1.1 设计 材料的制备与表征，体外细胞实验，随机分组动物实验。
1.2 时间及地点 实验于2024年6月至2025年1月在贵州医科大学组织工程与干细胞实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 实验选用24只健康雄性C57小鼠，6-8周龄，体质量20-30 g，购自天勤(长沙)生物技术有限公司，许可证号：SCXK(湘)2024-0021。小鼠饲养于贵州医科大学北京路校区的清洁级动物房，环境条件为：12 h光照/黑暗循环，温度22 ℃，湿度50%，提供充足饲料和饮用水，并维持SPF级标准。实验前小鼠适应喂养1周。动物实验已获贵州医科大学伦理委员会批准(伦理审批号：2403647)。
1.3.2 实验材料与试剂 聚己内酯(相对分子质量80 000)、聚乙二醇(相对分子质量30 000)、聚乙烯醇(相对分子质量70 000)、六氟异丙醇及红景天苷(纯度99%)(上海麦克林)；脐静脉内皮细胞与小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系RAW264.7(武汉普诺赛)；高糖DMEM培养基、青霉素-链霉素混合液、胎牛血清及胰蛋白酶-EDTA消化液(美国Gibco)；Live/Dead试剂盒、Matrix-Gel™基质胶、一氧化氮检测试剂盒(上海碧云天)；脂多糖(北京索莱宝)；CCK-8试剂(广州美伦)；EdU试剂盒(上海雅酶)；结晶紫染色液(北京索莱宝)；血管内皮生长因子兔一抗和山羊抗兔IgG荧光二抗(杭州华安)；DAPI、抗荧光衰减封固剂、2.5%戊二醛固定液、封闭山羊血清(北京索莱宝)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和SYBR试剂盒(广州信天翁)；改良Masson三色染色液和苏木精染液(美国Sigma)；伊红染液(合肥博美)；CD206、血管内皮生长因子免疫组化一抗(美国SantaCruz)；二抗鼠抗、兔抗(武汉塞维尔)，实验中采用的仪器为倒置免疫荧光显微镜(日本尼康)。
1.3.3 实验仪器 静电纺丝机(北京永康)；扫描电镜(德国ZEISS)；接触角测试仪(德国Lauda Scientific)；傅里叶变换红外光谱仪及紫外分光光度计(美国 Thermo Fisher Scientific)；倒置免疫荧光显微镜(日本尼康)；正置免疫荧光显微镜(德国蔡司)；全景扫描仪(广州光影)；CO2培养箱(美国赛默飞)；石蜡包埋机及石蜡切片机(德国Leica)；冰冻切片机(美国 Thermo Fisher)；超纯水过滤系统(韩国Neolab)；酶标仪(美国BioTek)；万能力学测试仪(上海倾技仪器仪表科技有限公司)。
1.4 方法
1.4.1 静电纺丝膜的制备 将聚己内酯溶于六氟异丙醇中配制100 g/L的聚己内酯溶液；将聚乙二醇溶于去离子水配制200 g/L的聚乙二醇溶液，向1 mL聚乙二醇溶液中分别加入不同质量的红景天苷，使红景天苷的质量浓度分别为12，25，50，100，200 µg/mL；将聚乙烯醇溶于去离子水中配制70 g/L的聚乙烯醇溶液。采用连续3步静电纺丝法制备聚己内酯-聚乙二醇/红景天苷-聚乙烯醇静电纺丝膜(记为PCL-PEG/Sal-PVA静电纺丝膜)：①外层膜使用聚己内酯溶液，在10 kV电压、20 cm喷射距离下纺丝2 h；②中间层膜使用含红景天苷的聚乙二醇溶液，在13 kV电压、10 cm喷射距离下纺丝10 h；③内层膜使用聚乙烯醇溶液，在8 kV电压、15 cm喷射距离下纺丝2 h。纺丝完成后将静电纺丝膜置于-40 ℃真空冷冻干燥机中过夜处理，在60 ℃
烘箱中干燥1 h以去除残留溶剂和水分，存放在干燥容器中备用。同理制备不含红景天苷的聚己内酯-聚乙二醇/红景天苷-聚乙烯醇静电纺丝膜(记为PCL-PEG-PVA静电纺丝膜)。在使用前通过紫外灯照射30 min和体积分数70%乙醇浸泡30 min进行消毒处理。
1.4.2 筛选载药量最佳的静电纺丝膜
条件培养基的制备：采用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养RAW264.7细胞，细胞浓度为1×109 L-1，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养至对数期。弃去原培养基，加入含1 μg/mL脂多糖的新鲜DMEM培养基继续孵育24 h以诱导炎症反应[14]。诱导完成后，在4 ℃下4 000 r/min离心10 min去除细胞碎片，保留无细胞上清液，将细胞上清液与含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基按3∶8体积比混合，作为炎症刺激培养基[15]。
CCK-8实验检测细胞活力：将人脐静脉内皮细胞接种于6孔板中，加入条件培养基，细胞密度为2×10⁵/孔，观察细胞贴壁后(约2 h)，将PCL-PEG-PVA静电纺丝膜与含不同质量浓度红景天苷的PCL-PEG/Sal-PVA静电纺丝膜裁剪为6 cm²后加入6孔板中，分别与人脐静脉内皮细胞共培养，以仅加入条件培养基培养的细胞作为对照。培养3 d后去除悬浮在条件培养基中的膜，加入含体积分数10%CCK-8工作液的DMEM培养基继续孵育2 h，在450 nm波长处使用酶标仪测定吸光度(A)值，计算相对细胞活力。根据细胞活力结果选择含100 μg/mL红景天苷的PCL-PEG/Sal-PVA静电纺丝膜进行后续实验。
1.4.3 静电纺丝膜的材料学表征
扫描电镜观察：将直径8 mm的PCL-PEG/Sal-PVA静电纺丝膜固定在导电胶上，经Quorum SC7620溅射仪喷金(电流10 mA，45 s)，在3 kV下进行扫描电镜观察并拍照，通过Image J软件随机选取纤维计算直径分布。
亲水性测试：将去离子水分别滴加至PCL-PEG-PVA、PCL-PEG/Sal-PVA静电纺丝膜内层聚乙烯醇表面，膜的尺寸为2 cm×2 cm，捕捉水滴沉降后的图像，测量并记录水滴5 s时与膜之间的水接触角，评估膜的亲水性。
膜成分检测：干燥环境下，用ATR附件连接光谱仪先扫描空气背景，再将PCL-PEG/Sal-PVA静电纺丝膜贴合ATR晶体采集傅里叶变换红外光谱，分辨率4 cm-1，扫描32次，波数范围400-4 000 cm-1。
拉伸实验：将PCL-PEG-PVA、PCL-PEG/Sal-PVA静电纺丝膜分别裁剪成10 mm×10 mm×0.2 mm尺寸，采用力学测试仪进行拉伸实验，设定有效拉伸长度为10 mm，使用100 N传感器，拉伸速度为10 mm/min，记录实验数据并绘制力-位移关系图，计算各组膜的弹性模量。
红景天苷释放检测：将尺寸3 cm×3 cm的PCL-PEG/Sal-PVA静电纺丝膜置于10 mL PBS中，放入恒温摇床(37 ℃、100 r/min)中孵育。按照指定时间间隔(0.5，1，2，4，6，8，10，14，18，26，40，60 h)提取并补充等量的PBS，收集的溶液保存于-20 ℃环境中，使用紫外分光光度计测定吸光度值，根据标准曲线计算各时间点的红景天苷浓度，计算累计释放率。
1.4.4 静电纺丝膜的生物相容性
细胞黏附实验：将PCL-PEG-PVA、PCL-PEG/Sal-PVA静电纺丝膜置于48孔板底部，将第3代人脐静脉内皮细胞分别接种于两组膜的内层聚乙烯醇上，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，细胞密度为3×10⁴/孔。培养24 h后，2.5%戊二醛固定过夜，经分级乙醇脱水，使用扫描电镜观察细胞在膜上的黏附情况。
活死染色：将第3代人脐静脉内皮细胞接种于6孔板中，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，细胞密度为5×10⁴/孔，观察贴壁后分别与PCL-PEG-PVA、PCL-PEG/Sal-PVA静电纺丝膜共培养，以单独培养的细胞为对照。培养5 d后用PBS洗涤2次，加入活死细胞染色试剂避光孵育15 min，使用倒置荧光显微镜观察并拍照，通过Image J软件分析活细胞与死细胞数量，计算细胞存活率。
1.4.5 炎症微环境中静电纺丝膜对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移与成管能力的影响EdU增殖实验：将第3代人脐静脉内皮细胞接种于6孔板中，加入3 mL条件培养基，细胞密度为5×10⁵/孔，观察细胞贴壁后分别与PCL-PEG-PVA、PCL-PEG/Sal-PVA静电纺丝膜共培养，以仅加入条件培养基培养的细胞作为对照。培养48 h后，加入EdU工作液孵育2 h，细胞固定后加入Click反应液室温避光孵育30 min，用PBS清洗3次后进行细胞核染色，使用荧光显微镜观察EdU标记的细胞，通过Image J软件统计EdU标记细胞阳性率。
Transwell迁移实验：将第3代人脐静脉内皮细胞用300 μL条件培养基重悬，以4×10⁴/孔的密度接种于24孔板的Transwell小室上层，并于Transwell小室下层分别加入PCL-PEG-PVA、PCL-PEG/Sal-PVA静电纺丝膜，同时小室下层加600 μL含体积分数1%胎牛血清的条件培养基，以Transwell小室下层仅加600 μL含体积分数1%胎牛血清的条件培养基组别为对照。培养24 h后用40 g/L多聚甲醛固定，结晶紫染色10 min，去除未迁移细胞后拍照，通过Image J软件统计迁移细胞数量。
体外血管生成实验：将第3代人脐静脉内皮细胞接种于6孔板中，加入3 mL条件培养基，细胞密度为5×10⁵/孔，观察细胞贴壁后分别加入PCL-PEG-PVA、PCL-PEG/Sal-PVA静电纺丝膜，以仅加入条件培养基培养的细胞作为对照。培养48 h后，将基质胶与无血清高糖DMEM培养基按体积比1∶1混合后加入48孔板中，待基质胶凝固后分别接种上述3组细胞，细胞密度为1×10⁵/孔，培养4 h后在倒置显微镜下观察管状结构，通过Image J软件统计成管数、分支数和节点数。
免疫荧光染色：将第3代人脐静脉内皮细胞接种于12孔板爬片上，加入2 mL条件培养基，细胞密度为2×10⁵/孔，观察细胞贴壁后分别加入PCL-PEG-PVA、PCL-PEG/Sal-PVA静电纺丝膜，以仅加入条件培养基培养的细胞作为对照。培养48 h后，细胞经固定、通透和封闭处理后，滴加血管内皮生长因子一抗于4 ℃过夜，用PBS清洗，滴加二抗(1∶500)室温孵育1 h，DAPI染色10 min，用PBS清洗后封固，用正置荧光显微镜观察并拍照，通过Image J软件统计血管内皮生长子免疫荧光强度。
1.4.6 炎症微环境中静电纺丝膜的抗炎能力
实验分组与干预：将第3代RAW264.7细胞接种于6孔板中，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，细胞密度为1.5×10⁶/孔，观察细胞贴壁后加入1 µg/mL脂多糖培养24 h诱导炎症反应，分别加入PCL-PEG-PVA、PCL-PEG/Sal-PVA静电纺丝膜，以仅加入1 µg/mL脂多糖培养的细胞为对照。
一氧化氮水平检测：同时设置未加入脂多糖的正常培养细胞作为阴性对照。继续培养24 h后，在4 ℃下2 500 r/min离心10 min去除沉淀，收集上清液加入试剂1和2反应，使用酶标仪在540 nm波长处测量吸光度值，根据标准曲线计算一氧化氮水平。
qPCR检测：继续培养24 h后，提取细胞总RNA并反转录为cDNA，使用SYBR Green法进行实时荧光定量PCR反应，反应体系为20 μL：包括10 μL qPCR SYBR Green Fast Mix、0.4 μL 正向引物(10 μmol/L)、0.4 μL 反向引物(10 μmol/L)、1 μL cDNA和8.2 μL ddH2O。通过2-ΔΔCt 方法计算目标基因的相对表达量，以GAPDH作为内参进行标准化。引物序列见表1。
1.4.7 静电纺丝膜对糖尿病小鼠皮肤创面的修复作用
糖尿病小鼠皮肤创面模型的建立与分组干预：取24只C57小鼠，给予高脂高糖饲料(长沙天勤，脂肪60%、碳水化合物20%、蛋白质20%)喂养2周，随后连续2 d腹腔注射链脲佐菌素100 mg/kg，每天1次，以诱导糖尿病模型，通过尾静脉采血检测血糖水平[16]。注射后连续3周监测血糖，空腹血糖>16.8 mmol/L的小鼠确诊为糖尿病。确认糖尿病造模成功后异氟烷吸入麻醉小鼠，局部注射利多卡因后剃除背部毛发并制造1个直径8 mm的圆形全层皮肤缺损创面，随机分为3组干预：空白组(n=8)仅用无菌生理盐水冲洗创面，对照组(n=8)植入无菌PCL-PEG-PCL静电纺丝膜并用生理盐水冲洗创面，实验组(n=8)植入PCL-PEG/Sal-PVA复合膜静电纺丝膜并用生理盐水冲洗创面，膜内层沾水后具有一定黏附性，无需固定。术后第0，4，7，14天，拍摄创面并用软件测量面积，计算创面愈合率。
创面愈合率=(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积×100%
苏木精-伊红染色观察创面皮肤形态结构：术后第7，14天，每组每个时间点取4只小鼠，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后沿着创面新生皮肤周围一圈取材，尽量不损伤新生的皮肤与痂皮，在满足实验要求同时也遵循伦理要求。组织样本经40 g/L多聚甲醛固定48 h，全自动脱水机脱水、二甲苯透明化55 min后石蜡包埋2.5 h，切成5 μm厚切片并在60 ℃下烤片3 h；切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水、苏木精染色8 min、盐酸乙醇分化3 s、伊红染色3 min后，中性树胶封固，使用全自动数字扫描仪拍照前，切片需经梯度乙醇脱水和透明剂处理，通过Image J软件测量每张切片4个垂直视野中的血管数量取平均值，定量分析新上皮宽度。
Masson染色观察创面胶原沉积：术后第7，14天，从石蜡包埋的组织块中切取5 μm厚切片，在60 ℃烤箱中烤片2 h，依次用二甲苯脱蜡和梯度乙醇复水；切片经重铬酸钾溶液过夜孵育，进行苏木精分化和返蓝处理，滴加丽春红品红染色液染色10 min，最后用蒸馏水冲洗；用磷钼酸溶液处理30 s，直至胶原纤维褪色，苯胺蓝染色时间2 min，直至胶原纤维充分上色；切片依次经梯度乙醇脱水、二甲苯透明化，中性树胶封固，使用全自动数字玻片扫描仪对切片拍照，通过Image J软件在每张切片4个相互垂直的视野中测量胶原沉积量，取平均值作为最终结果。
免疫组化染色观察创面CD206、血管内皮生长因子表达：将术后第7天的创面皮肤组织样本切片浸入pH=6.0的柠檬酸盐缓冲液，在微波炉中修复20 min，冷却后用pH=7.4的PBS洗涤3次，每次5 min；置于体积分数3%H₂O₂溶液室温避光孵育25 min，以灭活内源性过氧化物酶，用PBS洗涤3次，每次5 min；用3%牛血清白蛋白封闭30 min以上，甩掉封闭液，加入抗血管内皮生长因子(1∶50)和抗CD206(1∶100)抗体于37 ℃孵育60 min，然后置于湿盒内4 ℃孵育过夜；次日滴加HRP标记的二抗室温孵育50 min，并在脱色摇床上用PBS洗涤3次，每次5 min；滴加DAB显色液，室温显色至显微镜下观察到棕黄色阳性信号，蒸馏水洗涤终止显色，苏木精染色3 min，自来水冲洗，使用苏木精分化液处理后再用自来水冲洗，苏木精返蓝液返蓝并流水冲洗；依次用体积分数75%，85%，95%乙醇和无水乙醇脱水各10 min，二甲苯透明化10 min后中性树胶封固，使用全自动数字玻片扫描仪拍照，通过Image J软件测量每张切片4个相互垂直视野中的阳性面积，取平均值。
1.5 主要观察指标 PCL-PEG/Sal-PVA静电纺丝膜的形貌、水接触角、拉伸弹性模量、药物缓释特性、生物相容性、抗炎特性以及炎症微环境下对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移、成管能力的影响；PCL-PEG/Sal-PVA静电纺丝膜修复小鼠糖尿病皮肤创面的效果。
1.6 统计学分析 所有实验数据均重复3次，使用GraphPad Prism 10.1.2软件进行统计分析，结果以x±s表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较则使用单因素方差分析(ANOVA)或双因素方差分析(Two-Way ANOVA)，并结合Tukey’s多重比较检验。P < 0.05表示差异有显著性意义。该统计方法已由贵州医科大学生物统计学专家审核。
