丹参酮ⅡA对冷冻保存小鼠卵巢的保护机制

doi:10.12307/2025.776

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (29): 6198-6204.doi: 10.12307/2025.776

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丹参酮ⅡA对冷冻保存小鼠卵巢的保护机制

吴小绸1，王慧颖1，王婕1，张彩凤1，侯雁云2，金波1

北京中医药大学深圳医院(龙岗)，1妇科，2病理科，广东省深圳市 518000

收稿日期:2024-08-09 接受日期:2024-10-08 出版日期:2025-10-18 发布日期:2025-03-06
通讯作者: 金波，博士，副研究员，北京中医药大学深圳医院(龙岗)妇科，广东省深圳市 518000
作者简介:吴小绸，女，1991年生，广东省湛江市人，汉族，硕士，医师，主要从事生育力保护与生殖健康方面的研究。
基金资助:
深圳市“医疗卫生三名工程”项目资助(SZZYSM202311019)，项目负责人：王慧颖；深圳市龙岗区医疗卫生技术攻关项目(LGKCYLWS2023002)，项目负责人：王慧颖；深圳市龙岗区科技创新局医疗卫生科技计划项目(LGKCYLWS2021000019)，项目负责人：王慧颖；育龙计划-三龙人才项目(2023-BUCMSZYLRC13)，项目负责人：吴小绸；山东银丰生命科学研究项目资助(KJKHX2023001)，项目负责人：王慧颖

Protective mechanism of tanshinone IIA in mouse ovarian cryopreservation

Wu Xiaochou1, Wang Huiying1, Wang Jie1, Zhang Caifeng1, Hou Yanyun2, Jin Bo1

1Department of Gynecology, 2Department of Pathology, Shenzhen Hospital of Beijing University of Chinese Medicine (Longgang), Shenzhen 518000, Guangdong Province, China

Received:2024-08-09 Accepted:2024-10-08 Online:2025-10-18 Published:2025-03-06
Contact: Jin Bo, MD, Associate researcher, Department of Gynecology, Shenzhen Hospital of Beijing University of Chinese Medicine (Longgang), Shenzhen 518000, Guangdong Province, China
About author:Wu Xiaochou, MS, Physician, Department of Gynecology, Shenzhen Hospital of Beijing University of Chinese Medicine (Longgang), Shenzhen 518000, Guangdong Province, China
Supported by:
Shenzhen “Top Three Medical and Health Projects”, No. SZZYSM202311019 (to WHY); Medical and Health Technology Research Project in Longgang District of Shenzhen, No. LGKCYLWS2023002 (to WHY); Medical and Health Technology Plan Project of Shenzhen Science and Technology Innovation Bureau, No. LGKCYLWS2021000019 (to WHY); Yulong Plan-Sanlong Talent Project, No. 2023-BUCMSZYLRC13 (to WXC); Shandong Yinfeng Life Science Research Project, No. KJKHX2023001 (to WHY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
丹参酮ⅡA：是从中药丹参中提取的一种脂溶性化合物，具有多种药理活性，包括抗氧化、抑制炎症反应、减少凋亡等作用，对保护卵巢组织冷冻损伤有重要作用。
卵巢组织玻璃化冷冻保存：将卵巢及其保护剂溶液在快速降温过程中由液相直接转变为玻璃状的固体，并在低温下长期贮存，是一种快速、高效、低成本的技术。然而，超低温保存会对卵巢细胞结构和功能造成相应的破坏，包括氧化应激、炎症反应、冷休克、胞内冰晶形成等。

背景：卵巢组织玻璃化冻存是保存生育力的重要方法之一。丹参酮ⅡA具有多种药理活性，包括抗氧化、抑制炎症反应、减少凋亡等，但其作为卵巢组织玻璃化冷冻保护添加剂的作用尚不清楚。
目的：探讨丹参酮ⅡA对小鼠卵巢组织冷冻保存的保护作用。
方法：获取25只6周龄雌性KM小鼠的卵巢组织，随机分为5组，每组10个卵巢：新鲜组不进行冷冻保存，冷冻对照组使用玻璃化冷冻保护剂，0.5，2.5，5 µmol/L丹参酮ⅡA组分别使用含0.5，2.5，5 µmol/L丹参酮ⅡA的玻璃化冷冻保护剂，置于液氮中冷冻保存。保存3 d后取出冻存管解冻，采用苏木精-伊红染色观察各组卵巢组织及卵泡形态，分析卵泡形态正常率及存活率；通过酶联免疫法检测卵巢内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、丙二醛、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β及白细胞介素17水平；采用RT-qPCR和Western blot检测小鼠卵巢内核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid derived 2-like 2，Nrf2)和血红素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)的mRNA及蛋白表达。
结果与结论：①与新鲜组比较，冷冻对照组卵巢内各级卵泡形态异常、卵泡存活率下降(P < 0.05)，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性下降(P < 0.05)，丙二醛、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β及白细胞介素17水平均升高(P < 0.05)，Nrf2、HO-1的mRNA及蛋白表达均下降(P < 0.05)；②与冷冻对照组比较，不同浓度丹参酮ⅡA均可改善卵巢内各级卵泡形态、提升卵泡存活率，提升超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性，降低丙二醛、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β及白细胞介素17水平，提升Nrf2、HO-1的mRNA及蛋白表达，并且呈现浓度依赖性，以5 µmol/L丹参酮ⅡA的作用最显著；③结果表明，丹参酮ⅡA可能通过介导Nrf2/HO-1信号通路降低小鼠卵巢组织的氧化应激水平和炎症反应，减轻小鼠卵巢玻璃化冷冻保存而出现的生殖损伤。
https://orcid.org/0009-0002-4688-2216(吴小绸)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 丹参酮ⅡA, 小鼠卵巢, 冷冻保存, 氧化应激, 核因子E2相关因子2(Nrf2), 血红素加氧酶1(HO-1), 工程化组织构建

Abstract: BACKGROUND: Ovarian tissue vitrification cryopreservation is one of the important methods for preserving fertility. Tanshinone IIA has various pharmacological activities, including anti-oxidation, inhibition of inflammatory response, and reduction of apoptosis, but its role as an additive for vitrification cryoprotection of ovarian tissue is still unclear.
OBJECTIVE: To explore the protective effect of tanshinone IIA on vitrification cryopreservation of mouse ovarian tissue.
METHODS: Twenty-five 6-week-old female KM mice were randomly selected and their ovarian tissues were randomly divided into five groups, with 10 ovaries per group. The fresh group was not cryopreserved. The frozen control group used vitrification cryoprotectant. The 0.5, 2.5, and 5 µmol/L tanshinone IIA groups used vitrification cryoprotectant containing 0.5, 2.5, and 5 µmol/L tanshinone IIA, respectively, and were cryopreserved in liquid nitrogen. After 3 days of storage, the cryopreserved tubes were taken out and thawed. The ovarian tissue and follicle morphology of each group were observed by hematoxylin-eosin staining, and the normal follicle morphology and survival rate were analyzed. The levels of superoxide dismutase, catalase, malondialdehyde, tumor necrosis factor-α, interleukin-1β, and interleukin-17 in the ovary were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. RT-qPCR and western blot assay were used to detect the mRNA and protein expressions of nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) and heme oxygenase 1 (HO-1) in the mouse ovary.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the fresh group, the frozen control group had abnormal morphology of follicles at all levels in the ovary, decreased follicle survival rate (P < 0.05), decreased superoxide dismutase and catalase activities (P < 0.05); the levels of malondialdehyde, and tumor necrosis factor α, interleukin 1β, and interleukin 17 were all increased (P < 0.05), and the mRNA and protein expressions of Nrf2 and HO-1 were decreased (P < 0.05). (2) Compared with the frozen control group, different concentrations of tanshinone IIA could improve the morphology of follicles at all levels in the ovary, increase the survival rate of follicles, enhance the activities of superoxide dismutase and catalase, and reduce the levels of malondialdehyde, tumor necrosis factor α, interleukin 1β, and interleukin 17, increased the mRNA and protein expression of Nrf2 and HO-1 in a concentration-dependent manner, with 5 µmol/L tanshinone IIA having the most significant effect. (3) The results show that tanshinone IIA may reduce the oxidative stress level and inflammatory response of mouse ovarian tissue by mediating the Nrf2/HO-1 signaling pathway, thereby alleviating the reproductive damage caused by vitrification cryopreservation of mouse ovaries.

Key words: tanshinone IIA, mouse ovaries, cryopreservation, oxidative stress, nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2), heme oxygenase 1 (HO-1), engineered tissue construction

中图分类号:

吴小绸, 王慧颖, 王婕, 张彩凤, 侯雁云, 金波. 丹参酮ⅡA对冷冻保存小鼠卵巢的保护机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(29): 6198-6204.

Wu Xiaochou, Wang Huiying, Wang Jie, Zhang Caifeng, Hou Yanyun, Jin Bo. Protective mechanism of tanshinone IIA in mouse ovarian cryopreservation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(29): 6198-6204.

图/表（结果） 6

2.1 玻璃化冷冻液中添加丹参酮ⅡA对小鼠卵巢各级卵泡的影响由图2，3可见，新鲜组卵巢内原始卵泡及初级卵泡形态呈球形，颗粒细胞围绕在卵母细胞周围且排布均匀紧密；冷冻对照组卵巢内原始卵泡及初级卵泡形态畸形或空泡化，颗粒细胞排列疏松或脱落至卵泡边缘；不同浓度丹参酮ⅡA组卵巢内部分原始卵泡及初级卵泡形态呈球形，原始卵泡及初级卵泡核固缩数量减少，颗粒细胞排列疏松或脱落至卵泡边缘情况也得到相应的改善，并且以5 μmol/L丹参酮ⅡA组改善较为明显。
如表2所示，与新鲜组相比，其他4组卵巢内各级卵泡正常率与卵泡存活率均显著下降(P < 0.05)；与冷冻对照组相比，不同浓度丹参酮ⅡA组卵巢内各级卵形态正常率与卵泡存活率均显著升高(P < 0.05)，并与丹参酮ⅡA浓度呈正相关性，尤其以5 μmol/L丹参酮ⅡA组升高较为显著。
2.2 各组卵巢内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性及丙二醛水平比较氧化损伤是导致卵巢低温冻存后活性降低的主要因素之一，其中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及丙二醛是反映卵巢组织氧化应激的重要指标。如表3所示，与新鲜组相比，其他4组卵巢内超氧化物歧化酶及过氧化氢酶活性均显著降低(P < 0.05)，丙二醛水平显著升高(P < 0.05)；与冷冻对照组相比，不同浓度丹参酮ⅡA组卵

巢内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性及丙二醛水平均得到一定程度的改善，并且以5 μmol/L丹参酮ⅡA组改善更为显著。表明在低温冻存中添加丹参酮ⅡA能改善低温冻存卵巢组织的氧化应激损伤。
2.3 各组卵巢内肿瘤坏死因子α、白细胞介素17及白细胞介素1β水平比较卵巢组织经低温冻存后出现的炎症反应也是导致其活性降低的因素之一，其中肿瘤坏死因子α、白细胞介素17及白细胞介素1β是重要的炎症因子指标。如表4所示，与新鲜组相比，其他4组卵巢内肿瘤坏死因子α、白细胞介素17及白细胞介素1β水平均显著升高(P < 0.05)；与冷冻对照组相比，不同浓度丹参酮ⅡA组卵巢内肿瘤坏死因子α、白细胞介素17及白细胞介素1β水平均有所降低，并且以5 μmol/L丹参酮ⅡA组上述指标降低最显著。表明低温冻存容易诱发卵巢炎症反应，而丹参酮ⅡA作为冷冻保护剂能降低温冻存卵巢内炎症因子水平，从而实现保护作用。

2.4 各组卵巢内Nrf2和HO-1的mRNA表达比较如表5和图4所示，与新鲜组相相比，其他4组卵巢内Nrf2和HO-1 mRNA表达均下降(P < 0.05)；与冷冻对照组相比，不同浓度丹参酮Ⅱ组卵巢内Nrf2和HO-1 mRNA表达均升高，并且以5 μmol/L丹参酮ⅡA组升高最显著。
2.5 各组卵巢内Nrf2和HO-1蛋白表达比较如图5所示，与新鲜组相比，其他4组卵巢内Nrf2和HO-1蛋白表

达均下降(P < 0.05)；与冷冻对照组相比，不同浓度丹参酮ⅡA组卵巢内Nrf2和HO-1蛋白表达均升高，其中以
5 μmol/L丹参酮ⅡA组升高最为显著。

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引言

卵巢组织冷冻保存是辅助生殖领域的重要技术之一，能保存女性的生育力，尤其对于因癌症治疗可能会失去卵巢功能的育龄女性具有重要意义。据估计，中国每年需要生育力保护的女性超过200万[1]。近年来，有报道称玻璃化冷冻保存卵巢组织是一种快速、高效、低成本的技术，它将卵巢及其保护剂溶液在快速降温过程中由液相直接转变为玻璃状的固体，并在低温下长期贮存[2-3]。然而，超低温保存会对卵巢细胞结构和功能造成相应的破坏，在低温冻存条件下许多因素均有可能损伤卵子，包括氧化应激、炎症反应、冷休克、胞内冰晶形成等，导致卵巢复苏后活性降低甚至无法受孕[4-6]。
在氧化应激和炎症反应机制方面，核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid derived 2-like 2，Nrf2)是细胞抗氧化应激体系中的关键转录因子，也是细胞防御多种应激损伤的关键因子。在细胞受到氧化物或亲电子攻击时，Nrf2由胞浆转移至细胞核内参与抗氧化反应，并且Nrf2是诱导Ⅱ相酶基因表达的必须因子，Ⅱ相酶中的血红素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)对细胞具有抗氧化损伤的保护作用，二者是体内强有力的氧自由基清除剂[7]。当机体处于氧化应激状态时，Nrf2被激活后可诱导HO-1等保护基因的高效表达，参与抗氧化和抑制炎症反应，增加细胞对亲电子及活性氧的清除能力，从而发挥保护细胞的作用[8]。Nrf2/HO-1信号通路对机体氧化损伤和保护方面具有积极的正向作用，被认为是细胞内最重要的抗氧化应激损伤机制之一。
采用有效的低温保护剂可降低卵巢冷冻损伤、提高卵子存活率，但尚没有公认、统一的玻璃化冷冻保护剂。中药提取物在卵巢低温冻存领域发挥着重要作用[9-10]。其中，丹参酮ⅡA是从中药丹参中提取的一种脂溶性化合物(图1)，具有多种药理活性，包括抗氧化、抑制炎症反应、减少凋亡等[11]。丹参酮ⅡA作为卵巢组织玻璃化冷冻保护添加剂目前尚无相关文献报道。因此，此次实验探讨丹参酮ⅡA对小鼠卵巢组织玻璃化冷冻保存的保护作用及机制，为未来的生育力保存提供一种新的策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外观察实验，多组间比较采用One-Way ANOVA方差分析，两组间比较采用SNK检验。
1.2 时间及地点实验于2022年9月至2023年12月在广州中医药大学动物实验中心及北京中医药大学深圳医院(龙岗)生殖健康科实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6周龄雌性KM小鼠25只，SPF级，体质量(39.0±4.5) g，购自广东省医学实验动物中心[SCXK(粤)2018-0002]。小鼠饲养环境：温度22-24 ℃，湿度50%-70%，保持12 h光暗循环。实验方案已通过北京中医药大学深圳医院(龙岗)伦理委员会批准(伦理号：SZLDH2021LSYA-143)。
1.3.2 主要试剂及仪器丹参酮ⅡA(上海源叶生物科技有限公司)；二甲基亚砜、乙二醇、PBS、MEM-α培养液、M199培养基、蔗糖、聚蔗糖、胎牛血清均购自Sigma公司；苏木精-伊红染色试剂盒(Beyotime Biotech，中国)；超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、丙二醛、肿瘤坏死因子α、白细胞介素17及白细胞介素1β测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)；总RNA提取试剂盒(Beyotime Biotech，中国)；Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme，中国)；光学显微镜(Olympus，日本)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司，中国)；BioTek Synergy LX多功能微孔板检测仪(Agilent，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组与处理取卵巢前1 d所有小鼠禁食。腹腔注射0.5%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，头颈脱臼处死小鼠，采集卵巢组织切半处理，用MEM-α培养液洗涤，滤纸吸干卵巢上多余水分，随机分为新鲜组、冷冻对照组及0.5，2.5，5 µmol/L丹参酮ⅡA组，每组10个卵巢。新鲜组不进行低温冷冻保存，其他4组均进行低温冷冻保存。
冷冻对照组：参考既往文献[12]，先将卵巢先放入冷冻液A液(10 mg/mL牛血清白蛋白+10%乙二醇+10%二甲基亚砜+0.25 mol/L蔗糖+PBS)中4 min，取出；再放入冷冻液B液(10 mg/mL牛血清白蛋白+20%乙二醇+20%二甲基亚砜+0.25 mol/L蔗糖+18%聚蔗糖+PBS)中1 min，取出并放入冻存管内，加入1.5 mL冷冻液B液，封口，将冻存管置于液氮蒸气中5 min，最后放于液氮罐中储存。
各浓度丹参酮ⅡA组：先将卵巢放入冷冻液A液中4 min，取出；再放入冷冻液B液中1 min，取出并放入冻存管内，分别加入1.5 mL含0.5，2.5，5 µmol/L丹参酮ⅡA的冷冻液B液，封口，将冻存管置于液氮蒸气中5 min，最后放于液氮罐中储存。
冻存3 d后从液氮中取出冻存管，静置30 s，37 ℃水浴迅速解冻，然后室温下放入解冻液(0.5 moL/L 蔗糖+PBS)中复苏5 min，最后用PBS冲洗2遍，随即进行下一步检测。其中，苏木精-伊红染色的卵巢放入40 g/L多聚甲醛溶液内固定，用于试剂盒检测、RT-qPCR及Western blot检测的卵巢直接进行组织匀浆。
1.4.2 小鼠卵巢组织苏木精-伊红染色将各组卵巢组织进行常规固定、包埋后切片，切片厚度5-7 μm，于42 ℃温水中展开，脱蜡、水化，随后进行苏木精-伊红染色，在光学显微镜下(×200)统计正常形态及异常形态的原始和初级卵泡数。每隔6-8张切片取一张切片进行观察，各组分别取10张，每张切片任选5个视野根据卵泡形态的正常与否进行卵泡计数。参考GOUGEON[13]的标准，由2名研究人员在光学显微镜下观察并记录小鼠各级卵泡形态，研究人员不知晓实验分组情况。其中闭锁卵泡早期表现为部分卵泡细胞凋亡、透明带皱缩，后期表现为卵母细胞明显固缩、卵泡细胞凋亡严重、透明带塌陷。卵泡正常率=正常卵泡数/卵泡总数×100%。卵泡存活率= (原始卵泡+初级卵泡+次级卵泡)/(原始卵泡+初级卵泡+次级卵泡+闭锁卵泡)×100%。
1.4.3 小鼠卵巢组织氧化应激与炎症指标检测取各组卵巢组织称质量，参考各试剂盒说明书配置10%组织匀浆，按照组织质量(g)∶生理盐水(mL)=1∶9的比率加入1.5 mL离心管中，加入研磨珠，使用4 ℃预冷的组织研磨仪研磨，将研磨完成后的组织匀浆放到低温高速离心机中，4 ℃下2 500 r/min离心10 min后收集上清液，根据试剂盒说明书检测超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性以及丙二醛、肿瘤坏死因子α、白细胞介素17及白细胞介素1β水平。
1.4.4 小鼠卵巢内Nrf2/HO-1信号通路相关基因表达比较在引物库数据库和NCBI基因数据库上检索适合的引物序列，Nrf2与HO-1正反引物信息见表1。然后，将合成好的引物按照说明加入指定量的DEPC水，制成引物浓度为100 μmol/L的引物溶液，再用DEPC水稀释至10 μmol/L，并放于-20 ℃储存。

按照RNAeasy™动物RNA抽提试剂盒说明书操作，将各组小鼠卵巢组织并置于1.5 mL离心管中，加入裂解液，置于4 ℃预冷的研磨仪中研磨；研磨完成后室温放置5 min，置于低温高速离心机内12 000 r/min离心2 min，取上清液，采用RNA快速提取试剂盒提取上清液总RNA；取总RNA溶液，采用核酸蛋白分析仪测定RNA样本核酸的吸光度值和蛋白质的吸光度值，测定RNA浓度及纯度，经M5 Super qPCR RT kit with gDNA remover反转录得到cDNA，随后将cDNA进行荧光定量PCR扩增，通过2-ΔΔCt法计算各基因的表达量。
1.4.5 Western blot检测小鼠卵巢内Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达取小鼠卵巢组织称质量，液氮研磨，加入适量RIPA裂解液，2 500 r/min离心10 min后取上清，采用BCA法测量蛋白浓度。严格按照试剂盒说明书操作，制备蛋白样品，进行常规Western blot操作：配胶、电泳、转膜和封闭、一抗孵育(Nrf2稀释比1∶1 000；HO-1稀释比1∶500；GAPDH稀释比1∶1 000)、二抗孵育，通过ECL化学发光成像系统显影，使用Image J测量灰度值，检测各组卵巢Nrf2和HO-1蛋白的表达。
1.5 主要观察指标玻璃化冷冻液中添加不同浓度丹参酮ⅡA对小鼠卵巢低温冻存后卵泡形态及存活率、氧化应激及炎性因子指标以及Nrf2/HO-1信号通路的影响。
1.6 统计学分析应用SPSS 24.0统计软件分析数据，计数资料用率(%)表示，使用χ2检验进行分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用One-Way ANOVA方差分析，组间比较采用SNK检验。P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经广州中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

卵巢组织冻存主要用于保存不孕症、肿瘤放化疗患者及接触有毒害物质女性的生育能力，然而，低温冻存可能会对卵巢结构、卵子功能及卵泡形态等造成不可逆的损伤，如何最大程度恢复卵巢低温保存后的细胞活性是亟待解决的难题。玻璃化冻存是保存卵泡的一种简单有效的方法，极大地减少冰晶对细胞的损害，最小程度地破坏细胞结构[5，14-15]。常用的低温保护剂包括两大类：渗透性和非渗透性，渗透性保护剂包括二甲基亚砜、甘油、乙二醇、三羟甲基氨基甲烷等，均属于小分子化合物，能自由进入细胞内，提高胞内液体的黏滞系数和溶质浓度；非渗透性保护剂(蔗糖、乳糖、氨基乙酸、脂类等)有助于水从细胞质中渗出并保护膜的完整性，处理后的牛奶和蛋黄常作为膜修饰剂。不过，玻璃化冷冻常需要配合高浓度渗透性保护剂可能会导致细胞损伤和卵泡丢失等冷冻损伤[14-15]。因此，寻找新型玻璃化冷冻保护剂对保护卵巢组织具有重要意义。
丹参酮ⅡA是唇形科鼠尾革属植物丹参的提取物之一，具有抗氧化、抗炎、抗纤维化作用[12，16-21]，在生殖、神经系统、心血管系统、肿瘤等方面有广泛应用。秦文秀等[22]研究发现，丹参酮ⅡA通过调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、Nrf2、核因子κB等多条信号通路，抑制白细胞介素6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子α等关键炎性因子的活性，从而减轻细胞的缺血损伤。杨芳等[23]探究丹参酮ⅡA对糖尿病雄性大鼠生殖损伤的影响及其机制，发现丹参酮ⅡA组睾丸组织病理学改变明显改善，超氧化歧化酶、过氧化氢酶活性升高，丙二醛、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素8含量降低，并参与调节p38丝裂原活化蛋白激酶/核因子κB信号通路，认为丹参酮ⅡA可能通过降低氧化应激水平和炎症反应来减轻糖尿病雄性大鼠生殖损伤。然而，丹参酮ⅡA作为卵巢玻璃化冷冻保护剂的研究较少。此次实验对玻璃化冻存小鼠卵巢进行一项基础研究，探究丹参酮ⅡA对玻璃化冻存小鼠卵巢组织冻存的保护作用及可能的机制，卵巢组织苏木精-伊红染色结果显示：新鲜组原始卵泡及初级卵泡形态呈球卵圆形，在卵母细胞周围颗粒细胞排布均匀紧密；冷冻对照组各级卵泡形态畸形，颗粒细胞排列疏松或脱落；在冷冻保护剂中添加不同浓度丹参酮ⅡA后，部分各级卵泡形态呈球形，原始卵泡及初级卵泡核固缩数量减少，颗粒细胞排列疏松或脱落情况得到相应改善，表明丹参酮ⅡA对玻璃化冻存小鼠卵巢内卵泡的活性具有一定保护作用。
氧化应激和炎症反应是卵巢组织玻璃化冷冻损伤的主要原因之一[24-25]。细胞产生大量的氧自由基及炎症递质，出现氧化应激和炎症反应，导致内皮损伤，微血管通透性和组织肿胀，通过缺氧和增加细胞内 Ca2+浓度与细胞内核受体结合，启动细胞内凋亡或坏死信号[26]。这一过程会导致卵泡形态正常率下降，降低卵巢移植后的分泌功能，从而使生育力难以恢复[27-28]。在低温冻存方面，卵巢持续低温冷冻导致活性氧过度聚集，内源性抗氧化酶(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等)无法及时还原并清除，导致活性氧过剩，从而破坏生物膜结构生成丙二醛，并破坏蛋白质、核酸及多肽等生物大分子结构，造成卵巢组织氧化应激损伤。
多项基础研究表明，天然黄酮类化合物丹参酮ⅡA具有较强的抗氧化和抗炎症反应特性[20，29-32]。黄约诺等[33]探究了丹参酮ⅡA对脓毒症大鼠肺损伤的保护作用，发现高剂量丹参酮ⅡA组大鼠肺组织匀浆中丙二醛水平降低和超氧化物歧化酶活性升高，认为丹参酮ⅡA在脓毒症肺损伤大鼠中可起抗炎、清除氧自由基的保护作用。一项体外研究发现，丹参酮ⅡA可以增强线粒体生物能并有效减轻氧化损伤，发挥神经保护作用[34]。氧化应激能够刺激肿瘤坏死因子α、白细胞介素17及白细胞介素1β等炎症因子分泌，进而诱导炎症反应，肿瘤坏死因子α能趋化中性粒细胞聚集，白细胞介素17及白细胞介素1β促进炎症细胞浸润，加重炎症损伤。氧化应激和炎症反应常相伴而生，有学者将具有抗炎和抗氧化活性的谷胱甘肽+乌司他丁应用于冻融人卵巢组织移植中，结果显示两者能抑制卵巢内的氧化应激和炎症反应，改善移植后卵巢组织卵泡存活率和卵泡完整性[35]。此次实验结果发现，添加丹参酮ⅡA的低温冷冻保护剂能够明显提高玻璃化冻存小鼠卵巢内超氧化物歧化酶及过氧化氢酶活性，明显降低丙二醛、肿瘤坏死因子α、白细胞介素17及白细胞介素1β水平，提示丹参酮ⅡA能降低低温冷冻小鼠卵巢内的氧化应激和炎症反应。
Nrf2是广泛存在于细胞中的转录因子，其表达水平与氧化应激密切相关，能调节氧化应激及炎症因子水平，HO-1是血红素分解代谢过程中的限速酶，两者是细胞抗氧化应激体系中的关键转录因子，是机体强有力的氧自由基和炎症因子清除剂。多项研究表明，丹参酮ⅡA通过激活Nrf2信号通路发挥抗氧化应激及抑制细胞凋亡的作用[11，36-40]。丹参酮ⅡA能抑制Nrf2/抗氧化反应元件信号通路抑制抗氧化基因的表达，进而打破细胞内氧化稳态，诱导细胞凋亡。秦智等[38]发现丹参酮ⅡA能抑制大鼠非酒精性脂肪肝后肝细胞的铁死亡，下调肝组织活性氧含量，其作用与激活Nrf2信号通路有关。此次实验结果显示，丹参酮ⅡA可上调Nrf2 mRNA表达，并通过促使Nrf2信号核转位进而诱导HO-1表达升高，提示丹参酮ⅡA能够降低卵巢组织玻璃化冻存过程中的氧化应激和炎症反应，其作用机制可能与介导Nrf2/HO-1信号通路有关。
综上所述，此次实验结果表明，丹参酮ⅡA可能通过介导Nrf2/HO-1信号通路降低卵巢内氧化应激水平和炎症反应，从而减轻小鼠卵巢冷冻保存而出现的生殖损伤，为未来的生育力保存提供了一种新的策略。但是，丹参酮ⅡA作为冻存添加保护剂目前尚无统一的标准用量，大多数研究仅限于基础实验，丹参酮ⅡA运用于保存临床生育力任重而道远，未来应该深入研发丹参酮ⅡA作为冷冻保护剂的特性，进一步探索其分子机制，为保护低温冻存人类卵巢活性提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

丹参酮ⅡA对冷冻保存小鼠卵巢的保护机制

Protective mechanism of tanshinone IIA in mouse ovarian cryopreservation

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