2.1   10X Genomics样品处理和cDNA文库制备   人肋软骨组织制备成单细胞悬液，使用Countess?Ⅱ Automated Cell Counter进行细胞计数和细胞活率测定，细胞活率为85%，将细胞浓度调整为1×109 L-1。利用Illumina HiSeq测序平台进行测序和初级分析，进行数据可视化，在单细胞水平上生成了肋软骨组织中基因表达的深层转录图，获得6 634个细胞进行分析，检测到单个细胞的单分子标签和基因中位数分别为16 405和2 956。81.8%的测序饱和率表明对可用转录本进行了全面取样。以上数据见图1A。 对数据分析之前进行了严格的数据质控，首先检测了碱基含量的分布，见图1B，其用于检测有无AT、GC分离现象。理论上普通文库的G和C碱基及A和T碱基含量每个测序循环上应分别相等，且整个测序过程稳定不变，呈水平线。由于随机引物扩增偏差等原因，常常会导致在测序得到的每个read前几个碱基有较大的波动，这种波动属于正常情况。由图1B中GC含量分布看出，未检测到AT、GC分离现象。在文库构建过程中可能会掺入死细胞，或者多个细胞被捕获在同一个液滴中，产生潜在的多重细胞，因此利用基因数和单分子标签数进行质控，见图1C，基因数大于5 000、大部分细胞的单分子标签数大于10 000，是一组高质量的测序数据。随着测序数据量的增加，单细胞检测到的基因数量和单分子标签的数量也随之增加，两者之间呈明显正相关，见图1D。细胞的单分子标签数与基因数的相关性可以确定是否有大量死亡或濒死细胞的线粒体污染，此次数据得分为0.89，符合要求，可以进行后续分析。"

2.2   根据单细胞转录组测序数据进行细胞分群   为了深入剖析肋软骨细胞的异质性，首先对表达数据单分子标签归一化，然后主成分分析降维，见图2A，选取K-means聚类算法进行细胞分群，同时利用T分布随机邻域嵌入进行可视化的聚类分析，获得了4个聚类(Cluster)的细胞群，不同类的细胞亚群标记为不同的颜色，见图2B。每个亚群都有特异的标记基因，图中显示了各亚群中前20名的差异基因，见图2C。结合软骨细胞特征性基因在各群中的表达情况，发现Cluster1是以COL10A1、S100A2为标记基因的细胞群，这群细胞在该样本中占比36%；Cluster2是以BMP2、COL2A1基因为标记基因的细胞群，细胞数占总样本的36%；Cluster3是以FOS、JUN基因为标记基因的细胞群，细胞数占总样本的25%；Cluster4是以CD90、CD146基因为标记基因的细胞群，细胞数占总样本的数量最少，仅为3%，见图2D。"

为了进一步区分每个聚类，基于基因平均表达量和亚群之间的差异表达基因进行协方差统计分析，研究发现标记基因均具有较高的特异性，可以识别细胞类型，见图3。Cluster1中肥大软骨基因COL10A1、钙调蛋白S100A2、抑制基质降解蛋白SERPINE2、软骨标记基因SOX9表达比较高，成软骨基因COL2A1、COL9A1、增殖调控基因FOS、JUN、BCL2，热调蛋白基因HSPA1A表达相对较低，因此这群细胞高表达肥大软骨细胞标记基因，将Cluster1注释为肥大软骨细胞群。Cluster2中成软骨基因COL2A1、COL9A1、SOX9、BMP2，钙调蛋白S100A2的基因表达相对较高，增殖性基因FOS、JUN，热调蛋白HSPA1A，干细胞基因CD90、CD146的表达均比较低，因此Cluster2是一群向软骨分化完全，但增殖能力不强的软骨细胞群。Cluster3中增殖性基因FOS、JUN，抑制凋亡的基因BCL2，调控细胞生长的基因HSPA1A、HAPA1B特异性高表达，软骨分化基因SOX9、COL2A1，干细胞基因CD146在Cluster3的表达相对较少，因此Cluster3被定义为一类增殖性细胞群。Cluster4中肥大软骨基因COL10A1，成软骨基因SOX9、COL2A1表达均较少，但调控细胞发育相关的基因MYLK、干细胞标记基因CD146、CD90等在Cluster4中特异性表达，将Cluster4注释为干细胞群。"

2.3   细胞亚群标记基因参与的生物过程    为了进一步研究肋软骨组织中各细胞亚群相关的功能状态和潜在的调控因子，对每个细胞群中富集的差异表达基因进行GO和KEGG分析，见图4，结果显示：在被注释为肥大软骨细胞群的Cluster 1中，生物学功能方面主要富集细胞间的黏附和对细胞迁移的调控；在细胞组分方面主要富集在细胞外基质、细胞外泌体之中；在分子功能方面主要富集蛋白质结合和细胞黏附等功能。在被注释为软骨细胞群的Cluster 2中，生物学功能方面主要富集软骨细胞分化、Wnt信号通路的调节、细胞增殖和凋亡的调节；在细胞组分方面主要富集在细胞外泌体，细胞外基质中；在分子功能方面主要富集胶原结合、蛋白质结合、细胞外基质结合等功能。在被注释为增殖性软骨细胞群的Cluster 3中，生物学功能主要富集信号传导、细胞周期调控等方面；细胞组分方面主要富集在细胞质、细胞核、细胞外基质等部位；在分子功能方面主要富集蛋白结合、ATP结合等方面。在被注释为干细胞的Cluster 4中，生物学功能主要富集在细胞增殖、细胞分化、细胞黏附、胶原分解代谢等方面；细胞组分主要在细胞外基质、细胞外泌体、细胞膜等部位；分子功能主要富集在激活金属酶等方面。综上所述，在细胞组分方面4个亚群都主要富集在细胞外基质，在分子功能方面都主要与蛋白质结合有关。"