鹿角胶对激素性股骨头坏死模型大鼠的治疗作用：粪便代谢组学分析

doi:10.12307/2025.772

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (29): 6187-6197.doi: 10.12307/2025.772

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

鹿角胶对激素性股骨头坏死模型大鼠的治疗作用：粪便代谢组学分析

柴金莲1，孙铁锋2，李威3，张博淳3，李广政4，周忠起4，梁学振3，5，王平2

山东中医药大学，1药学院，4中医学院，山东省济南市 250014；2山东省中医药研究院，山东省济南市 250014；3山东中医药大学第一临床医学院，山东省济南市 250355；5山东中医药大学附属医院显微骨科，山东省济南市 250014

收稿日期:2024-09-18 接受日期:2024-11-12 出版日期:2025-10-18 发布日期:2025-03-06
通讯作者: 梁学振，博士，副教授，硕士生导师，山东中医药大学第一临床医学院，山东省济南市 250355；山东中医药大学附属医院显微骨科，山东省济南市 250014 通讯作者：王平，博士，研究员，硕士生导师，山东省中医药研究院，山东省济南市 250014
作者简介:柴金莲，女，1990年生，山东省滨州市人，汉族，药理学硕士，主要从事中药治疗骨性关节炎、骨坏死研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(82205154)，项目负责人：梁学振；山东省自然科学基金青年项目(ZR2021QH004、ZR2024MH156)，项目负责人：梁学振；山东省自然科学基金项目(ZR2020MH386)，项目负责人：王平

Therapeutic effect of Cornus Cervi Colla on steroid-induced osteonecrosis of the femoral head in rat models: fecal metabolomics analysis

Chai Jinlian1, Sun Tiefeng2, Li Wei3, Zhang Bochun3, Li Guangzheng4, Zhou Zhongqi4, Liang Xuezhen3, 5, Wang Ping2

1College of Pharmacy, 4College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China; 2Shandong Provincial Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China; 3First College of Clinical Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China; 5Department of Orthopedic Microsurgery, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China

Received:2024-09-18 Accepted:2024-11-12 Online:2025-10-18 Published:2025-03-06
Contact: Liang Xuezhen, MD, Associate professor, Master’s supervisor, First College of Clinical Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China; Department of Orthopedic Microsurgery, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China Corresponding author: Wang Ping, PhD, Researcher, Master’s supervisor, Shandong Provincial Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
About author:Chai Jinlian, MS, College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82205154 (to LXZ); Shandong Natural Science Foundation (Youth Project), No. ZR2021QH004, ZR2024MH156 (to LXZ); Shandong Natural Science Foundation, No. ZR2020MH386 (to WP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
鹿角胶：是一种传统的中药材，来源于鹿科动物梅花鹿或马鹿的已骨化的鹿角或鹿角盘，通过水煎煮、浓缩制成。此次研究中鹿角胶被用于防治模型大鼠的激素性股骨头坏死，其核心蛋白聚糖能促进骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化，对股骨头坏死具有较好的修复作用。
代谢组学：是一门研究生物样本中小分子代谢物的科学，通过分析生物体内所有代谢物的组成和变化，可以揭示生物体内的代谢途径和网络。此次研究采用粪便代谢组学评估鹿角胶对激素性股骨头坏死模型大鼠粪便代谢物的影响，从而探讨其抗激素性股骨头坏死的多重作用机制。

背景：课题组前期研究表明，鹿角胶中的核心蛋白聚糖可进入骨，促进骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化，对股骨头坏死具有较好的修复作用。
目的：通过粪便非靶向代谢组学方法探讨鹿角胶对大鼠激素性股骨头坏死的治疗作用及潜在机制。
方法：采用随机数字表法将30只SD大鼠随机分为3组：对照组(n=10)右侧臀肌注射生理盐水(每周前3 d注射，连续注射3周)，同时给予纯净水灌胃(1次/d，连续灌胃6周)；模型组(n=10)右侧臀肌注射甲泼尼龙琥珀酸钠(每周前3 d注射，连续注射3周)建立激素性股骨头坏死模型，同时给予纯净水灌胃(1次/d，连续灌胃6周)；鹿角胶组(n=10)同样建立激素性股骨头坏死模型，同时给予鹿角胶灌胃
(1次/d，连续灌胃6周)。灌胃结束后收集盲肠粪便与股骨头，分别进行粪便代谢组学分析与骨组织Micro-CT、苏木精-伊红染色。
结果与结论：①代谢组学分析结果显示，鹿角胶组与模型组相比共233种差异代谢物，具有显著差异和明确注释的代谢物共65个，其中脂质和氨基酸类代谢物含量显著升高，胆酸、硫酸固醇脂、麻黄碱、次黄嘌呤、甜菜碱、左旋肉碱、B-鼠胆酸、胞啶、4-嘧啶酸、牛磺酸、N-乙酰-d-葡萄糖胺、丁酸是影响度最高的几种代谢物(变量权重值VIP > 5)，牛磺酸和次牛磺酸的代谢途径在代谢调控网络中的重要性最高(通路影响因子=0.428 57)。②骨组织Micro-CT扫描结果显示模型组与鹿角胶组大鼠股骨头均出现不同程度的损伤，股骨头轮廓欠规整，股骨头软骨下骨中的骨小梁缺失和紊乱，部分可见囊性变结构；与模型组相比，鹿角胶组大鼠骨小梁损伤程度较轻。苏木精-伊红染色结果显示，模型组和鹿角胶组大鼠股骨头软骨下骨的骨小梁稀疏或中断，空骨陷窝率和脂肪细胞侵袭增加；与模型组相比，鹿角胶组大鼠股骨头软骨下骨的空骨陷窝率和脂肪细胞侵袭有所减少。③结果表明，鹿角胶可能通过牛磺酸的代谢过程及相关通路代谢途径发挥防治激素性股骨头坏死的作用。
https://orcid.org/0009-0009-5134-8721(柴金莲)；https://orcid.org/0000-0001-5649-4212(梁学振)；https://orcid.org/0000-0001-7517-8688(王平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 鹿角胶, 激素性股骨头坏死, 代谢组学, 胆汁酸代谢, 牛磺酸, 工程化组织构建

Abstract: BACKGROUND: Previous studies by the research group have shown that core proteoglycan in Cornus Cervi Colla can enter the bone, promote the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, and has a good repair effect on steroid-induced osteonecrosis of the femoral head.
OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effect and potential mechanism of Cornus Cervi Colla on steroid-induced osteonecrosis of the femoral head in rats by fecal non-targeted fecal metabolomics.
METHODS: Thirty SD rats were randomly divided into three groups using a random number table method: the control group (n=10) was injected with normal saline into the right gluteal muscle (injected on the first 3 days of each week for 3 consecutive weeks), and was given pure water gavage (once a day for 6 consecutive weeks). The model group (n=10) was injected with methylprednisolone sodium succinate into the right gluteal muscle (injected on the first 3 days of each week for 3 consecutive weeks) to establish a steroid-induced osteonecrosis of the femoral head model, and was given pure water gavage (once a day for 6 consecutive weeks). The Cornus Cervi Colla group (n=10) was also established with a steroid-induced osteonecrosis of the femoral head model, and was given Cornus Cervi Colla gavage (once a day for 6 consecutive weeks). After gavage, cecal feces and femoral heads were collected for fecal metabolomics analysis and bone tissue Micro-CT and hematoxylin-eosin staining, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Metabolomics analysis results showed that there were 233 differential metabolites between the Cornus Cervi Colla and model groups, with 65 significantly differing and clearly annotated metabolites. Lipid and amino acid metabolites were significantly increased, with bile acids, sulfated steroids, ephedrine, hypoxanthine, betaine, L-carnitine, B-mouse bile acid, cytidine, 4-pyridoxic acid, taurine, N-acetyl-d-glucosamine, and butyric acid being the most impacted (variable weight value VIP > 5). The metabolic pathways of taurine and hypotaurine were crucial in the metabolic regulatory network (pathway impact=0.428 57). (2) Micro-CT scanning results of bone tissue showed that the femoral heads of rats in the model group and the Cornus Cervi Colla group had different degrees of damage; the femoral head contour was irregular; the trabeculae in the subchondral bone of the femoral head were missing and disordered, and some cystic structures were visible. Compared with the model group, the degree of trabecular damage in the rats of the Cornus Cervi Colla group was milder. Hematoxylin-eosin staining results showed that the trabeculae in the subchondral bone of the femoral heads of rats in the model group and the Cornus Cervi Colla group were sparse or interrupted, and the empty bone lacuna rate and adipocyte invasion were increased. Compared with the model group, the empty bone lacuna rate and adipocyte invasion in the subchondral bone of the femoral heads of rats in the Cornus Cervi Colla group were reduced. (3) These results conclude that Cornus Cervi Colla potentially mitigates steroid-induced osteonecrosis of the femoral head through the metabolic processes involving taurine and associated pathways.

Key words: Cornus Cervi Colla, steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, metabolomics, bile acid metabolism, taurine, engineered tissue construction

中图分类号:

柴金莲, 孙铁锋, 李威, 张博淳, 李广政, 周忠起, 梁学振, 王平. 鹿角胶对激素性股骨头坏死模型大鼠的治疗作用：粪便代谢组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(29): 6187-6197.

Chai Jinlian, Sun Tiefeng, Li Wei, Zhang Bochun, Li Guangzheng, Zhou Zhongqi, Liang Xuezhen, Wang Ping. Therapeutic effect of Cornus Cervi Colla on steroid-induced osteonecrosis of the femoral head in rat models: fecal metabolomics analysis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(29): 6187-6197.

图/表（结果） 12

2.1 实验动物数量分析 30只SD大鼠全部进入结果分析。
2.2 各组大鼠基本状态对照组大鼠毛色和光泽正常，饮食、排泄和精神状态良好，体质量随时间逐渐增加。在甲泼尼龙琥珀酸钠注射期间，模型组部分大鼠精神状态不佳，食欲下降，毛色灰暗稀释，大便稀软，尿量多，体质量出现下降，停止注射后体质量上升，第3周注射完成后食欲尚可，毛色、光泽恢复正常，体质量呈现持续增长状态，但明显低于对照组。在甲泼尼龙琥珀酸钠注射期间，鹿角胶组大鼠食欲尚可，毛色略灰暗稀疏，大便轻度稀软，尿量稍多，体质量也出现一定程度的下降，停止注射后体质量上升，第3周注射完成后食欲恢复正常，毛色、光泽逐渐恢复正常，体质量呈现持续增长状态，整体增长态势介于对照组与模型组之间。各组大鼠体质量变化见图1。
2.3 各组大鼠股骨头大体形态观察结果对照组股骨头形态规则，表面光滑圆润，呈现健康的白色或略带黄色；模型组股骨头形态较对照组无明显差异，部分股骨头关节软骨略粗糙，呈现暗且薄的软骨表面，并伴有暗红色坏死灶；鹿角胶组股骨头形态较对照组形态无明显差异，软骨表面偶见不均匀的灰白色，但骨坏死程度无模型组严重，见图2。
2.4 各组大鼠股骨头Micro-CT扫描及骨形态计量学参数分析结果 Micro-CT扫描图像显示，与对照组相比，模型组与鹿角胶组大鼠股骨头均表现不同程度的损伤，股骨头轮廓欠规整，股骨头软骨下骨中的骨小梁缺失和紊乱，部分可见囊性变结构，但鹿角胶组大鼠骨小梁损伤程度轻于模型组，见图3。
骨形态计量学参数中骨密度半定量分析结果显示，模型组和鹿角胶组大鼠骨密度均明低于对照组(P < 0.05)，鹿角胶组大鼠骨密度高于模型组(P < 0.05)，各组骨形态计量学参数中的其他参数(包括组织体积、骨体积、骨表面积、骨体积分数、骨表面积组织体积比值、骨表面积骨体积比值)比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.5 各组大鼠股骨头苏木精-伊红染色结果苏木精-伊红染色显示，与对照组相比，模型组和鹿角胶组大鼠股骨头软骨下骨的骨小梁稀疏或中断，空骨陷窝率和脂肪细胞侵袭增加；与模型组相比，鹿角胶组大鼠股骨头软骨下骨的空骨陷窝率和脂肪细胞侵袭有所减少，见图4。
2.6 各组大鼠粪便代谢物分析
2.6.1 多元统计分析采用主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)对结果进行分析。PCA分析显示各组样本表现组内聚类及组间离散，各组样本之间具有差异；进一步对比各组OPLS-DA模型的相关评价参数表明，代谢物表达量与样品类别之间建立的关系模型可靠；OPLS-DA评分图显示了对照组、模型组、鹿角胶组之间的样本对比区分非常显著。OPLS-DA置换检验表明各组OPLS-DA模型不存在过拟合，具备较好的有效性及稳健性。各组对比的OPLS-DA模型相关验证参数见表2。PCA分析、OPLS-DA评分和置换检验见图5。

2.6.2 差异代谢物分析对各组之间的差异代谢物丰度进行差异倍数计算，并根据变量权重值(VIP值)≥1、P≤0.05，利用R包ggplot2绘制差异代谢物的火山图，可以看出在组间差异代谢物分布情况，见图6。
此次研究设定OPLS-DA模型中的VIP≥1、P≤0.05。经筛选，模型组与对照组相比共247种差异代谢物，其中59种上调，188种下调。鹿角胶组与模型组相比共233种差异代谢物，其中109种上调，124种下调。根据精准分子质量及数据库比对，最终确定对照组与模型组中有65个具有显著差异和明确注释的代谢物；模型组与鹿角胶组中有64个。对上述差异代谢物进行聚类分析得到图7。聚类热图显示各组组内数据重复性较好。同模型组相比，鹿角胶组粪便样本中有30个代谢物上调，34个代谢物下调，各代谢物详细信息见表3。
由表3可以看出，脂质和氨基酸是模型组与鹿角胶组最主要的几类差异代谢产物。脂质代谢中与胆汁酸分泌、初级胆汁酸生物合成、次级胆汁酸生物合成途径相关的代谢物B-鼠胆酸(log2_FC=1.865)、胆汁酸(log2_FC=1.463)以及胆酸(log2_FC=1.195)，在鹿角胶组粪便样本中的含量显著高于模型组；与炎症递质对瞬时受体电位通道调节途径相关的佛波醇(log2_FC=2.679)，在鹿角胶组粪便样本中的含量显著高于模型组；与丁酸代谢途径相关的丁酸(log2_FC=-0.699)，与甲状旁腺激素合成、分泌和作用途径相关的骨化三醇(log2_FC=-0.719)，在鹿角胶组粪便样本中的含量均显著低于模型组。
氨基酸代谢中与D-氨基酸代谢途径相关的代谢物D-苏氨酸(log2_FC=2.822)和D-鸟氨酸(log2_FC=0.658)，在鹿角胶组在鹿角胶组粪便样本中的含量显著高于模型组，以及与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径相关的甜菜碱(log2_FC=1.126)、肌氨酸(log2_FC=0.855)，在鹿角胶组粪便样本中的含量显著高于模型组；与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代谢途径相关的代谢物精氨酸琥珀酸(log2_FC=-1.059)，在鹿角胶组粪便样本中的含量显著低于模型组。
值得注意的是，与初级胆汁酸生物合成、牛磺酸和次牛磺酸代谢途径相关的牛磺酸(log2_FC=2.887)，在鹿角胶组粪便样本中的含量要显著高于模型组。
对64个代谢物的VIP值进行降序排列，可以看出胆酸、硫酸固醇脂、麻黄碱、次黄嘌呤、甜菜碱、左旋肉碱、B-鼠胆酸、胞啶、4-嘧啶酸、牛磺酸、N-乙酰-d-葡萄糖胺、丁酸是影响度最高的几种代谢物(VIP > 5)，其中胆酸、左旋肉碱、B-鼠胆酸、牛磺酸均与胆汁代谢途径相关。
另外，在对照组vs. 模型组65个有显著差异和明确注释的代谢物中，有10种在鹿角胶应用后有明显的回调，见表4。
2.6.3 差异代谢物通路分析采用KEGG数据库(http://metpa.metabolomics.ca)与MetPA数据库(http://metpa.metabolomics.ca)对鹿角胶组干预激素性股骨头坏死模型大鼠后的233种差异代谢物进行映射、富集分类，共得到73条显著富集的代谢通路。根据富集和影响因子分析得到代谢通路影响因子气泡图，见图8。其中，6条具有显著性功能的代谢通路(通路影响因子 > 0.1)，分别为牛磺酸和次牛磺酸的代谢、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸的代谢、类固醇激素生物合成、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸的代谢、精氨酸生物合成、络氨酸代谢，见表5。在代谢调控网络中的重要性最高的是牛磺酸和次牛磺酸的代谢途径(通路影响因子=0.428 57)，从该通路的显著性通路图中可以看出，鹿角胶组牛磺酸的上调是影响该代谢途径的核心环节，而与其密切相关的初级胆汁酸生物合成途径当中，初级胆汁酸的上调是引起牛磺酸上调的关键因素。

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引言

激素性股骨头坏死是一种难治性骨关节疾病，主要是由于长期或大剂量使用类固醇类药物引起的，导致骨组织缺血、缺氧，最终可能发生股骨头塌陷[1-2]。随着类固醇类药物在临床上的广泛应用，激素性股骨头坏死的发病率逐年上升，成为一个日益突出的公共健康问题。流行病学调查结果显示，长期使用类固醇药物患者的激素性股骨头坏死发生率可高达20%-30%，并且一旦发生往往导致关节功能障碍，严重时甚至需要进行关节置换手术，给患者带来巨大的身体和经济负担[3-6]。激素性股骨头坏死的不良后果不仅限于局部，还可能影响患者的全身健康，引发慢性疼痛、行走困难，还可能并发骨关节炎、骨质疏松症等疾病，严重影响患者的生活质量，因此，寻找有效的预防和治疗措施对于改善患者预后至关重要。在中医学中，激素性股骨头坏死并非作为一个独立的病证存在，根据其临床表现可归属于“骨蚀”“骨痹”等范畴。中医学认为肾虚血瘀、痰淤阻络是激素性股骨头坏死的主要中医证型，治疗原则多从补肾活血、化痰通络等方面入手，旨在调整机体内环境，促进骨质修复。
现代医学在激素性股骨头坏死防治方面仍缺乏明确的特效药物。鹿角胶作为传统的中药材具有补肝肾、益精血、托疮生肌的功效，已被广泛应用于治疗骨关节疾病[7]。现代药理学研究证实，鹿角胶中含有的多种生物活性成分能够促进成骨细胞的增殖与分化、抑制破骨细胞的活性，对骨组织修复具有积极作用。此次研究旨在通过非靶向代谢组学方法探讨鹿角胶对激素性股骨头坏死模型大鼠粪便代谢物的影响，以期揭示其防治激素性股骨头坏死的作用机制，为临床治疗提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机分组动物实验，组间比较采用t检验或单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2023年10月至2024年7月在山东省中医药研究院中药药理所和广州基迪奥生物科技有限公司完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 8周龄雄性SD大鼠30只，体质量(285±15) g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2021-0006。饲养于山东省中医药研究院中药药理所SPF级动物实验中心，室温21-25 ℃，相对湿度45%-60%，每笼3只，日间12 h光照、夜间12 h黑暗交替循环，灭菌饲料及纯净水饲养。适应性饲养1周后开展后续实验。实验方案已通过经山东省中医药研究院实验动物伦理委员会审查批准(动物伦理编号：SDZYY20201210001)。
1.3.2 实验药物鹿角胶(山东古阿井阿胶有限公司，批号：2023022501)；注射用甲泼尼龙琥珀酸钠(南光化学制药股份有限公司，批号2B3191)；生理盐水(山东科伦药业有限公司，批号B23072703A)。以上药物均购于山东中医药大学附属医院。
1.3.3 主要试剂异氟烷(山东安特牧业科技有限公司，批号20221004)；通用型组织固定液(武汉塞维尔生物科技有限公司，批号GP2310301)；EDTA脱钙液(武汉塞维尔生物科技有限公司，批号GP2310301)；苏木精-伊红高清恒染试剂盒(武汉塞维尔生物科技有限公司，批号G1076)；乙腈(Merck，批号1499230-935)；乙酸铵(Sigma，批号70221)。
1.3.4 主要仪器 RM2016病理切片机(上海莱卡仪器有限公司)；Nikon Eclipse E100正置光学显微镜(日本尼康公司)；Quantum GX2型microCT(PerkinElmer公司)；QB-206型多用途旋转摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；5430R低温高速离心机(Eppendorf公司)；Triple TOF 6600质谱仪(AB SCIEX公司)；1290 Infinity LC超高压液相色谱仪(Agilent公司)。
1.4 方法
1.4.1 鹿角胶药液制备此次研究用鹿角胶规格为6 g/片，将鹿角胶打粉后密封保存。基于课题组前期研究[8]，并参照鹿角胶在2020版《中国药典》规定的用量标准，在50 mL离心管中加入35 mL纯净水水浴加热至60 ℃，加入2.7 g鹿角胶粉，充分烊化成鹿角胶药液，最后补齐药液至50 mL，换算成大鼠给药剂量为0.54 g/(kg·d)。每只大鼠按照10 mL/kg灌胃给药，每次现用现配。
1.4.2 激素性股骨头坏死大鼠模型的建立及分组干预经过1周的适应喂养后，采用随机数字表法将30只SD大鼠随机分为对照组、模型组和鹿角胶组，每组10只。采用生理盐水配制甲泼尼龙琥珀酸钠注射液[9]。对照组大鼠右侧臀肌注射10 mL/(kg·d)生理盐水(每周前3 d注射，连续注射3周)，同时给予10 mL/kg纯净水灌胃(1次/d，连续灌胃6周)；模型组大鼠右侧臀肌注射20 mg/(kg·d)甲泼尼龙琥珀酸钠(每周前3 d注射，连续注射3周)建立激素性股骨头坏死模型，同时给予10 mL/kg纯净水灌胃(1次/d，连续灌胃6周)；鹿角胶组(n=10)大鼠右侧臀肌注射20 mg/(kg·d)甲泼尼龙琥珀酸钠(每周前3 d注射，连续注射3周)建立激素性股骨头坏死模型，同时给予0.54 g/kg鹿角胶灌胃(1次/d，连续灌胃6周)。实验期间每天观察大鼠的基本状态，包括体质量、毛色、饮食、尿便及精神状态等。灌胃结束后，通过股骨苏木精-伊红染色判定造模是否成功。

1.4.3 取材灌胃结束后禁食12 h不禁水。异氟烷吸入性麻醉后依次收集盲肠粪便、股骨，粪便样本置于冻存管液氮速冻，待完全冻透后转移至-80 ℃保存备用；大鼠股骨样本置于40 g/L多聚甲醛中固定，24，48 h后更换固定液，固定48 h后用生理盐水清洗股骨，观察股骨头外观形态。
1.4.4 Micro-CT扫描及骨形态计量学参数分析观察完股骨头大体形态后，每组随机选取4个样本送至山东大学模式动物研究中心，以股骨头为扫描中心，通过PerkinElmer仪器公司 Quantum GX2 Micro-CT设备进行扫描，采用工作站分析软件Analyze12.0对股骨头Micro-CT扫描数据进行骨形态计量学参数分析。
1.4.5 股骨头苏木精-伊红染色 Micro-CT扫描完成后，将股骨头依次经EDTA脱钙、脱水、透明、包埋处理，沿股骨头冠状面切成约5 μm 切片、烤片后，进行苏木精- 伊红染色，置于显微镜下观察并拍照记录。
1.4.6 粪便代谢物检测
样本提取：取适量样本加入预冷甲醇/乙腈/水溶液(体积比2∶2∶1)中涡旋混合，低温超声30 min，-20 ℃静置10 min，4 ℃条件下14 000×g 离心20 min，取上清真空干燥，加入100 μL乙腈水溶液(乙腈与水体积比1∶1)复溶，涡旋混合，4 ℃条件下14 000×g 离心15 min，取上清液进样分析。
色谱-质谱分析：①色谱条件：采用Agilent 1290 Infinity LC 超高效液相色谱系统HILIC色谱柱(Waters，ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm，2.1 mm×100 mm column)，柱温25 ℃，流速0.5 mL/min，进样量2 μL。②流动相组成：A相为水+25 mmol/L乙酸铵+25 mmol/L 氨水，B相为乙腈。梯度洗脱程序如下：0-0.5 min，95%B相；0.5-7 min，B相从95%线性变化至65%；7.0-8.0 min，B相从65%线性变化至40%；8.0-9.0 min，B相维持在40%；9-9.1 min，B相从40%线性变化至95%；9.1-12 min，B相维持在95%。整个分析过程中样品置于4 ℃自动进样器中。
质谱条件：使用AB Triple TOF 6600 质谱仪进行样本一级、二级谱图的采集。扫描采用正负两种模式，电喷雾离子源条件如下：离子源气流1(Gas1)60 arb，离子源气流2 (Gas2)60 arb，气帘气30 arb，温度600 ℃，电压±5 500 V(正负两种模式)；一级扫描范围60-1 000 Da，二级扫描范围25-1 000 Da；二级质谱采用信息依赖性扫描获得，采用high sensitivity模式，去簇电压±60 V(正负两种模式)，碎裂能量(35±15) eV。
数据处理：原始数据经ProteoWizard转换成.MzML格式，使用XCMS程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。由广州基迪奥生物科技有限公司对XCMS提取得到的数据进行物质注释及归一化处理。采用广州基迪奥生物科技有限公司提供的Omicsmart分析平台进行测序数据分析、代谢物靶点预测、富集分析和生物信息学分析。
1.5 主要观察指标各组大鼠股骨头Micro-CT及骨形态计量学参数、苏木精-伊红染色，以及粪便代谢物与差异代谢物通路分析。
1.6 统计学分析运用Image Pro Plus 6.0软件对实验图像进行数字化分析，利用Graphpad Prism 9.0软件进行统计分析，组间比较采用t检验或单因素方差分析。所有统计测试的显著性水平设定为P < 0.05。该文统计学方法已经山东中医药大学附属医院生物统计学专家审核。

讨论

传统中医学中并无激素性股骨头坏死这一病证，《黄帝内经》中记载：“虚邪之入于身也深，寒与热相搏，久留而内着，寒胜其热，则骨痛肉枯；热胜其寒，则烂肉腐肌为脓，内伤骨，为骨蚀。”根据激素性股骨头坏死的临床表现，将其归为“骨蚀”“骨痹”等范畴，中医证型为肾虚血瘀、痰淤阻络，基本病机是“肾虚、痰湿、血瘀”，肾虚骨骼失养为发病之根本[10-11]。激素性股骨头坏死晚期多引起软骨下骨骨折，甚至股骨头塌陷，给患者带来严重的髋关节功能障碍和疼痛[12-13]。目前尚无保髋治疗手段的金标准，髋关节置换术虽能一定程度上缓解激素性股骨头坏死晚期症状，但对患者的生活质量和经济负担造成重大影响[14]，因此，促进软骨重建、修复受损软骨和恢复关节功能一直是激素性股骨头坏死治疗亟待解决的难题激素性股骨头坏死的发病机制复杂，成骨细胞和破骨细胞功能障碍是激素性股骨头坏死的重要环节，糖皮质激素的使用被认为与成骨细胞分化、成骨细胞和破骨细胞凋亡以及骨微循环障碍有关[15-18]。在正常生理条件下，骨微环境中不同细胞及其分子介质的动态调控对于维持破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成之间平衡具有重要意义，这种动态调控最终会影响骨的完整性[19-21]。长期大剂量糖皮质激素的作用会减弱成骨细胞的生理功能，阻断成骨细胞调控转录激活因子的活化，抑制成骨细胞的基质矿化过程，进而造成了“骨微循环障碍”；同时糖皮质激素可提高破骨细胞的存活，引起过度的骨丢失，之后抑制破骨细胞生成，导致低骨转换状态，最终引起骨重塑动态平衡体系破坏[7，22]。
鹿角胶为鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temminck或马鹿Cervus.elaphus Linnaeus已骨化的鹿角或鹿角盘经水煎煮、浓缩制成的固体胶(《中国药典2020年》)，有补肝肾、益精血、托疮生肌的功效。鹿角胶始载于《神农本草经》，被列为上品，名“白胶”，谓其“主伤中劳绝，腰痛羸瘦，补中益气……”。《玉楸药解》中称其可“温肝补肾，滋益精血。治阳痿精滑，跌打损伤。”《本草汇言》：“鹿角胶，壮元阳，补血气，生精髓，暖筋骨之药也。”课题组前期研究表明鹿角胶中的核心蛋白聚糖可进入骨[23]，促进骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化[8，24-25]，对股骨头坏死具有较好的修复作用[8]。
建立一个稳定且有效的临床前疾病模型，对于揭示病理生理学机制和评估预防及治疗效果至关重要。糖皮质激素是导致非创伤性激素性股骨头坏死的主要原因，其诱导的激素性股骨头坏死发病机制涉及细胞不可逆损伤[26]。尽管糖皮质激素与激素性股骨头坏死之间的因果关系已经明确，并建立了激素性股骨头坏死多种动物模型，但理想的激素性股骨头坏死动物模型尚未建立[27-32]，这些模型受到物种、体质量、年龄、激素类型、干预时间、给药方式和代谢方式等多种因素的影响[33-34]。相比之下，大鼠因易于饲养、繁殖迅速、成本效益高且与人类在生理代谢特性和遗传基因上有相似性，成为研究代谢疾病分子机制和药物防治的理想模型[35]；此外，鹿角胶作为一味多组分中药成分复杂，采用灌胃给药模拟了人类口服药物的途径，更接近临床应用场景。
以粪便为分析对象的代谢组学是将肠道代谢物小分子作为研究对象，研究代谢物种类及含量变化规律，揭示肠道相关代谢性疾病的机体变化。外源性药物或饮食的摄入可以通过“肠-骨轴”改变肠道微生物的代谢物水平，继而传递生物学信号影响宿主，参与调节骨代谢[36-37]。因此，研究鹿角胶干预下激素性股骨头坏死模型大鼠的粪便代谢组学，能够从“肠-骨”轴的视角揭示鹿角胶对激素性股骨头坏死模型大鼠代谢物的调节作用。
此次研究结果显示鹿角胶组大鼠体质量增长态势介于对照组与模型组之间，并且随着造模结束和鹿角胶继续干预，鹿角胶组大鼠的精神、食欲、毛色等方面较模型组明显改善，这一现象表明，鹿角胶可能通过改善骨组织的健康状况间接影响大鼠的整体代谢状态和营养吸收，证明鹿角胶在改善激素性股骨头坏死模型大鼠整体状况方面发挥积极作用。代谢组学分析结果表明，经鹿角胶干预后脂质和氨基酸类代谢物含量显著升高；胆酸、硫酸固醇脂、麻黄碱、次黄嘌呤、甜菜碱、左旋肉碱、B-鼠胆酸、胞啶、4-嘧啶酸、牛磺酸、N-乙酰-d-葡萄糖胺、丁酸是影响度最高的几种代谢物(VIP > 5)；牛磺酸和次牛磺酸的代谢途径在代谢调控网络中的重要性最高(通路影响因子=0.428 57)，说明鹿角胶可能通过调节脂质代谢和氨基酸代谢来发挥防治激素性股骨头坏死的作用，其中与初级胆汁酸生物合成密切相关的牛磺酸和次牛磺酸代谢是其作用的主要代谢途径。此次研究还发现，在模型组与对照组比较得到的65个有显著差异和明确注释的代谢物中，有10种在鹿角胶治疗后出现了明显的回调，其中与次生胆汁酸生物合成途径相关的B-鼠胆酸影响度最高(对照组vs.模型组，VIP=4.859；模型组vs.鹿角胶组，VIP=8.088)，这也说明鹿角胶的应用逆转了糖皮质激素诱导激素性股骨头坏死模型大鼠的胆汁代谢失衡。
胆汁酸以胆固醇为前体在肝脏中合成初级胆汁酸储存于胆囊，包括胆酸、鹅脱氧胆酸及其与甘氨酸或牛磺酸的结合产物。进食时初级胆汁酸从胆囊分泌到肠道，受到肠道微生物的广泛代谢，甘氨酸或牛磺酸的结合物被解旋，胆酸、鹅脱氧胆酸等形成脱氧胆酸、石胆酸等次级胆汁酸，促进脂类和胆固醇的消化和吸收[38-39]。
此次研究中鹿角胶的应用导致初级胆汁酸的上调，继而引起牛磺酸上调。牛磺酸是一种不参与体内蛋白质生物合成的含硫游离氨基酸，广泛分布于哺乳动物组织和器官当中，参与调节多种细胞功能，包括胆盐合成、胆固醇代谢、抗炎、抗氧化、渗透压调节和神经元兴奋性调节等[40]。近年来的研究发现，牛磺酸参与成骨细胞分化、抑制破骨细胞分化、维持软骨细胞功能，在治疗骨质疏松症、骨肿瘤、骨关节炎、类风湿性关节炎等骨科疾病方面发挥着重要作用[41]。另有研究表明，牛磺酸能够逆转糖皮质激素引起的家兔骨和骨细胞线粒体中线粒体转录因子A和ATP合成酶的表达水平，发挥对线粒体功能的保护作用，间接防止骨坏死的发生[42]。
此次研究创新地将非靶向代谢组学技术应用于评估鹿角胶对激素性股骨头坏死模型大鼠的代谢调节作用，揭示了鹿角胶通过调节脂质代谢和氨基酸代谢来发挥防治激素性股骨头坏死的潜在机制。特别是，研究发现鹿角胶通过影响初级胆汁酸生物合成相关的牛磺酸和次牛磺酸代谢，可能在调节肠道菌群和代谢物、改善骨健康方面起到关键作用，这一发现不仅为中医药治疗骨坏死提供了新的理论依据，也为未来药物开发和治疗策略提供了新的靶点。通过整合临床前研究与代谢组学数据，此次研究不仅评估鹿角胶的疗效，还深入探讨其作用机制，为中医药现代化和国际化提供了科学支持，增强对鹿角胶治疗激素性股骨头坏死机制的理解。
在探讨鹿角胶对激素性股骨头坏死模型大鼠的保护作用及其机制研究中，尽管通过粪便代谢组学分析取得了一定的成果，但仍存在若干不足之处，需要在未来的研究中加以补充和完善：①在药效学评价方面主要依赖于Micro-CT、组织化学染色等形态学方法以及骨形态计量学参数的测定，这些指标虽然能够反映药物对股骨头的保护作用，但缺乏对药效的全面评估。例如，未对大鼠的疼痛行为、关节功能等进行评价，而这些指标对于评估药物的疗效同样重要。在未来的研究中计划引入更为全面的行为测试和功能性评估，以期获得更深入的药效学数据。②在药物分组设计上仅设置了对照组、模型组和鹿角胶组，未考察不同剂量鹿角胶对激素性股骨头坏死的量效关系，也未明确鹿角胶对正常大鼠灌胃的代谢物变化情况。③考虑到激素性股骨头坏死缺乏特效药物，研究亦未设置阳性对照药组，可能限制了对鹿角胶疗效的全面评价和比较。因此，后续研究中将考虑设置非造模鹿角胶灌胃对照组、不同剂量鹿角胶组以及加入阳性对照药组，并增加随访时间以更准确地评估鹿角胶的疗效。④尽管研究利用代谢组学方法初步揭示鹿角胶可能通过调节脂质代谢和氨基酸代谢来发挥防治激素性股骨头坏死的作用，但这些发现主要基于相关性分析，缺乏深入的作用机制研究和验证。例如，未对牛磺酸和次牛磺酸代谢途径中的关键酶和信号分子进行检测，也未在细胞或分子水平上验证鹿角胶对这些代谢途径的影响。未来的研究将深入探索鹿角胶对相关代谢途径中关键分子的影响，以阐明其作用机制。⑤动物实验结果需要在临床实践中进一步验证。由于动物模型与人类疾病之间存在差异，鹿角胶在动物体内的药效表现和作用机制可能与临床应用有所不同，因此，未来研究需要在临床试验中进一步验证鹿角胶的疗效和安全性，以及其对激素性股骨头坏死患者肠道菌群和代谢物的影响。
综上所述，鹿角胶可明显改善激素性股骨头坏死模型大鼠的整体状况，促进局部股骨头骨修复，改善糖皮质激素造成的骨丢失；代谢组学分析结果表明，鹿角胶可调节激素性股骨头坏死模型大鼠粪便代谢紊乱，具体机制可能涉及牛磺酸的代谢过程及相关通路参与激素性股骨头坏死的发生发展。然而，牛磺酸如何参与激素性股骨头坏死的病理生理过程及鹿角胶如何发挥干预作用的深层机制，有待进一步探索研究。该研究揭示了鹿角胶在中医“补肾壮骨”理论中的潜在应用价值，为中医药在骨坏死治疗领域的发展提供了新的视角。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

鹿角胶对激素性股骨头坏死模型大鼠的治疗作用：粪便代谢组学分析

Therapeutic effect of Cornus Cervi Colla on steroid-induced osteonecrosis of the femoral head in rat models: fecal metabolomics analysis

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