Chinese Journal of Tissue Engineering Research ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (34): 5511-5516.doi: 10.12307/2021.248
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Liu Guanjuan, Song Na, An Zheqing, Sun Jing, Liao Jian
Received:
2020-08-27
Revised:
2020-08-29
Accepted:
2020-09-26
Online:
2021-12-08
Published:
2021-07-27
Contact:
Liao Jian, MD, Associate professor, Associate chief physician, Master’s supervisor, School of Stomatology/Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:
Liu Guanjuan, Master candidate, School of Stomatology/Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
CLC Number:
Liu Guanjuan, Song Na, An Zheqing, Sun Jing, Liao Jian. Metagenomics and peri-implantitis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(34): 5511-5516.
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2.1 宏基因组学 2.1.1 宏基因组学概况 宏基因组包括微生态环境中所有遗传物质,宏基因组学最早由威斯康辛大学植物病理学部门的 HANDELSMAN等[9]在1998年提出。宏基因组学直接在自然环境中研究微生物群落,不需要对单个物种进行分离和实验室培养,对特定环境中全部微生物的总DNA进行克隆,然后建立DNA文库,筛选出新的活性物质;把宏基因组作为一个基因组单位,从样本中直接提取总DNA并用温和的方法保存高分子量DNA,用限制性酶切断并克隆到能携带大量碱基的细菌人工染色体载体上,细菌人工染色体载体筛选出生物活性分子并产生新的天然产物。即使基因的表达只能从蛋白质细菌中获得,克隆库也将提供遗传的多样性。宏基因组研究技术大致分为3个阶段[10]:针对16S rRNA为主要研究对象的核糖体RNA研究;以环境中所有遗传物质为研究对象;以环境中所有转录本为主要研究对象的宏转录组研究。 2.1.2 宏基因组学优势 在物种鉴定过程中,宏基因组测序具有较高的优势:①宏基因组测序是无假设或无偏见的测试,能发现新的或意想不到的有机体,有定量潜力,能够检测基因组的任何部分[11];②基于宏基因组的新一代高通量测序技术可以对环境中的所有遗传物质进行测序,对所测得的序列进行分析后可以了解微生物的群落结构及遗传特征;③宏基因组学的高通量测序作为一种不用培养的分子生物学技术,具备快速、准确、信息全面丰富等特点;④传统的16SrRNA测序主要研究群落的物种组成、物种间的进化关系及群落的多样性,而全基因组鸟枪测序通过高通量平行的DNA测序平台覆盖更加全面的基因测序,对特定环境中的样本进行深度测序,发现微生物之间的差异;⑤16S rRNA测序技术虽然也能鉴定微生物,但其得到的结果不能体现种属水平,而宏基因组学测序所得到的结果能反映出物种水平甚至菌株的水平。 2.1.3 宏基因组学研究进展 微生物遍布世界每个角落,大量的微生物很难用传统的微生物技术培养出来。宏基因组学的出现彻底改变了微生物技术领域,各种分子测序技术如二代测序、聚合酶链式反应、DNA-DNA棋盘式杂交和工具在宏基因组学中的应用,导致了从各种环境(如土壤、人体和海水)中获得的大序列数据集的生成[12]。宏基因组学应用于临床,通过分析疾病和健康状态下的微生物组可以诊断多种类型的综合征和样本类型的传染病[13]。宏基因组学深度测序所得到的片段通过组装可以变成长片段,质粒包括在其中,质粒属于双链的环状DNA片段,是抗生素耐药基因的主要载体之一,通过宏基因组学分析可以预测耐药基因在环境中的传播机制[14]。在2002年BREITBART等[15]发表的文章中,通过宏基因组学的方法测定斯克里普斯码头和使命湾的病毒微生物,发现这2个海洋群落大部分病毒的多样性似乎相同,但与已知序列相似的部分表明了2个样本之间存在根本差异,来自克里普斯码头的病毒群落在起源上更像细菌,而使命湾的样本则更像真核。宏基因组学能发现人类肠道微生物组的多样性。宏基因组学在识别新基因及确定功能失调的病因方面发挥着重要作用。将宏基因组学、元转录组学、蛋白质组学和代谢组学相结合,还可以促进对人类肠道微生物组功能活动的了解,可能为疾病诊断和治疗提供新的策略[16]。 在2010年QIN等[17]发表的文章中,用宏基因组学研究124名欧洲个体的粪便样本,首次在人类肠道微生物组中发现了330万个非冗余基因,而且这个基因集是人类基因补体的150倍。此外,人类肠道微生物群落中99%以上的基因是细菌,表明整个群体中有超过1 000种细菌。在2011年HESS等[18]发表的文章中,利用宏基因组测序对瘤胃样品中附着在植物纤维上的微生物DNA进行了测序和分析,鉴定了碳水化合物活性基因,组装未培养的微生物基因组并用基因组测序方法进行验证,所获得的数据提供了一个广泛的基因和基因组目录。宏基因组学测序也被广泛用于湖泊微生物中。在2018年VAVOURAKIS等[19]发表的文章中,通过宏基因组学测序方法对西伯利亚苏打湖表层沉积物中获得的异基因组进行测序,在碳、硫和氮循环的功能群中发现了新的优势谱系,这些细菌门以前从未与古老的厌氧碳固定和异化途径有关,包括放线杆菌。随着高通量测序技术的不断发展及成本的大幅下降,该技术被迅速应用于口腔微生物区系的研究中。高通量测序可以筛选与牙周组织疾病和健康相关的功能基因。二代测序是一种同时对数百万个DNA片段(或互补DNA)进行测序的方法,与传统方法相比能够同时分析多个基因或基因区域,因而在临床实验室得到迅速应用[20]。二代测序的核心思想是边合成边测序,即通过末端合成的标记点来测定DNA序列。随着二代测序测序技术的进步,低成本就能获得更快、更精确的测序[21]。目前,最常用于鉴定尚未能培养的口腔常驻菌的二代测序包括Roche 454 pyrosequencing、Illumina HiSeq/MiSeq、ABI SOLiD and Ion Torrent[22]。宏基因组揭示了其编码的天然产物的多样性,在分析微生物群落结构时有着独特的优势。 2.2 宏基因组学与种植体周围炎 2.2.1 口腔菌群 目前发现口腔菌群中包含有600-1 000种细菌,且结构复杂,它们编码的基因数量是人体自身基因的150多倍,包含重要的遗传信息[23]。人类口腔微生物组是由细菌、古生菌、单细胞生物、真菌和病毒组成的复杂微生物群,是仅次于胃肠道的第二大微生物群。更新于2017-11-22的扩展人类口腔微生物组数据库包含约772个原核物种的信息,其中70%是可培养的,30%属于不可培养的微生物类别,以及482个分类群的全基因组序列;在70%的可培养物种中57%已经被命名[24]。 2.2.2 种植体周围炎微生物 与种植体周围炎相关的微生物群十分复杂,与牙周炎有不同也有相似之处。牙菌斑在牙种植体上的积聚触发炎症反应导致种植体周围黏膜炎和或种植体周围炎[25]。微生物组分析表明,虽然牙齿和种植体共享一个共同的生态位,但它们在微生物群落中表现出差异[26]。Zhuang等[27]对龈下菌斑采用纸点取样,通过实时定量聚合酶链反应对6种致病菌进行了定量分析,其中包括牙龈卟啉单胞菌、牙本质密螺旋体、伴放线聚集杆菌、具核梭杆菌、中间普雷氏菌和金黄色葡萄球菌,发现牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌与牙周炎显著相关,但与种植体周围炎无关,伴放线聚集杆菌与牙周炎和种植体周围疾病有关,但与牙龈或黏膜的健康无关。用基于PCR的方法对28项研究进行评估并对19项研究进行Meta分析,发现在种植体周围炎的生物膜中检测到的聚集放线菌和中间普氏菌比健康种植体高[28]。 种植体周围黏膜炎是种植体周围炎发展过程的早期过渡期,牙周致病菌可能在种植体从健康状态向疾病的转变中起重要作用[29]。到目前为止,还没有确定有效的治疗措施来治疗种植体周围炎,大量的免疫炎症递质和骨相关分子可用于监测种植体周围健康和疾病[30]。白细胞介素1的复合基因型白细胞介素1A和白细胞介1B与种植修复失败和种植体周围炎的发生相关[31]。种植体周围炎是一种多细菌混合感染,包括牙周致病菌、不可培养的革兰厌氧阳性杆菌和其他不可培养的革兰阴性杆菌,以及罕见的条件致病菌,如肠道杆菌和金黄色葡萄球菌[32]。目前尚无明确的方法可以治疗种植体周围炎。LIAO等[33]将两种胶原屏障膜(Bio-Gide和BME-10X)负载唑来膦酸,用扫描电镜、能谱、红外光谱和高效液相色谱对膜的理化性质和药理作用进行了表征,发现负载唑来膦酸的胶原膜可延迟药物释放,为减少种植体周围骨吸收提供了一种新的治疗策略。 2.2.3 二代测序与种植体周围炎 二代测序技术也称下一代测序技术,发现了不同的口腔微生物高达19 000种,比之前用传统的培养方法发现的种类多[34]。LI等[35]采集种植体周围炎患者和非种植体周围炎人群的龈下菌斑样本,用基于高通量测序的Illumina-Miseq对16s rRNA的V4区进行测序,检测龈下菌斑的微生物多样性,利用Mothur软件分析了群落结构的多样性,发现种植体周围炎组优势菌为月形单胞菌、假单胞菌和梭杆菌,非种植体周围炎组优势菌为梭杆菌、韦氏菌和链球菌。LEfSe分析表明,种植体周围炎和非种植体周围炎组的细菌群落在系统发育水平上存在差异。 PéREZ-CHAPARRO等[36]发现拟杆菌门、糖化假丝酵母菌、厚壁菌、蛋白质细菌、螺旋体、协同体及古生菌等与牙周病相关。通过高通量测序发现,种植体周围炎的发生不仅与牙周炎病原菌有关,而且与口腔微生物群落结构的变化有关,齿构密螺旋体、丁酸单胞菌和褐杆菌可能与种植体周围炎的发生和发展密切相关[35]。用16S rDNA高通量测序研究健康天然牙、健康种植体和种植体周围炎病例发现,种植体周围炎是一种核心致病菌参与的简单感染[37]。使用二代测序技术对唾液微生物群进行详细分析,发现唾液微生物群中的细菌丰富度与口腔健康状况不良显著相关,如龋齿、牙周炎和口腔卫生 差[38]。APATZIDOU等[39]提取种植体周围炎和健康位点牙菌斑的DNA,利用Illumina-MiSeq平台对16S rRNA基因的V3-V4区进行高通量测序,发现健康样本的微生物群落比在种植体周围炎中发现的微生物群落更加多样,Synergistetes(一种未分类的革兰专性厌氧杆菌)与种植体周围炎高度相关。 2.2.4 聚合酶链式反应与种植体周围炎 聚合酶链反应(PCR)是近代应用较多的一种分子生物学技术,能在离体的情况下扩增特定的DNA片段。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。通过宏基因组学方法直接提取样本中的DNA,采用PCR对样本DNA的标记基因和功能基因进行扩增,对相应的产物进行测序,揭示微生物的多样性。PCR技术使得酶复制成为可能,允许少许微生物按指数倍数放大,极大提供了分析的灵敏度,而且其扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广、非常简便、快速,再加上不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板,已被广泛用于口腔微生物的分析,可用于检测种植体中放线菌、中间普氏菌等微生物。由于复合营养型厌氧微生物不易培养,常规技术无法检测出某些口腔致病菌,而PCR具备简单、快速、便宜等优点,应用分子基因技术则能检测这些难以培养的细菌,使人们对其有深一层的了解。 GALASSI等[40]用RT-PCR(实时定量荧光PCR)方法在种植体周围炎位点发现牙龈卟啉单胞菌,但并不是其特异性细菌。BELKACEMI等[41]以16s RNA基因的PCR测序为广谱筛选方法检测样本中的产甲烷菌落,发现其菌落中的大部分细菌是甲烷短杆菌,并以mcrA基因为靶点进行实时定量PCR进一步证实了结果。用PCR检测无牙颌患者口内的微生物发现,种植体存留的时间越长,伴放线聚集杆菌、牙龈卟啉单胞菌的量越多[42]。SATO等[43]通过PCR检测发现,牙周致病菌数量和检出率随着种植体周围炎进展而增加。通过免疫印迹、酶联免疫吸附实验和RT-PCR检测骨桥蛋白在种植体周围炎症反应中的表达,发现大多数种植体周围龈沟液中的骨桥蛋白升高[44]。 2.2.5 棋盘式DNA-DNA杂交与种植体周围炎 棋盘式 DNA-DNA杂交是一种利用地高辛标记的全基因组DNA探针,在单个膜上对多个混合微生物群样品同时进行定量分析的技术。棋盘式DNA-DNA杂交通过将大量DNA样品与大量DNA探针在单一膜上杂交,能同时测定单个或多个牙菌斑样本中多种细菌,从而适用于一系列临床或环境中的样本[45]。棋盘式DNA-DNA杂交是一种半定量技术,在牙科学中已被用于检测和量化牙齿样本中的多种细菌种类[46]。 SHIBLI等[47]通过棋盘式DNA-DNA杂交发现,在种植体周围炎中牙龈卟啉单胞菌、齿状密螺旋体和连翘单胞菌的平均计数均高于健康种植体组;与健康种植体相比,种植体周围炎中红色复合物的比例升高,而与宿主相关的益生菌减少。通过棋盘式DNA-DNA杂交分析天然牙和种植体龈下菌斑样本中的40种细菌,发现连翘菌和金黄色葡萄球菌与种植体周围炎有关[48]。RENVERT等[49]采用发光磁珠技术和棋盘式DNA-DNA杂交技术对41例种植体周围炎患者的治疗效果进行评估,发现以色列放线菌、伴放线聚集杆菌的细菌计数呈下降趋势。采用棋盘式DNA-DNA杂交技术评价YAG激光、壳聚糖刷和钛刮匙3种仪器治疗种植体周围炎的效果,发现3种治疗方式均显著减少了附着的牙龈卟啉单胞菌数量,而YAG激光是唯一能有效去除有毒和无毒牙龈卟啉单胞菌的方法[50]。细菌棋盘式DNA-DNA杂交适用于分析生态系统的物种多样性和大量样本。由于全基因组探针可显示交叉反应性,也就无法避免假阳性的发生,因此探针质量和严格的杂交对于诊断的可靠性十分重要。 2.3 培养组学与种植体周围炎 2.3.1 培养组学的研究进展 宏基因组学使得分析大量样本及用相对丰富度量化单个微生物群成为可能,并且提高了分析的速度,这种独立于培养的分析方法有望拓宽种植体周围炎的微生物种类。然而,宏基因组学也存在许多缺陷:①DNA的分离提取是一个关键步骤,可能会影响最终结果的重复性;②当细胞浓度低于105个/g就不能检测到细菌群落,也就无法测得其组成[51];③宏基因组学比16s rDNA序列分析需要更高的序列覆盖率;④高通量测序技术的广泛使用产生了数百万个短序列,这给在合理时间内对大量的读取进行分类带来了计算上的挑战,尽管BLAST(基本的局部比对和搜索工具)是最敏感的元基因组学比对方法之一,但它的计算量非常大[52];⑤高通量测序的结果也受到广泛方法异质性。基于此,传统的培养方法又重新走进人们的视野。通过培养组学的方法,已经鉴定出717种不同的细菌种类,其中91种是新的细菌,168种是首次从人类身上分离出来的细菌[53]。 由多种培养条件和快速鉴定细菌组成的微生物培养组学,通过基质辅助激光解吸时间质谱法来鉴定微生物。基质辅助激光解吸时间质谱法能够在临床实验培养物中观察到可见生长的微生物,从而为临床微生物学领域注入了活力。基质辅助激光解吸时间质谱法已被证明能够准确地识别细菌、酵母、丝状真菌、诺卡氏菌和分枝杆菌,与传统的鉴定方法相比成本通常更低。随着质谱在临床微生物学领域应用研究的继续,将创建更多的数据库并将比以往任何时候都能识别出更多的微生物[54]。培养组学已经从人类微生物组中发现数百种新的细菌。利用基质辅助时间质谱法生成的谱线已添加到临床微生物学实验室使用的质谱数据库中[55]。培养组学可以培养并鉴定用宏基因组学很难检测到的微生物[56],培养组学与宏基因组学具有互补性。人类微生物群培养组学的巨大成功鼓励了微生物学家继续缩小自然界微生物丰富度和培养物种数量之间的差距,利于基础微生物学和应用微生物学的进一步发展。应用定制培养技术可能会开辟新的程序,获得尚未培养的生物体,并将已知的微生物群库扩展到前所未有的水平[57]。培养组学的概念扩展了表型学的概念,将基于培养的表型特征重新引入21世纪研究领域,得到了强大技术的支持,根据培养组学产生的大量数据能很快对微生物群进行分类和鉴定[58]。 2.3.2 培养组学与种植体周围炎 通过培养技术和16S rDNA测序发现,种植体周围炎龈沟非常适合专性厌氧菌的生长[59]。使用培养组学的方法分析种植体周围炎患者的龈下微生物,在分离的48种细菌中只有30种被宏基因组学鉴定过,12种以前从未发现与口腔相关,其中5种从未从临床样本分离出来[60]。临床微生物学中细菌性疾病的诊断依赖于其表型鉴定,而这些细菌基于已知的与人类有关的细菌库,这种鉴定模式实际上是对先前描述的微生物的识别,并不能鉴定新的细菌。用于鉴定微生物的基质辅助电离时间质谱法允许从菌落中获得的蛋白质光谱与数据库进行比较,数据库可以随着新鉴定的细菌而永久增加[61]。使用培养组学方法研究口腔中的微生物可以发现口腔中的特异菌群,并更准确地描述这些微生物与牙周炎与种植体周围炎的关系,此方法为种植体周围炎的诊断和治疗提供了进一步帮助。"
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