其他干细胞
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图2｜Atf7ip干扰促进骨形态生蛋白2(BMP-2)作用下MC3T3-E1细胞的成骨分化
结果：使用Lipo2000对MC3T3-E1细胞进行转染处理24 h后，提取细胞总蛋白进行蛋白免疫印迹检测。与NC-siRNA组相比，Atf7ip-siRNA组Atf7ip的蛋白表达量显著下调(P < 0.001)，说明Atf7ip干扰模型构建成功，见图2A。200 ng/mL BMP-2分别处理转染组和对照组细胞0，12，24，48 h，蛋白免疫印迹法检测结果显示，与对照组(NC-siRNA或0 h)相比，Atf7ip-siRNA组的H3以及其甲基化分子 H3K9me3表达明显降低，且以H3作为内参，H3K9me3甲基化明显降低；而成骨分化标记分子Runx2、Sp7的蛋白表达量显著增加，见图2B； qRT-PCR检测结果显示，Atf7ip-siRNA组细胞经BMP-2处理后骨钙素、Ⅰ型胶原α1的 mRNA表达进一步升高(P < 0.05)，见图2C。碱性磷酸酶染色结果可以看出在24，48 h Atf7ip-siRNA组染色明显深于对照组，与NC-siRNA组相比，在BMP-2处理0，12，24，48 h时，Atf7ip-siRNA组的碱性磷酸酶活性均增加，见图2D。以上结果表明干扰Atf7ip可促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。
图3｜Atf7ip过表达抑制骨形态生蛋白2(BMP-2)作用下MC3T3-E1细胞的成骨分化
结果：使用Atf7ip过表达载体(CMV-Atf7ip)和对照(CMV-VC)瞬时转染MC3T3-E1细胞24 h后，提取总蛋白进行蛋白免疫印迹法检测Atf7ip蛋白表达，结果显示，CMV-Atf7ip组的过表达效率明显高于对照组 (P < 0.05)，证明过表达模型构建成功，见图3A。Atf7ip过表达载体瞬时转染MC3T3-E1细胞24 h，经200 ng/mL BMP-2处理0，12，24，48 h后提取总蛋白和总RNA检测组蛋白H3、H3K9me3以及成骨分化标志物Sp7和Runx2的蛋白表达以及骨钙素和Ⅰ型胶原α1的mRNA表达。结果显示，与CMV-VC组相比，CMV-Atf7ip组H3K9me3的蛋白表达以及甲基化显著升高，成骨分化分子Sp7和Runx2的蛋白表达在Atf7ip基因过表达后明显下降，见图3B。qRT-PCR检测结果显示，CMV-Atf7ip组骨钙素、Ⅰ型胶原α1的mRNA表达较对照组显著下降(P < 0.05)，见图3C。碱性磷酸酶染色结果显示，CMV-Atf7ip组碱性磷酸酶阳性细胞明显少于对照组；碱性磷酸酶活性结果显示，与CMV-VC组相比，在BMP-2处理0，12，24，48 h时，CMV-Atf7ip组的碱性磷酸酶活性显著降低，见图3D。以上结果表明Atf7ip过表达抑制了MC3T3-E1细胞的成骨分化，且BMP-2处理并不能逆转其抑制成骨分化的效应。
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