干细胞与外泌体
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图1｜淋巴管内皮细胞鉴定及淋巴管内皮细胞来源外泌体(LECs-EXO)表征
显微镜下显示淋巴管内皮细胞呈铺路石状贴壁生长，细胞形态不规则。免疫荧光图像示淋巴管内皮细胞特异性表达内皮细胞标志物vWF。透射电镜下观察LECs-EXO呈典型圆盘状双层膜结构，粒径分析结果示LECs-EXO平均粒径大小为90.06 nm，LECs-EXO平均Zeta电位为-10.21 mV，见图1。
图2｜淋巴管内皮细胞来源外泌体(LECs-EXO)被施万细胞摄取内化情况及对施万细胞增殖能力的影响
DiO标记LECs-EXO被用于研究施万细胞摄取LECs-EXO效率，DiO标记LECs-EXO与施万细胞孵育24 h后荧光图像示施万细胞胞质中均匀分布绿色荧光信号，表明LECs-EXO被施万细胞高效摄取。EdU细胞增殖实验用于评估LECs-EXO对施万细胞增殖能力的影响，实验结果显示：不同质量浓度(10，50，100 μg/mL)LECs-EXO处理24 h后EdU阳性细胞百分比分别为(50.67±1.53)%，(62.00±3.00)%，(63.67±2.08)%，均高于对照组(40.67±3.06)%，差异有显著性意义(P < 0.05)。上述结果表明，LECs-EXO可增强施万细胞的增殖能力，且这种促增殖能力具有浓度依赖性，当LECs-EXO为50 μg/mL时施万细胞的增殖能力显著增强，见图2。后续动物实验以此浓度继续研究LECs-EXO对周围神经损伤后轴突再生的影响。
图3｜淋巴管内皮细胞来源外泌体(LECs-EXO)在坐骨神经中分布及对坐骨神经损伤后腓肠肌萎缩和神经修复的影响
DiO标记LECs-EXO被用于研究EXO在坐骨神经内分布情况，荧光图像示：术后28 d坐骨神经切片中可见均匀分布绿色荧光，表明LECs-EXO有良好的神经相容性，且能长期存在于坐骨神经中。LECs-EXO治疗组肌肉湿质量比(0.71±0.03)显著高于周围神经损伤组(0.53±0.04)，差异有显著性意义(P < 0.05)，表明LECs-EXO可抑制坐骨神经损伤后腓肠肌萎缩。坐骨神经苏木精-伊红染色及Masson染色结果显示，LECs-EXO治疗组坐骨神经轴突更加致密，分布均匀且有序；周围神经损伤组坐骨神经轴突排列紊乱无序且可见大量空泡状变性，见图3。
图4｜淋巴管内皮细胞来源外泌体(LECs-EXO)对坐骨神经损伤后轴突再生和再髓鞘化的影响
坐骨神经免疫荧光双重染色示：LECs-EXO治疗组NF200及S100β荧光强度(NF200：232 964±31 566；S100β：142 763±21 834)均显著高于周围神经损伤组(NF200：124 809±10 455；S100β：66 461±10 074)，差异有显著性意义(P < 0.05)，表明LECs-EXO在周围神经损伤后可促进施万细胞增殖及轴突再生，见图4。