具有抗凝和释药双重功能的双硒聚氨酯涂层

doi:10.12307/2025.890

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
双硒：硒(Se)元素是一种非金属元素，也是人体中重要的微量元素。由2个硒原子构成的双硒键是组成物质结构的一种特殊单元，由于双硒键存在氧化还原敏感性，因而在人体中具有一定的生物反应活性，并提供一定的抗凝作用。
聚氨酯涂层：聚氨酯是一类常见的聚合物，可对多种医疗器械进行表面改性修饰，起到防腐、耐磨、生物学改性等作用。该文中提到的聚氨酯涂层主要指冠状动脉药物洗脱支架表面涂层，达到支架表面生物功能化的目的。

背景：药物洗脱支架的表面抗凝改性一直是该领域的技术难题，虽然研究者尝试开发了一些抗凝聚合物药物涂层，但由于难以协调药物释放功能导致应用失败。
目的：设计具有抗凝和释药双重功能的双硒聚氨酯涂层，表征涂层的抗凝性能与药物释放性能。
方法：采用溶液聚合法合成了3种不同单体配比(双硒化合物与聚乙二醇的摩尔比分别为0.33∶0.67，0.50∶0.50，0.67∶0.33)双硒聚氨酯，表征双硒聚氨酯的溶解性、结晶度、热性能、细胞相容性与血液相容性。采用滴涂法制备西罗莫司-双硒聚氨酯涂层，表征涂层的表面形貌、湿润性、体外抗凝性能与药物释放性能。
结果与结论：①3种不同单体配比的双硒聚氨酯均可溶于四氢呋喃、二氯甲烷和氯仿等常见的低沸溶剂，可通过喷涂或是浸涂的方法制备在器械表面；3种不同单体配比的双硒聚氨酯在20 ℃及以上呈非晶态，均具有良好的热稳定性；3种不同单体配比的双硒聚氨酯均具有良好的细胞相容性与血液相容性；②扫描电镜下可见西罗莫司-双硒聚氨酯涂层表面光滑，无明显的孔隙、裂缝和相分离；西罗莫司-双硒聚氨酯涂层呈现出疏水特征，随着聚乙二醇含量的增加，涂层的水接触角有所下降；西罗莫司-双硒聚氨酯涂层具有良好的附着力；与传统聚乳酸涂层相比，西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的长期抗凝性能更优，能够催化血液中一氧化氮分子的产生，抑制血小板的活化，并且随着硒含量的增加，涂层抑制血小板活化的能力升高；西罗莫司从含硒聚氨酯涂层中的释放呈现先快后慢的趋势，但药物暴释不明显，随着聚乙二醇含量的增加，涂层中的药物释放速率有所加快；③结果表明，在聚氨酯共聚物主链上设计双硒单元并在聚合物中构建可调亲疏水单元，可实现药物涂层的抗凝和药物释放双重功能。
https://orcid.org/0000-0002-5141-708X (赵铮)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 药物洗脱支架, 双硒键, 聚氨酯, 一氧化氮, 抗凝涂层, 药物释放, 双重功能, 工程化血管材料

Abstract: BACKGROUND: Surface anticoagulant modification of drug-eluting stents is a technical difficulty. Researchers have tried to develop some anticoagulant polymer coatings, but the application failed due to uncontrolled drug release.
OBJECTIVE: To design a diselenium contained polyurethane coatings with dual functions of anticoagulation and drug release, and to characterize the anticoagulation and drug release properties of the coating.
METHODS: Diselenium contained polyurethane with three different monomer ratios (the molar ratios of diselenyl compounds to polyethylene glycol were 0.33:0.67, 0.50:0.50, and 0.67:0.33, respectively) was synthesized by solution polymerization, and the solubility, crystallinity, thermal properties, cell compatibility, and blood compatibility of the diselenium contained polyurethane were characterized. Sirolimus-diselenium contained polyurethane coatings were prepared by drop coating, and the surface morphology, wettability, in vitro anticoagulant properties, and drug release properties of the coatings were characterized.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The three diselenium contained polyurethanes with different monomer ratios were all soluble in common low-boiling solvents such as tetrahydrofuran, dichloromethane and chloroform, and could be prepared on the surface of the device by spraying or dipping; the three diselenium contained polyurethanes with different monomer ratios were amorphous at 20 ℃ and above, and had good thermal stability; the three diselenium contained polyurethanes with different monomer ratios had good cell compatibility and blood compatibility. (2) Scanning electron microscopy showed that the surface of the sirolimus-diselenium contained polyurethane coating was smooth, without obvious pores, cracks and phase separation. The sirolimus-diselenium contained polyurethane coating exhibited hydrophobic characteristics, and the water contact angle of the coating decreased with the increase of polyethylene glycol content. The sirolimus-diselenium contained polyurethane coating had good adhesion. Compared with traditional polylactic acid coatings, the anticoagulant properties of the sirolimus-diselenium contained polyurethane coating were better. It had better long-term anticoagulant performance and could catalyze the production of nitric oxide molecules in the blood and inhibit platelet activation. With the increase of selenium content, the ability of the coating to inhibit platelet activation increased. The release of sirolimus from the selenium-containing polyurethane coating showed a trend of first fast and then slow, but the drug burst release was not obvious. With the increase of polyethylene glycol content, the drug release rate in the coating was accelerated. (3) The results show that designing a diselenide unit on the main chain of the polyurethane copolymer and constructing an adjustable hydrophilic and hydrophobic unit in the polymer can realize the dual functions of anticoagulation and drug release of the drug coating.

Key words: biomaterial, drug eluting stent, diselenium bond, polyurethane, nitric oxide, anticoagulant coating, drug release, dual function, engineered vascular material

中图分类号:

赵铮. 具有抗凝和释药双重功能的双硒聚氨酯涂层[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(2): 414-423.

Zhao Zheng. Diselenium contained polyurethane coatings with dual functions of anticoagulation and drug release[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(2): 414-423.

图/表（结果） 5

2.1 聚合物的设计、合成及表征在设计合成路线时，首先考虑了双硒键的引入方式。由于双硒键是氧化还原敏感键，在合成过程中任何与氧化还原有关的反应都可能造成双硒键引入失败[40]。因此，为保证双硒键的稳定性，选择了构建聚氨酯的加成缩合反应作为双硒键的引入方式，这种反应无氧化还原作用，并且具有很高的反应效率，充分保证了双硒键的生物活性。此外，双硒键选择构建在聚氨酯主链上而不是侧链上，从而确保了更高的硒元素引入效率。同时，考虑到药物释放的需要，选用具有酯亲和作用的长链烷基二醇作为二硒官能团的承载单体。脂肪链可以与常用疏水药物产生更强的疏水分子相互作用，避免药物的爆发释放。聚合物结构中还特意使用了短链聚乙二醇作为亲水结构单元，用以调节水在聚合物内部的渗透速率，进而精细控制药物在溶液中的扩散溶出速率。
通过将上述二醇单体与甲苯二异氰酸酯按需混合，快速构建了一系列双硒聚氨酯聚合物。双硒聚氨酯聚合物的化学结构，见图4A。通过红外光谱(图4B)和核磁共振氢谱(图4C)表征了双硒聚氨酯聚合物的化学结构。红外光谱显示，在约3 316 cm-1处观察到酰胺的拉伸振动峰，约1 598 cm-1观察到N-H的面内弯曲振动峰，及约1 534 cm-1观察到苯环碳骨架振动峰，表明甲苯二异氰酸酯与二醇单体反应生成了酰胺键。核磁共振氢谱显示，在约1.29，3.64，7.06处分别出现了长链烷基氢、聚乙二醇氢和苯环氢的特征峰，并且氢的实际积分比例与理论值基本一致，表明各单体被成功引入至聚合物结构中。为了进一步确认在双硒聚氨酯聚合物中引入了硒元素，对聚合物中的硒含量进行了测定，结果显示所测得的硒含量与理论硒含量接近，两者之比大于80%，意味着硒元素被有效引入。上述结果均证明双硒聚氨酯聚合物成功合成。另外，采用凝胶渗透色谱测定了3种双硒聚氨酯聚合物的分子质量，如表2所示，这些双硒聚氨酯聚合物的重均分子质量在25 000-40 000 Da之间，适合作为药物涂层材料使用；并且聚合物的多分散指数在3.06-3.91之间。
此外，对双硒聚氨酯聚合物的溶解性、结晶度和热性能进行了测试。溶解实验结果表明，双硒聚氨酯聚合物可溶于四氢呋喃、二氯甲烷和氯仿等常见的低沸溶剂，说明双硒聚氨酯聚合物可通过喷涂或是浸涂的方法制备在器械表面。双硒聚氨酯聚合物的X射线衍射谱图呈馒头状曲线(图4D)，表明双硒聚氨酯聚合物在20 ℃及以上呈非晶态。差示扫描量热曲线(图4E)显示，双硒聚氨酯聚合物在0-20 ℃之间有明显的吸热峰，进一步说明双硒聚氨酯聚合物在20 ℃以上呈现橡胶态，这可避免涂层在植入人体后由于升温相变引起的药物释放动力学改变。热重曲线(图4F)显示，在290 ℃以上双硒聚氨酯聚合物出现一次明显的失重，说明双硒聚氨酯聚合物发生了热分解。尽管如此，双硒聚氨酯聚合物溶剂的沸点远低于双硒聚氨酯聚合物的热分解温度，这保证了双硒聚氨酯聚合物涂层在生产烘干过程中的稳定性。

植入类材料的生物安全性非常重要，因此，在应用前首先对双硒聚氨酯聚合物进行了生物相容性测试。图5展示了双硒聚氨酯聚合物的生物相容性测试结果，双硒聚氨酯聚合物组与聚乳酸组的细胞活力接近，血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的存活率均在80%以上(图5A)，并且在AO/EB染色图中仅观察到少量自然凋亡细胞(图5B)，说明双硒聚氨酯聚合物具有良好的细胞相容性。此外，双硒聚氨酯聚合物组的细胞活力随着聚乙二醇结构单元的增加而升高，说明聚乙二醇的引入可以改善双硒聚氨酯聚合物的生物相容性。溶血实验结果显示，阳性对照组溶血现象明显，血细胞几乎完全破裂，而所有双硒聚氨酯聚合物组血细胞形态与聚乳酸组一致(图5C)，溶血率均小于5%(图5D)，说明双硒聚氨酯聚合物没有溶血风险。

2.2 西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的制备与表征以二氯甲烷为溶剂，采用滴涂法在不锈钢表面制备了西罗莫司-双硒聚氨酯涂层。同时，用扫描电镜观察了西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的表面形貌，如图6A所示。扫描电镜下可见西罗莫司-双硒聚氨酯涂层表面光滑，无明显的孔隙、裂缝和相分离，表明药物聚合物涂层成功制备。此外，采用能谱仪观察了西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的元素分布(图6A)，Se元素和O元素在涂层中分布均匀，这为抗凝性能的稳定提供了一定的保障。进一步对元素测试结果进行了量化分析，如图6B所示，O/Se元素值随着硒单元的增加而减小，这与西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的制备预期相符。润湿实验结果表明，西罗莫司-双硒聚氨酯涂层改性后的不锈钢表面水接触角显著上升，表面呈现出疏水特征(图6C)，疏水性的增强有益于加强与涂层中疏水药物的相互作用，减少药物在前期的爆释现象；并且随着聚乙二醇含量的增加，聚合物涂层表面水接触角有所下降，这意味着可以通过调节聚乙二醇的含量调控聚合物涂层的疏水性，进而调整药物释放速率。实验过程中也通过划格实验测试了各西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的附着力，其在不锈钢表面的附着力达到1级，说明涂层的附着力良好，可有效防止涂层在植入后的脱落现象。

2.3 西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的体外抗凝性能西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的抗凝功能主要与双硒键催化产生的一氧化氮有关，因此测试了涂层在模拟液体中的一氧化氮催化能力。图7A展示了Griess法测得的一氧化氮吸光度，相比于西罗莫司-聚乳酸涂层，各西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的吸光度显著增强，意味着在西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的催化作用下一氧化氮在加速生成。对于各西罗莫司-双硒聚氨酯涂层，在浸泡前3 d观察到吸光度值的小幅上升，这可能与浸泡初期涂层的润湿过程有关；然后吸光度平稳下降，所有西罗莫司-双硒聚氨酯涂层均能持续催化一氧化氮供体分解至少30 d，这为抗凝性能的持续发挥提供了一定保证。
随着浸泡时间的延长，西罗莫司-双硒聚氨酯涂层中的硒元素含量逐渐下降(图7B)，说明西罗莫司-双硒聚氨酯涂层可能发生了降解。并且亲水性聚乙二醇单元比例越高，涂层中的硒元素损失越快，降解速度越快，这种降解在药物洗脱支架上被认为是有利的，可充分缓解支架植入后的内皮化延迟现象。浸泡30 d后，西罗莫司-双硒聚氨酯涂层中的剩余硒含量大于50%，这也保证了材料植入早期的抗凝可持续性。
通过血小板黏附实验进一步评估西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的血栓形成风险[38]。对于传统西罗莫司-聚乳酸涂层，在其表面观察到大量黏附的活化血小板，统计黏附血小板数量达到2.1×104/mm2，说明血栓形成风险较高；各西罗莫司-双硒聚氨酯涂层表面的血小板呈现未激活的扁圆形状态，黏附血小板数量低于200/mm2，并且随着涂层中硒含量的增加而减少，见图7C，D，表明血小板的黏附和激活被抑制。进一步通过凝血时间实验评价西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的抗凝性能[41]。如图7E所示，西罗莫司-聚乳酸涂层组凝血时间与对照组比较无显著差异，说明西罗莫司-聚乳酸涂层几乎没有抗凝作用；各西罗莫司-双硒聚氨酯涂层组活化部分凝血活酶时间值升高，说明其抗凝作用显著。另外，西罗莫司-双硒聚氨酯涂层组活化部分凝血活酶时间值的升高与一氧化氮的释放量具有正相关性，说明一氧化氮发挥了抗凝作用。上述结果表明，西罗莫司-双硒聚氨酯涂层可通过催化一氧化氮释放的方式发挥良好的局部抗凝作用，其作为涂层有望降低药物洗脱支架植入后的血栓形成风险。

2.4 西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的药物释放性能图8A为西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的药物释放曲线。3种西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的药物释放行为均表现出前期药物释放快、后期释放慢的特点，但是前期药物的爆释现象并不明显，这可能与双硒聚氨酯聚合物长饱和脂肪链与药物之间的相互作用有关；此外，3种涂层的释放速率展现出明显差异，即随着聚乙二醇单元的增加，涂层的药物释放速率有所加快。同时观察了药物释放过程中涂层的表面形态变化(图8B)，浸泡14 d后，各涂层表面出现了一些微米级的孔洞，这些孔洞随着浸泡时间的延长有所增多，表明涂层可能发生了本体降解，这些降解孔的数量与双硒聚氨酯聚合物中聚乙二醇含量呈现一定的正相关性，说明聚氨酯中引入聚乙二醇单元可以加速聚合物的降解。上述结果表明，西罗莫司从双硒聚氨酯涂层中的释放受药物渗透压和涂层降解双重控制，并与涂层中的聚乙二醇含量直接相关，通过调节双硒聚氨酯聚合物中聚乙二醇单元的含量可以精确调控涂层的药物释放速率。
如图8C所示，各西罗莫司-双硒聚氨酯涂层浸提液组血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的增殖均被有效抑制，表明从涂层中释放的西罗莫司发挥了有效的抗增殖作用，有望在体内发挥抗再狭窄功能[42]。

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引言

药物洗脱支架是冠状动脉疾病治疗史上的重要里程碑[1-3]，截至2024年，药物洗脱支架已成为该治疗领域最常用的植入装置，全球每年在药物洗脱支架上的支出已达百亿美元[4]。然而，现有药物洗脱支架表面药物涂层容易诱发血栓，使患者不得不长时间服用高剂量双抗，由此造成的出血等不良事件给患者带来了巨大风险[5-7]。以往的研究尝试采用表面抗凝接枝改善药物涂层的抗血栓性能，但接枝抗凝物容易被血流冲刷失效[8-10]。后来研究者将目光转向具有抗凝功能的材料上，开始将抗凝物引入到聚合物分子中并将其作为释药材料使用，但这些材料作为药物洗脱支架涂层并未实现持久抗凝，反而造成释药紊乱。目前，开发具有稳定释药和抗凝功能的聚合物依旧是该领域的研究难点[11-13]。
近些年，具有抗凝功能的双硒键受到较多关注。双硒键可通过自身氧化还原作用催化血液中一氧化氮分子产生，使周围血小板的环氧合酶乙酰化，进而抑制血小板聚集。由于一氧化氮的抗凝作用具有微量高效的特点，因此双硒键展现出显著的抗凝作用[14-16]。除了抗凝功能显著之外，双硒键在材料制备过程中也具有显著优势：由于双硒键结构体积较小，不占据过多分子空间，可以减少结构改变对药物释放的影响；双硒键主要对氧化还原反应敏感，因而可以采用常规非氧化还原反应将双硒键有效率地引入到聚合物中，改性较为方便。
聚氨酯是一种成本低廉、合成方便的聚合物材料，可通过二异氰酸酯与二醇或二胺在溶剂和无溶剂的环境下发生加成缩聚反应快速得到[17-19]。由于聚氨酯结构可调的特点，在人工血管[20-22]、心脏瓣膜[23-25]、组织工程领域有着广泛的应用[26-28]。聚氨酯较快的聚合速率可以较好地与双硒键的氧化还原性互补，减少双硒键在生产过程中的损耗[29-31]。因此，该文设计了一类含有双硒键的聚氨酯聚合物，以实现药物洗脱支架表面药物涂层的抗凝和药物释放双重功能。如图1所示，聚氨酯由聚氨酯连接单元、双硒长脂肪单元及聚乙二醇亲疏水调节单元构成，通过将双硒键设计在聚氨酯主链中充分保证双硒键的引入效率，从而使聚氨酯可持续地发挥抗凝功能；在聚氨酯共聚物中设计疏水脂肪结构，以增加与疏水药物的分子间相互作用，避免负载药物的快速释放；同时，使用亲水性聚乙二醇单元精细调节聚合物的整体疏水性，增大水分子在涂层中的渗透速率，从而精准控制药物从涂层中的溶出速率。
此次研究采用溶液聚合法合成了3种不同单体配比的双硒聚氨酯，对其进行详细的物理化学表征；将合成的双硒聚氨酯与西罗莫司混合制备药物聚合物涂层，通过一氧化氮催化实验、血小板黏附实验及凝血时间实验对涂层的抗凝性能进行评价，通过药物释放实验和细胞增殖实验考察涂层的药物释放特性，进而为抗凝聚合物涂层的开发提供设计思路和实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外观察实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年6月至2024年5月在上海瑛泰医疗器械股份有限公司完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞人血管内皮细胞和血管平滑肌细胞(煊雅生物科技有限公司)。
1.3.2 化学品和试剂硒粉(纯度> 99.9%)、11-溴-1-十一醇(纯度> 98%)、十二烷基三甲基溴化铵(纯度> 99.9%)及2，4-甲苯二异氰酸酯(纯度> 98%)购自上海麦克林生化科技有限公司；硼氢化钠(NaBH4)、氢氧化钠(NaOH)、二氯甲烷、甲醇、乙醇、无水N，N′-二甲基甲酰胺、氯仿和50%戊二醛水溶液购自天津达茂化学试剂有限公司；聚乙二醇400购自天津光富精细化工研究所；西罗莫司购自福建科瑞药业有限公司；聚乳酸购自济南岱罡生物工程有限公司；PBS(pH=7.4)、生理盐水、CCK-8细胞计数试剂盒、AO/EB染色试剂盒购自北京索来宝科技有限公司；凝血试剂盒购自武汉中泰生物科技有限公司；DMEM培养基、青霉素及链霉素购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司。
1.3.3 主要仪器场发射扫描电镜(SEM，SU8220，日本HITACHI)；能谱仪(SU8220，日本HITACHI)；水接触角测量系统(FT-CAMB3，中国苏州三飞堂测试设备有限公司)；电感耦合等离子体发射光谱仪(AVIO 500，美国PerkinElmer)；CO2培养箱中(250i Heracell VIOS，美国Thermofisher)；荧光倒置显微镜(Axio Observer A1，德国ZEISS)；酶标仪(Epoch 2，美国BioTek)；凝血仪(XN06-Ⅱ，中国武汉京川诊断技术有限公司)；质谱仪(Q-Exactive，美国赛默飞)；核磁共振仪(Bruker AVANCE Ⅲ 500，瑞士布鲁克)；傅里叶变换红外光谱仪(MPA，德国布鲁克)；X射线衍射仪(SmartLab 9 KW，日本Rigaku)。
1.4 方法

1.4.1 双-(1-羟基-十一烷基)双硒化物的合成合成路线如图2所示。将2 g硒粉和100 mg 十二烷基三甲基溴化铵分散在15 mL去离子水中，在氮气保护下加入0.125 g NaBH4和2 g NaOH形成混悬液。混悬液在90 ℃下搅拌，搅拌速率400 r/min。半小时后，将6.28 g 1-溴-1-十一醇溶于50 mL 四氢呋喃并倒入混悬液中，在50 ℃下搅拌过夜，搅拌速率400 r/min。降温后分离油相，柱层析纯化产物。产物真空干燥(50 ℃)过夜，得到黄色粉末(产率58.2%)[32]。

采用质谱仪、核磁共振仪和傅里叶变换红外光谱仪对所合成的黄色粉末进行质谱、核磁共振氢谱、核磁共振硒谱及红外光谱表征。①质谱：m/z 503.24[M+H]+峰簇，m/z 525.27[M+Na]+峰簇；②核磁共振氢谱(500 MHz，CDCl3)，δ：3.62-3.65(4H，CH2OH)，2.89-2.92(4H，CH2Se)，1.71-1.74(4H，CH2CH2OH)，1.55-1.58 (4H，CH2CH2Se)，1.28[28H，(CH2)9CH2CH2Se]；③核磁共振硒谱(500 MHz，CDCl3)，δ∶308；④红外光谱：3 300 cm-1为O-H的伸缩震动峰，2 900 cm-1为饱和碳氢的伸缩震动峰，1 400 cm-1为饱和碳链骨架的震动峰。

1.4.2 双硒聚氨酯聚合物的合成及表征合成路线如图3所示。将双-(1-羟基-十一烷基)双硒化物、聚乙二醇400和10 mL N，N′-二甲基甲酰胺加入三口烧瓶中，投料量如表1所示，氮气脱气半小时。然后将1.2 mmol甲苯二异氰酸酯加入至烧瓶中，升温至80 ℃搅拌4 h。产物在2 000 Da透析袋中透析7 d后，旋蒸得到橙色固体产物双硒聚氨酯聚合物。
采用核磁共振仪和傅里叶变换红外光谱仪对所合成的双硒聚氨酯聚合物(3种配比)进行结构表征。①核磁共振氢谱(500 MHz，CDCl3 δ=7.62)：δ=1.21-1.87[(CH2)9CH2Se]，δ=1.97-2.38(甲苯)，δ=2.90[COOCH2(CH2)9CH2Se]，δ=3.30-3.80[COOCH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2OCO]，δ=4.13(CH2Se)，δ=4.18-4.38[COOCH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2OCO]，δ=5.33(二氯甲烷)，δ=6.89-7.52(苯环氢)。②红外光谱：3 316 cm-1为N-H的伸缩振动峰，2 918 cm-1和2 848 cm-1为饱和CH2伸缩振动峰，1 710 cm-1为C=O的伸缩振动峰，1 598 cm-1为N-H面内弯曲振动峰，1 534 cm-1为苯环碳骨架振动峰，1 426 cm-1为CH2的面内弯曲振动峰，1 223 cm-1处和1 063 cm-1为C-O-C的伸缩振动峰，720 cm-1处为饱和CH2面内变形振动峰。
此外，采用凝胶渗透色谱测定双硒聚氨酯聚合物(3种配比)的分子质量，计算多分散指数(重均分子质量与数均分子质量的比值)；采用电感耦合等离子体发射光谱检测双硒聚氨酯聚合物(3种配比)的硒元素含量；通过X射线衍射仪在20 ℃下测定双硒聚氨酯聚合物(3种配比)的结晶性；通过差示扫描量热法和热重分析法对双硒聚氨酯聚合物(3种配比)的热性能进行表征。
1.4.3 西罗莫司-双硒聚氨酯涂层及对照样品的制备与表征采用滴涂法制备西罗莫司-双硒聚氨酯涂层。将0.5 g西罗莫司和1 g双硒聚氨酯聚合物(3种配比)共同溶解在3 mL二氯甲烷中，将混合溶液滴在不锈钢衬底(1 cm×1 cm)上，室温干燥48 h后得到西罗莫司-双硒聚氨酯涂层。另外，将0.5 g西罗莫司和1 g 聚乳酸共同溶解在3 mL二氯甲烷中，将该混合溶液滴在另外的不锈钢衬底(1 cm×1 cm)上，室温干燥48 h后，得到对照样品西罗莫斯-聚乳酸涂层。同理，制备不含药物的聚乳酸涂层、双硒聚氨酯涂层(3种配比)，用于评估双硒聚氨酯聚合物的细胞相容性与血液相容性。
采用场发射扫描电镜对西罗莫司-双硒聚氨酯涂层(3种配比)进行表面形貌表征；使用能谱仪分析西罗莫司-双硒聚氨酯涂层(3种配比)的C、O、Se元素含量；使用水接触角测量评估不锈钢及西罗莫司-双硒聚氨酯涂层(3种配比)的润湿性；根据ISO2409标准，用画格刀评定西罗莫司-双硒聚氨酯涂层(3种配比)的粘接能力[33]。
1.4.4 西罗莫司-双硒聚氨酯涂层中的西罗莫司/一氧化氮释放将西罗莫司-聚乳酸涂层、西罗莫司-双硒聚氨酯涂层(3种配比)分别浸入10 mL 10%甲醇/Hanks’溶液中(含50 μmol/L一氧化氮供体)，第0，2，4，7，14及28天，采用Griess法测定一氧化氮释放量，同时采用高效液相色谱检测西罗莫司残留量。西罗莫司的累积释放率按公式(1)计算：
CRt=(OCt-UCt)/OCt×100% (1)
公式中，CRt为被测样品的西罗莫司累积释放率，OCt为被测样品西罗莫司的原始含量，UCt为被测样品西罗莫司的最终含量。
此外，第0，7，15，21及30天，通过电感耦合等离子体发射光谱仪测定硒元素残留量[34]。第0，14，28天，部分西罗莫司-双硒聚氨酯涂层(3种配比)样品被取出并烘干，采用扫描电镜观察其表面形貌。
1.4.5 涂层的体外细胞相容性
细胞培养：将血管内皮细胞和血管平滑肌细胞分别接种在含有体积分数9%胎牛血清、100 mg/mL链霉素和100 U/mL青霉素的高糖DMEM培养基中，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养至对数分裂期[35]。
细胞毒性和凋亡：采用CCK-8法测试双硒聚氨酯涂层与西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的细胞毒性。在37 ℃下用高糖培养基浸提聚乳酸涂层、西罗莫司-聚乳酸涂层、双硒聚氨酯涂层、西罗莫司-双硒聚氨酯涂层样品24 h，样品表面积/DMEM培养基=6 cm2/mL。将对数期血管内皮细胞和血管平滑肌细胞分别接种到96孔板中，加入含有体积分数9%胎牛血清、100 mg/mL链霉素和100 U/mL青霉素的高糖DMEM培养基，细胞密度为2×104/cm2，孵育24 h后分组干预：对照组不进行任何处理，实验组分别加入聚乳酸涂层、双硒聚氨酯涂层(3种配比)以及西罗莫司-双硒聚氨酯涂层(3种配比)，继续培养24 h，使用酶标仪测定450 nm处的吸光度值，通过式(2)计算细胞存活率。
同时，采用AO/EB染色试剂对双硒聚氨酯涂层组(3种配比)细胞进行染色，通过荧光倒置显微镜进一步评估细胞凋亡情况[36]。
CVt=(CAt-CAd)/CAd×100% (2)
公式中，CVt为被测样品的细胞存活率，CAt为被测样品的吸光度值，CAd为DMEM培养基的吸光度值。
1.4.6 涂层的体外血液相容性全血样本来自1名健康志愿者，该志愿者对实验知情同意并签署了知情同意书。实验已获得大连理工大学生物与医学伦理委员会批准(DLUTSCE20220927-01)。
溶血实验：聚乳酸涂层与双硒聚氨酯涂层(3种配比)样品用37 ℃生理盐水浸提24 h，样品表面积/生理盐水=6 cm2/mL。按全血∶生理盐水=4∶5体积比稀释全血。取40 μL稀释后的血液加入2 mL提取液孵育2 h，2 500 r/min
离心10 min后，使用酶标仪在540 nm处测量上清液的吸光度值。溶血率计算方法见公式(3)。
HRt=(HAt-HAn)/(HAp-HAn)×100% (3)
公式中，HRt为被测样品的溶血率，HAt为被测样品的吸光度值，HAn为阴性对照(生理盐水)的吸光度值，HAp为阳性对照(去离子水)的吸光度值[37]。
血小板黏附：取全血，1 500 r/min离心15 min后分离富血小板血浆上清。将西罗莫司-聚乳酸涂层与西罗莫司-双硒聚氨酯涂层(3种配比)样品在37 ℃下用生理盐水浸润2 h。在样品表面涂覆60 μL富血小板血浆，孵育2 h后用生理盐水冲洗样品，戊二醛固定，乙醇水溶液梯度脱水，采用扫描电镜观察样品表面的血小板形态和数量[38]。
凝血时间：取全血，3 000 r/min离心15 min后分离贫血小板血浆上清。将西罗莫司-聚乳酸涂层与西罗莫司-双硒聚氨酯涂层(3种配比)样品分别浸泡在300 μL贫血小板血浆溶液中，在37 ℃孵育15 min，使用凝血仪检测活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间和凝血酶时间[39]。
1.5 主要观察指标西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的药物释放性能、抗血栓性能及生物安全性。
1.6 统计学分析实验数据以x±s表示，由Origin 9.1进行作图处理。对于样本数量大于5的测试数据，采用单因素方差分析确定组间统计学意义。该文统计学方法已经大连理工大学生物统计学专家审核。

讨论

药物洗脱支架表面抗凝改性一直以来是该领域的技术难点，尽管目前已经发现很多具有抗凝功能的化合物，但这些抗凝化合物的修饰常由于无法协调药物释放而导致改性失败。为协调涂层的药物释放性能和持续抗凝性能，此次研究设计了一类结构可调的双硒抗凝聚氨酯共聚物药物载体，通过在聚氨酯主链上设计双硒单元使其具备一氧化氮催化功能，从而提供持续有效的抗凝效果；另外，通过构建可调亲疏水单元，使药物从涂层中的溶出速率得到精确控制。
此次研究采用溶液聚合法制备了3种双硒聚氨酯聚合物，通过核磁共振氢谱及红外光谱证实了合成双硒聚氨酯聚合物的骨架结构，并通过元素分析验证了硒元素的引入效率，证明了采用聚氨酯合成路线引入双硒基团具备可行性。双硒聚氨酯聚合物不仅物理性能优异，生物相容性也在可接受的水平，显示出作为药物涂层材料的潜质。西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的硒元素分布均匀，优于传统表面接枝改性的均匀度[43] 。由于硒元素的引入是在聚合物的主链结构中，因而该元素可以在涂层表面和内部大量分布，在涂层降解时依旧可以发挥稳定的抗凝功能，相比于表面接枝更具应用优势。不过，双硒聚氨酯聚合物仍存在一些问题，主要为双硒键在氧气、高温和阳光下的氧化失效问题，这也使双硒聚合物的应用存在一定的难度[44]。因此，改进双硒键的合成设备及储存中的分解问题也是目前聚合物需要解决的问题之一。
此次研究将双硒聚氨酯聚合物与西罗莫司混合制备西罗莫司-双硒聚氨酯涂层，体外抗凝实验和体外药物释放实验结果展现了其作为抗凝药物涂层的良好潜质。抗凝实验结果表明，西罗莫司-双硒聚氨酯涂层的抗凝性能明显优于传统聚乳酸载药涂层，其能够在血液中催化产生一氧化氮分子，抑制血小板的活化；此外，西罗莫司-双硒聚氨酯涂层展现出超过30 d的一氧化氮催化活性，使其具备了长期的抗血栓潜力。药物释放实验结果表明，西罗莫司从双硒聚氨酯涂层中的释放先快后慢，但药物爆释不明显。通过改变双硒聚氨酯聚合物中的亲疏水单元的含量，涂层的药物释放速率可以得到精准控制。双硒聚氨酯聚合物不仅在生物相容性上表现良好，并且药物释放速率的调控作用显著，可为药物涂层的设计提供一定的思路。一些文献认为，一氧化氮可以增强内皮细胞的修复速度[45]，但此次研究中一氧化氮的释放量并没有达到仿生水平，因此未观察到对内皮细胞增殖的加速作用。未来可通过缩短脂肪链长度，改变硒元素含量的方式增大一氧化氮的释放量，进一步实现更优的生物学功能。
总之，此次研究通过在聚氨酯共聚物主链上设计双硒单元，并在聚合物中构建可调亲疏水单元实现了药物涂层的抗凝和药物释放双重功能，可以为药物洗脱支架等植入器械的表面抗凝聚合物涂层的开发提供设计思路和实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程