2.1   复方中药有效成分    2.1.1   补肾活血汤   补肾活血汤的药物组成包括当归、地龙、木香、醋延胡索、陈皮、盐杜仲、丹参、补骨脂、桃仁、全蝎、骨碎补、淫羊藿、红花、透骨草和甘草。唐勇等[14]用补肾活血汤含药血清干预体外培养的兔膝关节软骨细胞，结果显示实验组软骨细胞增殖情况优于对照组，并且碱性成纤维细胞生长因子的mRNA表达量比对照组显著增高，说明补肾活血汤对软骨细胞增殖具有促进作用。吴刚等[15]用补肾活血汤含药血清干预大鼠骨髓间充质干细胞，7 d后含药血清组的Ⅱ型胶原mRNA水平、糖胺聚糖mRNA水平均高于空白组和诱导组，注射到膝关节8周后发现缺损处的软骨面光滑，软骨表面纤维化不明显，可见补肾活血汤含药血清能有效促进体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为软骨细胞，有助于软骨修复。 2.1.2   透骨消痛颗粒   透骨消痛颗粒是由巴戟天、淫羊藿、白芍、青风藤、制川乌、苍术、防风、当归、川芎、牛膝、羌活、独活等多味中药共同制成，可通过抑制自由基的产生，从而保护软骨细胞，而且透骨消痛颗粒含药血清能够加快软骨细胞周期，促进软骨细胞增殖[16]，同时可以延缓软骨细胞的凋亡[17]。贾峰等[18]发现添加透骨消痛颗粒含药血清组的骨髓间充质干细胞形态均有所改变，随着药物剂量的提高软骨细胞的数量逐渐增加，主要通过上调SOX9的表达促进骨髓间充质干细胞的成软骨作用，同时能够提高Ⅱ型胶原、X型胶原的表达，这进一步说明了透骨消痛颗粒含药血清能够有效诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化[19]。 2.1.3   益气汤   董蓓蓓等[20]运用黄芪、人参、炒白术、茯苓、炒杜仲、骨碎补、牡丹皮、山药、甘草九味中药制成的益气汤，将益气汤含药血清干预的大鼠骨髓间充质干细胞注射到病损的关节组织，6周后发现病变减轻，取滑膜病理检查未见明显异常，可见益气汤含药血清诱导的骨髓间充质干细胞能有效修复骨性关节炎大鼠的软骨退变和损伤。 2.1.4   复方丹参注射液   汤治黎等[21]发现复方丹参注射液可诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞；周信[22]研究显示复方丹参注射液和针药结合的方法均能够促进骨髓间充质干细胞的增殖，并能够诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞，针刺血清没有这种作用，但针药结合的方法较单纯应用复方丹参注射液在这两方面的作用更加明显。 2.1.5   龟鹿二仙胶汤   由鹿角、龟版、人参、枸杞子四味药制成的龟鹿二仙胶汤，在转化生长因子β诱导下，发现其中药血清可以明显促进软骨表型化骨髓间充质干细胞的糖胺聚糖分泌及Ⅱ型胶原mRNA的表达，与软骨细胞组和单纯诱导剂组相比较有显著性差异，龟鹿二仙胶汤含药血清可促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化，优化骨组织工程的种子细胞体系，改善软骨组织的质量，延缓软骨的退化过程[23]。 2.1.6   消痹灵   吴政安[24]利用消痹灵体外培养大鼠骨髓间充质干细胞，最终发现可以定向诱导分化为软骨细胞，并促进软骨细胞的增殖，与地塞米松、维生素、转化生长因子β等诱导因素效果相近。 2.1.7   复元胶囊   复元胶囊的主要成分为人参、淫羊藿、当归、枸杞子、鹿茸、黄芪、川芎等中药，胡文兴等[25]利用复元胶囊含药血清干预软骨细胞的生长，结果表明，复元胶囊含药血清对体外培养的软骨细胞增殖有一定的促进作用，能显著提高软骨细胞DNA及胶原蛋白的合成能力，同时复元胶囊能够通过抑制基质金属蛋白酶的表达，减少胶原蛋白的降解，从而达到保护软骨的作用[26]。 2.1.8   右归饮   陈祁青等[27]按照《景岳全书》配制出右归饮，含有熟地、炒山药、山茱萸、枸杞、姜炙杜仲、肉桂、制附子、炙甘草这8味中药，研究证实右归饮含药血清能在一定程度上促进转化生长因子β1诱导的骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化，低剂量组(5.35 g/kg)效果较显著。马春涛等[28]将诱导的骨髓间充质干细胞/纤维蛋白胶复合物植入到兔膝关节软骨处，发现同样可以促进软骨缺损的修复。 2.1.9   左归丸   左归丸组成：熟地、枸杞子、山药、菟丝子、龟版胶、山萸肉、牛膝、鹿角胶。徐凌霄等[29]观察补肾益精中药对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响，发现左归丸含药血清能明显促进骨髓间充质干细胞的增殖，同时软骨样细胞中Ⅱ型胶原和糖胺聚糖基因高表达。 2.2   单味中药有效成分   2.2.1   人参皂苷   人参皂苷是人参中的重要有效成分，以Rb1、Rg1为代表，二者具有抗凋亡、促进软骨细胞增殖的作用[30]，将人参皂苷Rg1添加到细胞培养基，观察到猪骨髓间充质干细胞的增殖分化能力有所提高，可见人参皂苷Rg1具有促进软骨细胞内信号传导与DNA合成的作用，最终骨髓间充质干细胞诱导成软骨细胞的数量得到增加[31]。一定剂量的人参皂苷Rg1对软骨组织有着积极的保护作用，当Rg1浓度为40 μmol/L时，可降低白细胞介素1α对Ⅱ型胶原的降解作用[32]，通过调控软骨细胞凋亡关键因子Bax/Bcl-2表达比例、下调Caspase-3的表达可以有效抑制软骨细胞过度凋亡，避免软骨组织遭到破坏[33]。谷远洋等[34]发现人参皂苷Rg1可以抑制白细胞介素1β诱导的软骨降解发挥软骨保护作用，主要通过抑制成纤维滑膜细胞中基质金属蛋白酶3基因和蛋白表达实现的。 2.2.2   黄芪甲苷   黄芪甲苷即黄芪苷Ⅳ，提纯于益气强体的黄芪，实验表明黄芪具有增强超氧化物歧化酶活性，减弱氧自由基对软骨细胞损害，促进软骨细胞合成与增殖的能力[35]。当黄芪甲苷浓度达到50-100 mmol/L时，可以拮抗软骨细胞内白细胞介素1β基因的表达，从而抑制软骨细胞凋亡[36]。余素姣等[37]实验表明黄芪甲苷能够通过抑制NLRP3炎症小体活化来降低软骨细胞中白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α蛋白的产生，最终关节软骨的炎症损伤得到减轻。 2.2.3   鹿茸多肽   通过梅花鹿鹿茸分离提取得到的一种生物活性因子鹿茸多肽，具有促进软骨细胞及成骨细胞增殖的显著作用，修忠标等[38]为了验证鹿茸多肽对兔骨髓间充质干细胞诱导成软骨细胞及细胞增殖的可能性，发现添加有鹿茸多肽的实验组骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的水平得到提高，并且细胞外基质Ⅱ型胶原与糖胺聚糖的表达水平有所增强。陈晓东等[39]对体外传代培养出现复制性老化的大鼠软骨细胞进行鹿茸多肽干预对照实验，观察鹿茸多肽对软骨细胞复制性老化的影响，结果显示：鹿茸多肽显著抑制老化相关β-半乳糖苷酶的表达，可见鹿茸多肽具有显著的抗软骨细胞复制性老化作用，同时鹿茸多肽具有促进软骨细胞增殖的能力，达到最佳质量浓度10 mg/L时可以明显促进软骨细胞合成Ⅱ型胶原和糖胺聚糖[40]。李文超等[41]实验发现一定浓度的鹿茸多肽能减轻白细胞介素1β对软骨终板细胞损伤，通过促进Ⅱ型胶原mRNA的表达，抑制Ⅰ型胶原与白细胞介素6 mRNA的表达，延缓椎间盘的软骨退变。 2.2.4   川芎嗪   川芎嗪是从川芎生物碱中分离得到的有效单体，具有改善微循环、抗血小板聚集、促进软骨细胞增殖等作用。川芎嗪主要通过抑制软骨细胞白细胞介素1β的表达，增强Bcl-2的表达水平，从而抑制软骨细胞的凋亡[42]，川芎嗪含药血清还可以加快软骨细胞有丝分裂周期促进其增殖过程[43]。朱海泉等[44]实验发现川芎嗪可以通过抑制NF-κB P65磷酸化，减轻脂多糖诱导的软骨细胞凋亡和炎症反应。 2.2.5   淫羊藿苷   淫羊藿主要通过淫羊藿苷发挥药理作用，蒋绍艳等[45]发现在淫羊藿苷的作用下，体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶呈阳性，与对照组相比有钙化结节形成。淫羊藿苷能够促进Ⅱ型胶原与糖胺聚糖的表达，促进大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化[46]，并且实验表明淫羊藿苷可以阻止骨髓间充质干细胞肥大化[47]。黄荷等[48]发现淫羊藿甙的剂量高达60 μg/L时，依然可诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。汪建样等[49]研究表明生长分化因子5联合淫羊藿素能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化，其中淫羊藿素起促进作用，淫羊藿素可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进大鼠骨髓间充质干细胞体外成软骨分化；之后张帅等[50]进一步证实了淫羊藿苷可以通过强化Wnt/β-catenin信号通路，进而促进软骨细胞增殖，抑制细胞凋亡，并且呈剂量与时间依赖性，可见淫羊藿苷是一种具有研究前景的软骨诱导因素。 2.2.6   骨碎补总黄酮   骨碎补总黄酮提纯于具有散瘀止痛功效的骨碎补。尚平等[51]将骨碎补总黄酮添加到兔骨髓间充质干细胞的体外诱导液中，实验发现骨碎补总黄酮组的吸光度值高于对照组，Ⅱ型胶原与糖胺聚糖的蛋白表达含量均有所提高，可见骨碎补总黄酮显著促进了骨髓间充质干细胞增殖以及成软骨分化。 2.2.7   梓醇   梓醇是补肾中药地黄的重要提取成分之一，是一种小分子环烯醚萜类化合物，水溶性强，但其化学性质不稳定，容易受气温与酸碱等环境变化的影响。现代研究表明，梓醇作为地黄具有滋阴功效的主要活性成分[52]，可促进软骨分化[53]；傅淑平等[54]发现梓醇可由非经典Wnt信号通路来发挥促进骨髓间充质干细胞体外增殖的作用，这与梓醇的作用时间长短及浓度大小正相关；另外，其能促进糖胺聚糖的基因表达，也能促进骨髓间充质干细胞成软骨分化。 2.3   中药有效成分促进骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的机制探讨与存在的问题   2.3.1   机制探讨   目前关于单味中药或者复方中药的有效成分，多以补肝益肾类、活血通络类、增补气血类为主，虽然种类不一，成分复杂，但是至少在某一方面或多方面对骨髓间充质干细胞诱导成软骨细胞具有促进作用。探讨其作用机制主要体现在以下5个方面，见表1：①促进骨髓间充质干细胞的增殖能力，例如复方丹参注射液、左归丸、人参皂苷、骨碎补总黄酮；②促进骨髓间充质干细胞定向诱导分化为软骨细胞的能力，例如补肾活血汤、益气汤、复方丹参注射液、龟鹿二仙胶汤、消痹灵、右归饮；③促进软骨细胞的增殖能力，可使得软骨细胞从G0/G1期向S期及G2/M期推进，加快细胞周期而促进软骨细胞增殖，例如补肾活血汤、透骨消痛颗粒、健骨伸筋汤[55]、消痹灵、复原胶囊、人参皂苷、黄芪甲苷、鹿茸多肽、川芎嗪、淫羊藿苷、梓醇；④抑制软骨细胞的凋亡，调节Bcl-2/Bax的比例，Bcl-2基因是一种可抑制细胞凋亡的原癌基因，而Bax与Bcl-2作用相反，当软骨细胞中的Bax过度表达，在与Bcl-2构成二聚体后拮抗Bcl-2的作用，此时软骨细胞就会凋亡，例如透骨消痛颗粒、健骨伸筋汤、人参皂苷、黄芪甲苷、鹿茸多肽、川芎嗪、淫羊藿苷；⑤抑制氧自由基、炎症因子等的生成，中药有效成分通过拮抗前者的产生可减轻软骨细胞的损伤；例如透骨消痛颗粒、复元胶囊、补肾壮筋汤[56] 、黄芪甲苷、川芎嗪。尽管关于中药有效成分促进骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的机制研究尚存在局限性，尤其是分子水平的相关研究十分有限，但中药组与空白对照组对比，中药与中药之间对比，许多实验均证实了某些传统中药具有促进骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的作用，将中药有效成分应用于软骨组织工程具有广阔的研究前景，仍值得深入探究。 2.3.2   存在的问题   目前有关中药应用于软骨组织工程的研究内容较少，一部分通过中药灌胃来辅助治疗软骨缺损，如牛维等[57]将鹿茸灌胃到大鼠体内，2，4，6周后分别与模型组比较，发现低、高剂量鹿茸组的Smad2、3 基因表达量均明显升高，可见鹿茸通过促进Smad2、3的表达从而促进了关节软骨缺损的修复；李永津等[58]利用龙鳖胶囊灌胃后发现其优于骨髓间充质干细胞移植，可显著促进大鼠Ⅱ型胶原的分泌，促进软骨修复，类似的还有利用中药七叶亭灌胃来修复兔骨关节软骨缺损[59]。另一部分通过中药有效成分添加到种子细胞培养液，最终促进软骨细胞形成与增殖，如利用人参皂苷或骨碎补总黄酮促进骨髓间充质干细胞的增殖以及成软骨分化[31，51]，黄芪甲苷促进藻酸钠-软骨细胞复合体成软骨作用的实验研究等[60]。基于骨髓间充质干细胞作为种子细胞，合适的三维支架材料与细胞因子是软骨组织工程中的重要环节，而中药由于其多样的发展优势逐渐受到国内外学者的重视，但还需要进行更多的基础与临床研究，以下面临的问题值得进一步探究：①无论是提高骨髓间充质干细胞与软骨细胞的增殖能力还是提高诱导能力、抑制细胞凋亡等机制，都只是停留在作为软骨诱导剂的体外研究层面，至于中药有效成分如何在分子水平精细调控，仍需深入开展调控机制的基础研究；②哪一种中药有效成分的作用相对更明显，需要更多的中药进行对比筛选，同时骨髓间充质干细胞定向分化成软骨细胞的诱导因子众多，作为传统的中药如何发挥优势，有必要通过更多的实验进行比较论证；③在诱导骨髓间充质干细胞软骨化过程中，关于各种中药有效成分的最佳纯化方法及最适宜浓度、致瘤性、长期稳定性等问题仍需要进一步摸索与验证，同时在制备含药血清过程中，缺少一套标准的操作流程与质量监控体制；④从复方中药到单味中药的研究，从添加中药粗制剂到利用含药血清或者提纯有效成分进行研究，这都是中药药理学研究的进步，但是就单纯研究单味中药来看，虽然对于明确是中药何种有效成分发挥作用是有利的，却打破了中药多成分、多靶点、多层次联合作用的特点，就单纯研究复方中药来看，其成分复杂，药物之间相互作用，很难研究其具体的作用机制，所以目前中药的研究仍存在药物的选择问题，是从功效最大化的复方中药入手还是作用最优化的单味中药入手，对于不同的实验目的仍值得比较与考量，当然站在作用通路与机制的研究角度，应用单味中药的有效成分是最直接的；⑤软骨组织工程的3大要素分别是种子细胞、支架材料、细胞因子，并以构建新的软骨组织修复软骨缺损为最终目的，而大多数实验主要针对种子细胞的扩增，未来可以加大研究力度，在前人的研究基础上，将中药有效成分在软骨组织工程中的应用范围进一步扩大，不断地去挖掘传统中药的潜在价值。 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