2.1   外泌体与生物材料的生物学特性   2.1.1   外泌体的生物学特性   细胞外囊泡是一类由细胞内释放到细胞外基质的膜性小囊泡，它们在细胞间的信息传递和物质运输中起着重要作用，根据直径大小分为三大类，分别是凋亡小体、微粒和外泌体[12]。其中，外泌体的直径最小，为30-150 nm，通常呈球形或椭圆形。外泌体起源于内体系统，其生物发生过程是由细胞内吞小分子物质入胞启动的，早期内体成熟后，产生了包裹货物的腔内囊泡，内体进一步成熟为晚期内体，融合出现出现多囊泡，被称为多囊泡体，当多囊泡体与细胞质膜融合，腔内囊泡将释放到胞质外，成为外泌体。外泌体一经分泌，便具有多种生物活性，可以调节细胞间通讯与信号传递[13]。目前外泌体也被用作药物载体定向递送至目标组织或细胞，能极大提高疾病的治愈率。 2.1.2   生物材料的生物学特性   生物材料根据功能的特性主要分为两大类：具有多功能特性的水凝胶材料，能在药物递送系统和组织工程支架构建中展现出双重应用价值；用于组织结构支撑的生物支架。生物材料的构成材料为天然或合成产物，如胶原蛋白基质、海藻酸盐凝胶、硫酸化透明质酸复合物以及自组装超分子纳米材料等[14]，这些材料通过模拟细胞外基质结构和功能化修饰发挥生物相容性和组织整合特性，为组织提供高效有利支撑，为组织提供良好的修复环境。 2.1.3   外泌体与生物材料结合发挥治疗最大优势   随着研究的不断进行，已有大量学者发现，单纯的外泌体治疗或生物材料治疗均不能发挥治疗的最大优势，外泌体在治疗过程中存在生物利用率低、靶向作用不准确等问题，而采用水凝胶或生物支架负载药物治疗可能存在药物难以透过血脊髓屏障或仅仅发挥组织支撑作用。将外泌体与生物材料结合，既能实现定向递送关键损伤部位，又能最大程度地发挥外泌体的生物活性效果与生物材料的生物相容性，使组织与支架更好地相互作用，促进细胞黏附和增殖，为损伤组织提供最接近体内稳态的的修复环境[15]。外泌体的发展及其与生物材料联合应用历史脉络，见表1。 "

2.2   细胞来源的外泌体   脊髓损伤发生后，由于复杂的病理机制，单一的治疗手段并不能发挥较好的治疗效果，而外泌体治疗在脊髓损伤中表现出显著的治疗效果。外泌体的细胞来源包括间充质干细胞、神经干细胞、小胶质细胞、施万细胞等多种细胞，外泌体对于脊髓损伤后的神经炎症、轴突和血管再生障碍、血-脊髓屏障修复均有治疗作用[29]。外泌体的来源和作用机制见表2。外泌体的分类见图4。 2.2.1   间充质干细胞来源外泌体   间充质干细胞是具有多向分化潜能和自我更新能力的多能干细胞，具有再生成各种组织、器官和细胞的潜力，最常见的类型有骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、牙髓间充质干细胞等[42-43]。间充质干细胞来源外泌体可以抑制炎症并减轻细胞凋亡，促进轴突再生和血管生成，改善损伤部位微环境，减轻神经炎症和神经胶质增生，促进脊髓损伤后的运动改善和感觉恢复。主要发挥调节作用的是间充质干细胞来源外泌体中携带的miRNA，它们能有效调节炎症信号通路，XUE等[31]研究正好印证这一结论，他们发现骨髓间充质干细胞来源外泌体中所含的 miR-216a-5p，能够通过抑制Toll样受体4/核因子κB信号通路减轻脊髓损伤后产生的神经炎症。"

2.2.2   神经干细胞来源外泌体   神经干细胞来源外泌体是神经干细胞自身所分泌的小分子复合物，通过递送生物分子调节邻近神经元或胶质细胞的功能，对神经炎症也具有抑制作用[44]。神经干细胞来源外泌体可以抑制小胶质细胞向M1型转化，同时抑制星形胶质细胞向A1型活化，例如，ZHAO等[45]验证了神经干细胞来源外泌体可抑制M1极化、促进M2极化，减轻小胶质细胞介导的神经炎症；LI等[46]的研究结果也可印证上述结论，神经干细胞来源外泌体通过肥胖相关基因抑制核因子E2相关因子2 甲基化修饰，将小胶质细胞从M1促炎表型转化为M2抗炎表型，减轻了小胶质细胞炎症反应对神经元的损伤，从而产生神经保护作用。 2.2.3   小胶质细胞来源外泌体   在生理状态下，作为中枢神经系统的固有免疫细胞，小胶质细胞通过动态监测微环境维持稳态在损伤或感染时迅速激活，分化为促炎(M1型)或抗炎(M2型)表型，参与炎症反应和组织修复[47]。小胶质细胞来源外泌体可以通过抑制神经元凋亡来促进轴突再生，其中发挥重要作用的是小胶质细胞外泌体所包含的miRNA，是治疗脊髓损伤的关键分子。例如，miR-672-5p是与M2型小胶质细胞来源外泌体相关的最关键miRNA，通过抑制黑色素瘤缺乏因子2/凋亡相关斑点样蛋白/caspase-1信号通路抑制神经元焦亡，最终促进轴突再生和降低脊髓神经元焦亡水平，促进脊髓损伤小鼠功能的恢复[48]。M2小胶质细胞来源外泌体能抑制星形胶质细胞的过度活化、减少胶质瘢痕形成，为轴突再生提供微环境支持。 2.2.4   施万细胞来源外泌体   施万细胞是周围神经系统的髓鞘胶质细胞，具有髓鞘再生能力，能够减少受伤部位的炎症，最终促进轴突的产生来缓解脊髓损伤[49]。施万细胞来源外泌体可通过降低腺苷酸活化蛋白激酶磷酸化水平改善脊髓损伤后线粒体形态及功能，进一步促进线粒体自噬，减少由于脊髓损伤导致的氧化应激和炎症反应，有效抑制细胞坏死，减少细胞凋亡，促进轴突再生和运动功能恢复[35]。施万细胞来源外泌体可以作用于损伤部位的内皮细胞，促进内皮细胞增殖，刺激损伤部位新生毛细血管生成，新生毛细血管可以减少损伤区域的脊髓空洞，丰富周围血液供应。施万细胞来源外泌体通过递送整合素β1促进血管内皮细胞迁移和再生，增强损伤部位血管生成，能较好地促进脊髓损伤后的功能恢复[50]。 2.2.5   其他细胞来源外泌体   除了上述细胞来源外泌体外，还有一些其他来源外泌体在脊髓损伤中发挥积极的治疗作用。外泌体中所包含的miRNA在治疗过程中的作用较为显著。WU团队发现，脊髓损伤后细胞焦亡主要出现在小胶质细胞中，而Treg细胞分泌的外泌体能够抑制小胶质细胞焦亡，外泌体中的miR-709可抑制脊髓损伤后炎症反应并改善运动恢复[37]。脊髓损伤后，血-脊髓屏障的完整性被破坏，而周细胞在维持屏障稳固方面发挥重要作用，GAO等[38]研究发现，周细胞来源外泌体能促进血-脊髓屏障中内皮细胞的修复，外泌体中的miR-210-5p 能有效改善血-脊髓屏障功能并增强内皮细胞完整性；此外，将血管内皮细胞分泌的外泌体与间充质干细胞共同注射进脊髓损伤大鼠体内后，能有效促进脊髓损伤区域血管再生，维持血-脊髓屏障完整，进而改善大鼠后肢运动功能[39]。除血管内皮细胞分泌的外泌体外，富含血小板的血浆来源外泌体，在促进血-脊髓屏障修复以及抑制炎症反应方面发挥显著作用[40]。外泌体修复脊髓损伤的作用机制见图5。"

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2.3   可结合外泌体的生物材料    2.3.1   水凝胶   水凝胶在组织修复和重建领域一直发挥着突出作用，尽管水凝胶本身相对缺乏生物活性，但使用水凝胶作为载体可以提高外泌体的稳定性，并有助于将外泌体输送到缺陷部位进行持续原位释放[51]。水凝胶按功能不同分为4种类型，分别是微凝胶和纳米凝胶、刺激响应性水凝胶、黏附性水凝胶以及用于神经损伤修复的导电水凝胶[52]。 微凝胶：微凝胶包含水凝胶微球和纳米凝胶两大类，其中凝胶微球是粒径为微米范围内的颗粒水凝胶，它们的相对表面积更大，更易穿透组织屏障[53]。纳米凝胶能较好地清除脊髓损伤后产生的炎症因子，有效缓解神经炎症。纳米凝胶与外泌体及其分泌的生长因子结合可以有效抑制损伤部位炎症反应，促进血管和髓鞘再生，对脊髓损伤后的运动功能恢复有极大助益[54]。例如，FENG团队构建了一种透明质酸偶联聚多巴胺纳米颗粒水凝胶[55]，两者在脊髓损伤中协同发挥作用，水凝胶可以为神经组织提供支撑，促进干细胞的黏附和生长，而纳米颗粒可以缓解脊髓损伤后带来的氧化应激，抑制损伤部位炎症反应，该水凝胶尾静脉注射后可以有效促进损伤部位轴突再生，改善脊髓损伤损伤大鼠的运动功能。   刺激响应性水凝胶：刺激响应性水凝胶是根据光、磁场、温度、机体氧含量、pH值、酶水平和温度等因素的变化，设计出的一种可以通过外部刺激来控制生物活性物质释放的水凝胶，包括化学敏感(如葡萄糖、氧化还原和 pH值)水凝胶、生物敏感(如酶或蛋白分子)水凝胶和物理敏感(如温度、磁性、光和电)水凝胶。刺激响应性水凝胶能够精准控制外泌体的释放，并具有显著的靶向性[56]。脊髓损伤后，体内会产生大量活性氧以及炎症因子，同时机体内活化的免疫细胞会表达基质金属蛋白酶，基质金属蛋白酶在机体内消耗生长因子和周围基质。基于以上因素，CHEN团队[57]制备出一种能够响应活性氧和基质金属蛋白酶的双响应水凝胶，在脊髓损伤后注射机体内会快速清除体内的活性氧以及炎症因子，并释放血管内皮生长因子，促进损伤后期功能的恢复。  黏附性水凝胶：黏附性水凝胶能够使药物或外泌体在损伤部位缓慢释放，增加药物利用率，增长治疗时间。脊髓损伤后，损伤组织末端与健康组织很难重建联系，传统水凝胶只能模拟脊髓组织结构，无法促进损伤部位与健康组织的连接。采用修饰后的具有黏附作用的水凝胶，能有效改善神功能和结构，例如，CHEN团队[58]制备出一种由胶原蛋白和纤维蛋白修饰的具有黏附性且机械性能优良的水凝胶，用于修复大鼠脊髓断裂区，发现在大鼠运动状态下，该水凝胶能够牢固地与脊髓残端结合，增加神经连接，同时募集内源性神经干细胞到达损伤区域并促进神经干细胞向神经元的分化，显著改善大鼠后肢运动功能。 导电水凝胶：生物电信号对于调节细胞行为至关重要，这些细胞行为可以促进细胞因子分泌并改善受损组织的微环境。导电水凝胶可以增强神经干细胞的神经元分化，并为外泌体构建一个稳定微环境，同时控制神经突触伸提供机械和电信号[59]。FAN等[60]发现植入材料的柔软程度会影响神经干细胞的分化，他们开发出一款可以模拟正常脊髓组织结构的导电水凝胶，并将其结合外泌体，发现该复合系统能促进M2型小胶质细胞极化、改善体内神经炎症，并通过激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B和丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶通路促进内源性神经干细胞迁移到损伤部位，刺激轴突延伸和髓鞘形成，改善脊髓损伤小鼠损伤后的运动功能。 2.3.2   生物支架   生物支架能够起到为细胞提供支撑、黏附的作用，并且可以模拟细胞外基质，为细胞提供更加贴近机体的生存环境[61]；此外，支架能够支持充足的气体运输、细胞所需的营养物质，以促进细胞增殖、存活和分化。生物支架按其功能分为三类：细胞培养支架、组织工程支架以及药物缓释支架[62]。 细胞培养支架：细胞培养支架是细胞培养过程中用于支持细胞生长、增殖和分化的三维结构材料，有助于维持细胞的正常形态和功能。具有生物活性的细胞支架可诱导多能干细胞向特定细胞类型分化，促进组织再生。SINGH团队[63]利用一种称为 X-DN宏结构(XDM)的分支四向连接 DNA 宏观结构来研究自组装DNA宏观结构与胶原蛋白之间的相互作用，设计出一款DNA-胶原蛋白活性支架及 XDM/Ⅰ型胶原支架，人神经母细胞瘤细胞系置于 XDM/Ⅰ型胶原支架中培养，能够在支架中分化为成熟神经元。同时另一团队证明，将载有神经干细胞的胶原支架移植到脊髓损伤大鼠中，在损伤部位可诱导神经干细胞分化，有效刺激和引导神经元的生长和轴突再生[64]。 组织工程支架：组织工程支架植入机体后可以暂时替代缺损组织，维持损伤部位形态结构，防止组织塌陷导致的损伤加剧。脊髓损伤后，轴突断裂且神经连接中断，此时利用生物支架能够促进轴突重新建立目标连接。开发可以促进轴突生长的高对齐和高密度以修复受损轴突束的神经导管支架，是脊髓损伤修复的策略之一[65]。YOU团队[66]利用从蚕丝中提取的丝素蛋白生成多通道生物支架导管，与以往的单通道支架不同，多通道支架能更好地促进和引导细胞迁移和轴突再生，并且允许轴突通过并到达损伤部位；粘连蛋白是神经组织中基底膜的主要糖蛋白，在与轴突导向相关的神经突生长中起重要作用；通过将PC12细胞接种于导管上，发现层粘连蛋白功能化显著促进了神经突生长，表明层粘连蛋白在丝素蛋白纳米纤维上的化学偶联可以为神经突生长提供生物活性信号；将该支架种植于脊髓损伤大鼠体内，明显促进了损伤部位血管和轴突再生，并且脊髓损伤大鼠BBB评分以及各项运动功能皆优于对照组。 药物缓释支架：药物缓释支架是在一般生物支架的基础上，将具有治疗作用的药物负载于支架表面，利用药物与支架材料之间的相互作用以及支架的物理结构控制药物的释放速度和时间，使药物和外泌体缓慢释放，在病变部位持续发挥作用，达到治疗疾病的目的[67]。基于此，XIAO等[68]开发出一款搭载紫杉醇的纳米纤维支架，紫杉醇可以有效促进脊髓损伤后的轴突再生，并在组织抑制因子存在下还可促进轴突生长电位的恢复，但由于该药不能透过血脊髓屏障，因此设计出可以搭载紫杉醇的纳米纤维支架，该支架可以较好地控制紫杉醇在体内的释放，能够缓解脊髓损伤大鼠脱髓鞘发生、减少神经瘢痕增生、促进大鼠后肢运动功能的恢复。 2.4   外泌体与生物材料结合发挥显著治疗优势   尽管外泌体的治疗作用效果显著，但仍不可避免出现靶向性差、生物利用率低、半衰期短等情况，生物材料缺乏生物活性，仅能发挥支撑和组织保护作用。但生物材料具有稳定的物理支撑结构和生物相容性，并且不同类型的生物材料在组织修复、药物递送方面能发挥巨大优势，这正好弥补了外泌体在体内作用时效短、生物利用率低以及靶向性不明确等问题。目前，外泌体与生物材料相结合在骨组织再生和重建、神经修复、血管再生等领域发挥积极治疗作用。生物材料对外泌体的作用见表3。 "

2.5   脊髓损伤的病理机制   脊髓损伤分为原发性损伤和继发性损伤，前者是损伤当时的直接破坏，导致脊髓组织撕裂、出血、水肿甚至断裂，后者将持续在数小时至数天内直接发生。继发性损伤是导致病情加剧和神经功能恶化的主要原因，导致继发性损伤的原因包括缺血缺氧、炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等，这会加剧损伤部位神经细胞死亡，加快神经瘢痕的形 成[76]。目前，如何干预继发性脊髓损伤带来的进一步损害是临床干预的靶点，当前研究的重点便是减轻继发性损伤带来的神经炎症，同时抑制细胞凋亡，促进损伤区域轴突和血管再生。 2.6   外泌体与水凝胶结合治疗脊髓损伤的作用机制   目前已有大量研究证明，将外泌体与水凝胶结合可以促进脊髓损伤后功能的恢复，既能发挥外泌体的最大效力，又能维持损伤区域的微环境。不同细胞来源外泌体对脊髓损伤的治疗机制主要分为以下三类：抑制神经炎症，缓解细胞凋亡；促进轴突和髓鞘再生，促进运动功能恢复；促进血管再生，恢复损伤区域血供。 2.6.1   抑制神经炎症，缓解细胞凋亡   原发性损伤的严重程度影响了神经炎症的发展，神经炎症的产生源于免疫细胞在组织内的长期浸润，同时会加重组织损伤并进一步破坏正常组织，这一过程是通过多种细胞类型和炎性细胞因子实现的，这些细胞因子和其他趋化因子由损伤部位的小胶质细胞、星形胶质细胞和免疫细胞释放，炎症因子的长期浸润会导致神经元受损；此外，小胶质细胞和星形胶质细胞极易分化为促炎表型，会加重神经炎症，严重影响脊髓损伤预后[77]。外泌体与水凝胶结合后，主要通过抑制神经细胞凋亡、调节小胶质细胞和星形胶质细胞极化缓解炎症因子的释放来抑制继发性损伤造成的神经炎症。 抑制细胞凋亡：在脊髓损伤数小时至数天内，神经细胞在缺血缺氧等情况下通过凋亡途径死亡，这加重了脊髓组织的进一步萎缩，外泌体结合水凝胶可通过多条信号通路来抑制细胞凋亡。YU等[78]制备一种由谷胱甘肽修饰的封装M2型小胶质细胞来源外泌体的二甲双胍纳米凝胶，谷胱甘肽能够穿过血-脊髓屏障，并且具有较高的生物安全性，结合二甲双胍能抑制氧化应激、稳定微管和减少神经元细胞凋亡来促进脊髓损伤运动功能的恢复。WU等[79]将血小板衍生生长因子模拟肽与水凝胶微球结合，可通过调节Bcl-2/Caspase-3/Bax信号通路减少神经细胞调亡，改善损伤区域的炎症反应，增强轴突再生和髓鞘形成，重建损伤部位血管结构，加强突触再生，改善脊髓损伤大鼠运动功能。除此以外，外泌体结合水凝胶也可调节其他凋亡相关信号通路，韩悦[80]将脂肪间充质干细胞来源外泌体与多肽水凝胶结合，发现该复合系统通过调节磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路抑制脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡，促进神经修复，显著提升脊髓损伤大鼠BBB评分，同时下调白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等炎症因子的表达。 调节小胶质细胞极化：脊髓损伤后，小胶质细胞会分化为M1促炎型和M2抗炎型，抑制M1型小胶质细胞极化也可较好地缓解炎症因子的释放。GUAN等[81]研究发现，将M2小胶质细胞来源外泌体与单宁酸和聚吡咯组成的导电水凝胶结合后，通过在损伤部位持续释M2型小胶质细胞外泌体刺激磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路，诱导 M1型小胶质细胞转变为 M2型，从而显著减轻炎症反应。LIU团队[82]开发出一种整合了Fe?O?和钛酸钡的核壳纳米颗粒与人脐带间充质干细胞来源外泌体的仿生磁电水凝胶，在磁场刺激作用下，该水凝胶通过调节磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路可有效缓解经脂多糖诱导的小胶质细胞炎症反应，促进小胶质细胞向M2型抗炎表型极化，体内实验也能证明该水凝胶通过调节磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路诱导神级干细胞分化为神经元，阻止细胞向小胶质细胞和星形胶质细胞分化。 上述研究证明了外泌体结合水凝胶在抑制脊髓损伤神经炎症方面发挥着显著作用，外泌体结合水凝胶通过调节相关炎症信号通路发挥治疗作用，在这些炎症通路中，磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路和Bcl-2/Caspase-3/Bax信号通路的调控作用尤为显著，这提示若能将具有调节上述信号通路上下游蛋白的外泌体进行组合，是否能发挥更好的治疗作用？ 2.6.2   促进轴突和髓鞘再生，促进运动功能恢复   轴突在神经元信号传递过程中发挥重要作用，能够维持细胞间通讯，具有传导神经冲动、传递电信号、递送神经营养物质、形成神经网络等功能。脊髓损伤后，髓鞘磷脂产生大量的髓鞘相关糖蛋白、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白等轴突生长抑制因子，这些抑制因子导致轴突生长锥崩裂，使轴突再生受限；同时损伤区域星形胶质细胞增生、肥大，并分泌胶质纤维酸性蛋白和硫酸软骨素蛋白多糖参与构成神经胶质瘢痕，导致神经传导通路的废用[83]。外泌体与水凝胶结合在很大程度上减少了神经瘢痕增生，促进轴突和髓鞘再生，对脊髓损伤后的功能恢复产生积极影响。 促进轴突再生：外泌体中的miRNA在促进脊髓损伤轴突再生中能发挥显著优势。SUN团队[84]通过单细胞RNA测序筛选出骨髓间充质干细胞中的一种亚型，即CD271+CD56+骨髓间充质干细胞亚群，该亚群分泌的外泌体有较为显著的促进轴突再生作用，为保证外泌体能在体内稳定长久地释放，将其搭载水凝胶在脊髓损伤部位进行注射，结果显示注射CD271+CD56+骨髓间充质干细胞来源外泌体后的小鼠轴突再生能力、损伤区域恢复情况明显优于对照组；此外，他们对 CD271+CD56+骨髓间充质干细胞进行了 microRNA 测序，发现miR-431-3p在轴突再生中发挥重要调控作用，能增加轴突的延伸距离和分支数量；脊髓损伤后，排斥引导分子家族成员a 高表达，它是抑制轴突再生的潜在靶基因，CD271+CD56+骨髓间充质干细胞来源外泌体能调控miR-431-3p作用于损伤神经元中促进轴突再生，并且抑制分子家族成员a的表达，对脊髓损伤后的小鼠运动功能恢复起到促进作用。神经元利用微管作为其主要结构元素来产生细长的轴突，因此，微管的稳定对于轴突再生至关重要。组蛋白脱乙酰化酶6是位于细胞质中的组蛋白脱乙酰化酶，抑制组蛋白脱乙酰化酶6表达能够激活神经细胞自噬水平、影响神经微管的乙酰化水平，以此促进神经突生长[85]。所以，另一研究团体从表皮生长因子受体阳性神经干细胞中分离出外泌体，将其包埋进3D打印水凝胶贴片中，外泌体能较为轻易地穿过血-脊髓屏障，该外泌体中的miR-34a-5p能够递送至神经元并下调组蛋白脱乙酰化酶6，从而激活自噬过程，促进神经突生长；体外实验可以证明，表皮生长因子受体阳性神经干细胞来源外泌体能够有效缓解硫酸软骨素干预后对轴突生长的抑制，体内实验证明，该水凝胶贴片可促进脊髓损伤小鼠的轴突生长、缩小组织损伤面积、提升BMS评分[86]。以上结果均能证明外泌体中携带的miRNA在促进轴突再生中具有显著效果，并且水凝胶能明显增强外泌体的作用时长，为外泌体的稳定释放提供环境保护。 促进髓鞘修复：将三维培养的间充质干细胞来源外泌体与热敏甲基丙烯明胶杂交，制备成微针阵列贴片，可以降低脊髓损伤后星形胶质细胞中胶质纤维酸性蛋白的表达，避免星形胶质细胞过度积累引起的神经胶质细胞/纤维化瘢痕的形成[87]。此外，骨髓间充质干细胞来源外泌体与导电水凝胶可组成生物敷料，通过核因核因子κB信号通路调节M2巨噬细胞极化，减轻炎症反应，促进施万细胞的附着和迁移，促进轴突再生，从而改善肌肉去神经支配萎缩并进一步促进功能恢复。除调节核因子κB 信号通路外，骨髓间充质干细胞来源外泌体与导电水凝胶结合可以抑制神经炎症，增强中枢神经系统中神经元和少突胶质细胞分化，促进神经元和轴突再生，并通过激活磷脂酰-3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信号通路促进轴突生长，加快脊髓半切术后小鼠的运动恢复进程[88]。WANG团队[89]利用源自人诱导多能干细胞的皮质神经元分泌的外泌体和人脐带间充质干细胞的脱细胞细胞外基质开发了一种黏附性水凝胶，将其递送至脊髓损伤部位，显著降低了损伤区域的神经瘢痕形成，促进髓鞘再生，极大地改善了脊髓损伤大鼠的运动功能。 以上研究显示，外泌体结合水凝胶在促进轴突再生、促进髓鞘恢复方面的效果显著，但相关文献报道数量较少，后续可继续探究外泌体中的活性成分与水凝胶的相互作用，发掘调控轴突和髓鞘再生的信号通路，拓展对于脊髓损伤治疗思路。 2.6.3   促进血管再生   脊髓损伤后，血-脊髓屏障和微血管破坏是加重继发性损伤的关键因素，受损部位血管破裂后形成大面积血肿，而局部微环境的改变可能导致血管内皮细胞凋亡，加速炎性递质如自由基、一氧化氮的释放，这些递质会进一步影响血管再生[90]。脊髓损伤导致局部血流动力学的改变，如血流速度减慢、血液黏稠度增加等，这些改变可能影响血管再生。在脊髓损伤修复过程中，轴突再生通常沿着血管生长，血管再生的破坏会阻止受伤组织的再生，因此，促进血管内皮再生在修复神经系统中起着至关重要的作用。神经干细胞来源外泌体具有促进血管内皮细胞增殖的作用，使用黏附性透明质酸水凝胶搭神经干细胞来源外泌体注射至脊髓损伤区域，发现该水凝胶可促进血管生成[91]。另外MU团队[92]证明装载间充质干细胞来源外泌体的透明质酸水凝胶，可促进血管内皮增殖、提高损伤部位血供。除细胞来源的外泌体外，富含血小板的血浆来源外泌体在血管再生中也发挥重要作用，例如，YUN团队[93]研发出一种负载血浆来源外泌体的三重网络水凝胶，其中富集神经营养因子、血小板衍生生长因子和胰岛素样生长因子1，能显著促进血管内皮细胞的增殖、黏附和迁移，并通过激活磷脂酰肌-3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信号通路诱导神经发生和血管生成，促进细胞外基质的产生和血管再生。 综上所述，血管内皮再生对于脊髓损伤后组织的修复至关重要，持续的血供是加速脊髓损伤后期功能恢复的基础。外泌体能够较好地调控血管内皮细胞的增殖，由于不同细胞来源外泌体都具有促进血管内皮增殖的作用，提示未来可将多种外泌体联合应用以促进脊髓损伤后功能的恢复。外泌体结合水凝胶治疗脊髓损伤的作用机制，见表4。 "

2.7   外泌体与生物支架结合治疗脊髓损伤的作用机制   生物支架能够起到为细胞提供支撑、黏附的作用，并且可以模拟细胞外基质，为细胞提供更加贴近机体的生存环境；此外，支架能够支持充足的气体运输、细胞所需的营养物质，以促进细胞增殖、存活和分化。将外泌体与生物支架结合，既可以支撑损伤区域，为损伤区域提供营养支持，又可以定向给药，极大提高治疗效率。外泌体与生物材料结合治疗脊髓损伤的作用机制主要包括以下两点：抑制神经炎症；促进轴突和髓鞘再生。 2.7.1   抑制神经炎症   原发性脊髓损伤后，组织破损导致免疫细胞、血管活性肽和炎症因子流入脊髓，完全破坏脊髓组织微环境，加重了神经细胞凋亡，并刺激小胶质细胞极化，进一步加重了继发性损伤严重程度，因此，抑制神经炎症是治疗脊髓损伤的重中之重[94]。 调节小胶质细胞极化：LI等[95]利用3D打印技术研发出一种神经干细胞微纤维支架，将其与脐带间充质干细胞衍生外泌体结合，研究显示，装载外泌体的水凝胶支架能改善脂多糖诱导的BV2细胞炎症反应，促进小胶质细胞向M2型转化，同时将支架植入损伤区域后可抑制炎症因子的释放、促进神经突再生，发挥神经保护作用。XIAO等[96]通过测序验证脐带间充质干细胞来源外泌体中的主要作用成分，发现发挥治疗作用的主要成分是miR-138-5p，基于此，分别制备了包裹脐带间充质干细胞来源外泌体的支架和只包裹miR-138-5p的水凝胶支架，研究显示miR-138-5p在体外能抑制脂多糖诱导的BV2细胞向M1型极化，miR-138-5p显著降低了NLRP3/caspase-1的蛋白表达，有效抑制了神经炎症因子的表达；对脊髓损伤大鼠尾静脉注射包裹外泌体的水凝胶支架后，大鼠后肢拖拽明显改善且后肢摇摆幅度减小；步态分析结果显示，注射只包裹miR-138-5p水凝胶支架组小鼠步幅和步宽均优于注射脐带间充质干细胞的外泌体支架组，并且炎症因子水平如白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等水平下降更明显，证明外泌体中miR-138-5p在调节神经炎症、改善运动功能恢复方面的重要作用。 抑制经胞细神凋亡： 甲泼尼龙是一类糖皮质激素，能够调节神经炎症，显著改善脊髓损伤后微环境，促进神经元的存活，缓解脊髓损伤诱导的炎症微环境[97]。ZHU等[98]将搭载甲泼尼龙的施万细胞来源外泌体与纳米纤维支架以及透明质酸水凝胶组合，制备复合贴片，放置于受损区域以实现药物的定向递送，发现该复合贴片有效抑制了Cleaved-caspase-3蛋白的表达、缓解细胞凋亡、促进损伤神经元的存活，进而改善脊髓损伤大鼠的运动功能。 通过以上文献可以发现，外泌体与生物支架结合在抑制神经炎症方面的效果显著，生物支架不仅发挥组织支撑作用，同时能够调控外泌体在组织内的释放，但相关文献表述较少且上述文献中主要提及的外泌体多为间充质干细胞，对其他细胞来源外泌体提及较少。未来研究可探索其余细胞来源外泌体与生物支架结合后对脊髓损伤的治疗作用，拓展治疗 思路。 2.7.2   促进轴突和髓鞘再生   促凋亡信号通路的激活和缺血性损伤引发许多功能性神经元的丢失以及轴突髓鞘的断裂，导致细胞之间的信号传递中断。生物支架能够发挥支撑和保护作用，防止组织损伤进一步加重，生物支架与外泌体结合能促进神经元轴突再生，加强脊髓损伤后细胞间的信息传递以及物质运输，促进功能恢复[99]。 促进轴突再生：RAN等[100]采用新型组合肽将组合肽与自体血浆来源外泌体结合，生成一种可以治疗脊髓损伤的生物支架，该支架的可塑性高且与周围组织融合性好，能靶向于脊髓损伤区域的受损神经元，促进轴突再生，促进脊髓损伤小鼠运动功能的恢复。 促进髓鞘再生：已有实验证明miR-21在脊髓损伤后以时间依赖性方式上调，miR-21具有调节星形胶质细胞肥大和神经胶质瘢痕的作用，但单一治疗无法保证miR-21的有效递送。LIU等[101]设计将胶原结合结构域融合溶酶体相关膜糖蛋白2b蛋白和 miR-21在宿主HEK293T(293T)细胞中过度表达，用于产生工程化的 miR-21负载外泌体，将负载miR21的工程外泌体通过浓缩和富集植入Ⅰ型胶原蛋白支架中，该生物支架能够有效抑制神经元凋亡并增加神经元的活性和存活率，减少神经瘢痕增生，缓解脊髓损伤。神经肽前体被证明与髓鞘形成和少突胶质细胞的发育密切相关，通过调控神经肽前体的表达水平可以有效促进轴突再生，减少神经瘢痕的形成。HE等[102]将间充质干细胞来源外泌体与纤维蛋白结合形成纤维蛋白凝胶支架，注射进脊髓损伤小鼠体内，结果显示纤维蛋白凝胶能显著上调神经肽前体表达水平、促进少突胶质细胞生成、加快髓鞘从头生成，改善脊髓损伤后的组织结构。 此外，另一团队利用间充质干细胞来源外泌体作为药物递送载体，通过新型双重生物特异性肽设计了一种胶原支架，通过间充质干细胞来源外泌体提高紫杉醇的递送效率，这种多功能支架通过促进神经细胞迁移增强神经再生和减少瘢痕沉积，在促进大鼠脊髓损伤后的运动功能恢复方面表现出优异的性能[103]。 通过总结上述研究发现，外泌体结合生物支架促进轴突与髓鞘再生主要是通过调节轴突或髓鞘相关蛋白或miRNA发挥治疗作用的，在未来的研究中可以更为直接和更有针对性地干预轴突和髓鞘相关调控蛋白，达到更好的治疗效果。此外，文献中通过制备工程化外泌体使得外泌体批量化获取具有可行性，为后期临床应用提供了新的思路。外泌体结合生物支架治疗脊髓损伤的作用机制，见表5，图6。 "

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