞具有很强的细胞因子分泌活性，可分泌表皮生长因子、脑源性神经营养因子、神经生长因子以及多种与血管生成有关的生长因子。目前已发现由牙髓干细胞分泌并促进血管生成的因子包括血管内皮生长因子、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子、白细胞介素8、单核细胞趋化蛋白1、基质金属蛋白酶9、胰岛素生长因子1及转化生长因子β等；抑制血管生成的因子包括内皮抑制素、胰岛素生长因子结合蛋白3等。此外，在牙髓干细胞的条件培养基中还发现了纤溶酶原激活物抑制物1、金属蛋白酶组织抑制因子1、尿激酶型纤溶酶原激活物等因子，这些因子参与细胞外基质的改建，可能与内皮细胞迁移有关。BRONCKAERS等[14]利用抗体芯片分别测定牙髓干细胞溶解物及牙髓干细胞条件培养基中55种与血管生成有关的蛋白，并用反转录-聚合酶链反应和酶联免疫吸附实验分别测定血管内皮生长因子的表达及牙髓干细胞条件培养基中血管内皮生长因子的含量。结果表明血管内皮生长因子蛋白在6个不同供体的细胞裂解物及条件培养基中均有存在；血管内皮生长因子基因在6个供体中均有表达。因此，牙髓干细胞有望成为外源性血管内皮生长因子的替代来源[1]。 2.3  影响牙髓干细胞表达分泌血管内皮生长因子的因素 2.3.1  缺氧  缺氧被认为是刺激牙髓内血管内皮生长因子表达一个重要因素。牙齿创伤及正畸治疗中的正畸力均可导致牙齿移动，牙髓内血管压缩，形成缺氧环境。缺氧诱导因子1α是一种特异性DNA结合蛋白，与缺氧上调血管内皮生长因子基因表达密切相关。WEI等[15]对牙齿施加适当的机械负荷，牙髓内缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子表达呈现先增强后减弱的趋势，这可能是因为早期缺氧环境上调牙髓内缺氧诱导因子1α表达，而血管内皮生长因子的表达由于血管暂时闭塞而下降。随着时间推移，血管闭塞造成牙髓内局部缺氧，血管内皮生长因子含量逐渐升高，诱导血管不断生成，缺氧得到改善，最终使牙髓内组织达到稳态。另一项研究发现在缺氧环境中，牙髓内血管内皮生长因子的表达水平上升，而将处于缺氧条件下的牙髓细胞重新置于有氧环境后，其血管内皮生长因子表达降至原有水平，这表明缺氧促进牙髓内血管内皮生长因子表达的过程是可逆的，牙髓内血管内皮生长因子可通过改变缺氧/复氧环境进行调控[16]。上述研究尚未探讨缺氧对牙髓干细胞内血管内皮生长因子基因的调控作用及机制。ARANHA等[17]使用缺氧诱导因子1α抑制剂YC-1并不能使血管内皮生长因子表达量下降至原有水平，这可能是由于其他转录因子通过其他途径参与缺氧诱导的血管内皮生长因子表达，具体作用机制还需进一步研究。 缺氧可促进牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子，不同研究中培养牙髓干细胞所使用的氧体积分数均不同。ARANHA等[17]和GORIN等[18]实验中使用体积分数为1%O2培养牙髓干细胞。AHMED等[19]研究表明，体积分数为5% O2条件下牙髓干细胞中血管内皮生长因子表达量显著高于体积分数为20%和3%O2条件下血管内皮生长因子表达量。鉴于实验的培养条件各异，目前仍未确定使牙髓干细胞达到最佳分泌活性的氧体积分数。 最近一些研究发现使用脯氨酰羟化酶抑制剂等缺氧模拟剂可通过缺氧诱导因子1α/血管内皮生长因子途径上调牙髓细胞内血管内皮生长因子的表达，然而这种方法对牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子的影响及其临床应用仍需进一步研究[20-22]。 2.3.2  细菌毒力因子与炎症因子  细菌毒力因子主要包括脂多糖及脂磷壁酸。脂多糖是革兰阴性菌细胞壁上的特殊成分，有研究发现脂多糖可促进人牙髓干细胞的成牙本质向分化[23]，因此脂多糖可能在治疗感染牙髓及促进组织再生方面具有潜在的治疗作用。Toll样受体4是细胞识别脂多糖的重要分子，也是脂多糖信号转导途径中的关键分子，多分布在T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞及胎肝脏、肺脏、脾脏等组织中。BOTERO等[24]使用脂多糖分别处理鼠成牙本质样细胞(MDPC-23)、未分化的牙髓细胞(OD-21)、鼠巨噬细胞及牙龈纤维细胞，并评估它们表达血管内皮生长因子的情况。结果显示在MDPC-23细胞和鼠巨噬细胞中血管内皮生长因子蛋白表达上调，而在未分化的牙髓细胞及牙龈纤维细胞中的表达不明显；所有细胞处理组均未发现血管内皮生长因子在mRNA水平的改变，提示脂多糖通过转录后加工途径调节血管内皮生长因子的表达，Toll样受体4可能在这一过程中具有重要作用[25]。人牙髓成纤维细胞与牙髓干细胞均可表达Toll样受体4，有研究表明牙髓卟啉单胞菌的脂多糖通过Toll样受体4及丝裂原活化蛋白激酶信号通路诱导人牙髓成纤维细胞及牙髓干细胞表达血管内皮生长因子[26]，这种效应具有时间及剂量依赖性。施俊等[27]研究发现低质量浓度脂多糖(1，10 μg/L)对牙髓干细胞增殖具有促进作用，且上调人牙髓干细胞矿化相关蛋白(碱性磷酸酶、骨钙素、骨唾液酸蛋白、牙本质涎磷蛋白)表达水平，促进牙髓干细胞的成牙本质向分化，而高质量浓度脂多糖(1 000 μg/L)抑制牙髓干细胞的增殖，因此利用低质量浓度脂多糖实现牙髓内血管生成及牙本质再生可能成为牙髓再生的新途径。在继发感染和再感染根管中常分离出革兰阳性菌，这些细菌可以产生大量脂磷壁酸并释放到细胞外基质中。TELLES等[28]研究发现脂磷壁酸诱导鼠牙髓中的巨噬细胞产生血管内皮生长因子蛋白的量与基础水平相比增加9倍，在鼠成牙本质样细胞中增加2.4倍，在未分化的牙髓细胞中增加了1.6倍，而对成纤维细胞无诱导效果。目前有关脂磷壁酸对人牙髓干细胞影响的研究较少，脂磷壁酸对牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子的影响还需进一步探究。 在急性牙髓炎早期，龋源性细菌细胞成分及其产物经由牙本质及根管侵入血管并使其扩张，炎细胞浸润、聚集，并分泌白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子α、干扰素γ等炎症因子，增加血管内皮生长因子的表达范围及强度，促进微血管形成，而血管生成带来炎细胞及免疫活性物质，引导牙髓对损伤产生防御反应；当牙髓炎发展至晚期，由于炎症高浸润区牙髓组织的修复能力下降，大量炎症因子促使血管通透性增加，血管内压升高，同时局部出现坏死灶，进一步导致微循环障碍，微血管密度减少，组织修复能力进一步下降，形成恶性循环，最终将导致不可逆性牙髓炎及牙髓坏死。然而如果炎症反应水平很低，则可能促进修复机制。因此，炎症反应在牙髓再生中是一把“双刃  剑”[29-32]。LEE等[33]使用CO2激光照射牙髓组织，结果发现牙髓组织局部温度上升，在6，12，24 h时肿瘤坏死因子α和白细胞介素1α水平显著上升。在激光照射后牙髓组织即刻出现轻微的退行性变，在第5天后牙髓成牙本质细胞下层可见血管内皮生长因子的表达，提示CO2激光照射引发的炎症反应可能有利于修复损伤的牙髓组织。BOYLE等[34]在含有体积分数为3%血清的条件培养基中添加肿瘤坏死因子α培养牙髓干细胞，分别记录0，4，6，12 h时血管内皮生长因子的表达量，结果发现利用肿瘤坏死因子α处理可使牙髓干细胞内血管内皮生长因子表达水平上升。Boyle还发现肿瘤坏死因子α可在短时间(6 h及12 h)内通过激活核转录因子κB(NF-κB)通路诱导牙髓干细胞的凋亡，在长时间(14 d)处理后牙髓干细胞的矿化潜力被削弱，而牙髓干细胞增殖能力提升。尽管肿瘤坏死因子α能促进牙髓再生中血管生成，对牙髓干细胞增殖也有积极影响，但其不利于牙本质再生，因此肿瘤坏死因子α对牙髓再生的最终效果还有待观察。干扰素是1957年发现的第一个细胞因子，具有抗病毒、抗细胞增殖及免疫调节等功能。STROJNY等[35]在成牙本质分化培养基中加入500 U/mL干扰素γ培养牙髓干细胞，测定在0，12，24，48，72 h时血管内皮生长因子的RNA含量。结果表明血管内皮生长因子的表达呈时间依赖性，在24 h时血管内皮生长因子的表达有显著提升。因此，在控制炎症因子剂量的前提下，应用炎症因子可有效提高牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子的能力。 2.3.3  生长因子  在组织工程中，生长因子与材料支架结合可促进干细胞增殖与分化，多种生长因子可共同作用于干细胞并调节其分泌活性。JIN等[36]使用5%的浓缩生长因子及血管内皮生长因子共同诱导牙髓干细胞来源内皮细胞形成血管样结构。与单独使用血管内皮生长因子对照组相比，实验组可见更高比例的血管形成，证实浓缩生长因子能促进牙髓干细胞介导的血管生成过程。然而不同生长因子成分对牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子的影响仍需进一步分析。成纤维细胞生长因子2是促进细胞分泌血管内皮生长因子的诱导剂，GORIN 等[18]研究表明一定质量浓度(10 μg/L)的成纤维细胞生长因子能促进脱落乳牙牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子，其效应比缺氧环境(1%O2)下诱导产生血管内皮生长因子更强，且成纤维细胞生长因子2和缺氧促进脱落乳牙牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子具有协同效应。骨形态发生蛋白2属于转化生长因子超家族的一员，是诱导牙髓干细胞成牙本质分化的一个重要细胞因子，也可激活VEGFA/VEGFR2信号通路促进内皮细胞增殖和迁移。AKSEL等[37]将载骨形态发生蛋白2的脱矿牙本质与纤维蛋白凝胶共培养牙髓干细胞，结果显示与不含骨形态发生蛋白2的对照组相比，实验组牙髓干细胞表面血管生成因子CD31表达量上升，而骨形态发生蛋白2对牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子的影响仍需更深一步的研究。  2.3.4  材料  支架是组织工程中必不可少的一部分，支架材料不可直接改变牙髓干细胞的生物学特性，而是通过3个方面维持血管内皮生长因子的分泌：①与牙髓干细胞形成有机结合，为牙髓干细胞提供有利于黏附及增殖的环境；②多孔隙、具有凹坑及粗糙表面的材料可影响牙髓干细胞间相互作用，间接促进牙髓干细胞内血管内皮生长因子表达和分泌，对牙髓干细胞的成骨细胞向分化及骨形成具有积极影响，见图2[38-40]；③通过明胶及肝素与血管内皮生长因子结合，携载、保护并缓释血管内皮生长因子。LI等[41]将牙髓干细胞植入载血管内皮生长因子的L-聚乳酸-肝素-明胶纳米纤维微球中培养并填入根管，结果显示再生牙髓样组织几乎充满全根管并伴血管形成，这为应用组织工程技术探索牙髓治疗新方法奠定了基础。 某些金属可能促进牙髓干细胞内血管内皮生长因子的表达。HUANG等[42]研究显示二价金属如镁、锶、锌等能促进脱落乳牙牙髓干细胞内血管内皮生长因子的表达，促使脱落乳牙牙髓干细胞的成骨细胞向分化。生物活性玻璃是一种具有硅酸盐性质的生物活性材料，可形成磷灰石层，并能释放锌、镁等金属离子，具有良好的生物相容性和生物学活性，可作为盖髓剂或颌骨缺损的移植材料。HUANG等[43]检测含锌生物活性玻璃培养基中牙髓干细胞内血管内皮生长因子的表达情况，结果显示牙髓干细胞内血管内皮生长因子mRNA表达上调，体外观察到内皮细胞管状结构形成。YUSA等[44]使用含有洗脱锌离子的成骨培养液对牙髓干细胞进行培养，结果显示牙髓干细胞内血管内皮生长因子mRNA表达与对照组相比显著上调。目前有关金属对牙髓干细胞内血管内皮生长因子表达的研究多集中在游离锌离子方面，对其作用机制以及其他金属研究尚未完全了解，因此金属对牙髓干细胞内血管内皮生长因子的表达与分泌仍需进一步探索。矿物三氧化物聚合物(mineral trioxide aggregate，MTA)由多种亲水氧化矿物混合而成，具有良好的密闭性、X射线阻射性、诱导成骨性、生物相容性及一定的抑菌性能，临床上应用广泛。PARANJPE等[45]用矿物三氧化物聚合物处理人牙髓干细胞，其血管内皮生长因子分泌量约为对照组的1.7倍。磷酸钙水门汀是常见的一种生物活性骨水泥，拥有良好的生物相容性。LEE等[46]发现含有生物活性纳米复合材料的磷酸钙水门汀能上调牙髓干细胞内血管内皮生长因子基因的表达。辛伐他汀是一种常见的降脂药物，近年来人们发现辛伐他汀可抑制促炎症因子并上调成牙本质标志物的表达，促进血管化及牙本质组织再生。SOARES等[47]发现辛伐他汀可上调牙髓干细胞内血管内皮生长因子表达，促进血管样结构形成，而XUE等[48]研究表明辛伐他汀可通过失活丝裂原活化蛋白激酶途径抑制牙髓干细胞内血管内皮生长因子表达及其蛋白的形成，因此辛伐他汀对牙髓干细胞内血管内皮生长因子表达的影响有待进一步观察。 2.3.5  其他  牙髓干细胞与内皮细胞共培养可影响牙髓干细胞血管内皮生长因子分泌活性。DISSANAYAKA  等[1]将牙髓干细胞和人脐静脉内皮细胞以3种不同比例置于可注射多肽水凝胶中进行共培养，结果显示牙髓干细胞单独培养组中血管内皮生长因子蛋白表达含量相比其余3个共培养组及人脐静脉内皮细胞单独培养组含量更高；在3个共培养组中，血管内皮生长因子蛋白量随着人脐静脉内皮细胞比例升高而递减，在最初48 h内含量最低。这是由于牙髓干细胞分泌的血管内皮生长因子立即被人脐静脉内皮细胞利用，激活血管生成相关通路，随着人脐静脉内皮细胞迁移及血管状结构的形成，可注射多肽水凝胶内血管内皮生长因子含量显著增加。因此，牙髓干细胞与内皮细胞的比例关系可能是影响牙髓再生中血管生成效果的一个重要因素，这对于控制血管内皮生长因子的分泌量、控制牙髓内血管样组织生成、防止形成肉芽组织至关重要。 慢病毒载体可将外源短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)或外源基因有效地整合至宿主染色体，提高目的基因或目的shRNA的转导效率，从而方便快捷地实现目的基因或目的shRNA长期、稳定的表达。邓立方等[49]对缺氧诱导因子1α进行基因突变，构建突变型、野生型以及对照组的慢病毒载体，并用这3种慢病毒载体转染牙髓干细胞，结果显示目的基因缺氧诱导因子1α成功表达，并能够显著上调牙髓干细胞内血管内皮生长因子等成血管因子表达。突变组和野生组的成血管作用明显强于对照组。有研究利用慢病毒载体转染血小板衍生生长因子BB于人牙髓干细胞中[50]，结果表明在RNA水平和蛋白质水平上血管内皮生长因子的含量均上升。基质细胞衍生因子1α在牙髓再生领域也有着重要的作用。基质细胞衍生因子1α转染的牙髓干细胞比血管内皮生长因子转染的牙髓干细胞更能促进内皮细胞迁移和血管形成[51]。JANEBODIN等[52]使用shRNA慢病毒颗粒对VEGFR2进行基因敲除，结果显示VEGFA、VEGF受体及EphrinB2表达下调，体内牙髓干细胞诱导的血管生成减少。尽管基因敲除能有效控制血管内皮生长因子的表达及其蛋白的合成，然而这种效应是持久性的，且实验方法比较复杂，安全性仍有待验证，因此临床应用并不广泛。 物理因素如磁场、力场或声场等也是影响细胞内基因表达及蛋白分泌一个重要因素。魏福兰等[53]通过细胞牵张应力加载系统对牙髓细胞施以频率为1.0 Hz、大小为15%形变率的牵张应力，结果显示牵引应力通过缺氧诱导因子1α上调细胞内血管内皮生长因子mRNA表达；加力12 h后，血管内皮生长因子 mRNA表达开始明显增强，持续增加至加力结束。WANG等[54]对脱落乳牙牙髓干细胞分别施以0.04 mN及0.16 mN的剪应力，结果表明脱落乳牙牙髓干细胞通过VEGF-DLL4/ Notch-EphrinB2通路上调血管内皮生长因子 mRNA表达并增加血管内皮生长因子蛋白分泌。ZHENG等[55]将牙髓干细胞分别置于1，2，4 mT静态磁场中，观察磁场强度对细胞增殖及组织修复的影响。结果显示1 mT能有效上调牙髓干细胞内血管内皮生长因子等生长因子的表达，促进牙髓干细胞增殖。另外有研究显示低频超声能上调成牙本质样细胞内血管内皮生长因子基因表达，促进其蛋白分泌，然而对牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子的影响有待进一步研究[56]。 "