基底膜相关基因在类风湿关节炎不同中医证型中的转录组学分析及药物预测

doi:10.12307/2025.505

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (25): 5486-5500.doi: 10.12307/2025.505

• 干细胞相关大数据分析 Stem cell-related big data analysis • 上一篇

基底膜相关基因在类风湿关节炎不同中医证型中的转录组学分析及药物预测

刘源1，渠源1，万雅坤2，郭婧宇3，姜萍1，4

山东中医药大学，1第一临床医学院，2康复医学院，3中医学院，山东省济南市 250014；4山东中医药大学附属医院，山东省济南市 250014

收稿日期:2024-03-12 接受日期:2024-04-22 出版日期:2025-09-08 发布日期:2024-12-30
通讯作者: 姜萍，博士，教授，主任医师，博士生导师，山东中医药大学第一临床医学院，山东省济南市 250014；山东中医药大学附属医院，山东省济南市 250014
作者简介:刘源，男，1994年生，山东省德州市人，汉族，山东中医药大学在读博士，从事中医药防治风湿免疫性疾病研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82274481，81874449)，项目负责人：姜萍；国家中医药管理局科技司共建科技项目(GZY-KJS-SD-2023-041)，
项目负责人：姜萍；山东省自然科学基金项目(ZR2022LZY004)，项目负责人：姜萍；齐鲁张氏风湿骨病中医药特色技术项目(鲁卫函[2022]93号)，项目负责人：姜萍

Transcriptomic analysis and drug prediction of basement membrane-related genes in different traditional Chinese medicine patterns of rheumatoid arthritis

Liu Yuan1, Qu Yuan1, Wan Yakun2, Guo Jingyu3, Jiang Ping1, 4

1First Clinical Medical College, 2College of Rehabilitation, 3College of Traditional Chinese Medicine, 4Affiliated Hospital, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China

Received:2024-03-12 Accepted:2024-04-22 Online:2025-09-08 Published:2024-12-30
Contact: Jiang Ping, MD, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, First Clinical Medical College, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China; Affiliated Hospital, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
About author:Liu Yuan, Doctoral candidate, First Clinical Medical College, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, Nos. 82274481, 81874449 (to JP); National Administration of Traditional Chinese Medicine Science and Technology Department Jointly Constructed Science and Technology Project, No. GZY-KJS-SD-2023-041 (to JP); Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2022LZY004 (to JP); Qilu Zhang’s Rheumatoid Bone Disease Traditional Chinese Medicine Specialty Technology Project, No. Luweihan [2022] 93 (to JP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

基底膜：是位于上皮细胞与其底层组织之间的一层特殊的细胞外基质。这层致密的蛋白质网络主要由层粘连蛋白、纤维连接蛋白、网状纤维蛋白和蛋白多糖组成，对细胞的附着、分化、迁移及屏障功能起着关键作用。
类风湿关节炎：是一种慢性自身免疫性疾病，主要特征为多关节持续性炎症，这种炎症通常影响手和脚的小关节。随着病情发展，关节的炎症可能导致关节结构的破坏和功能丧失，其症状包括关节疼痛、肿胀、僵硬和活动能力下降。

摘要
背景：基底膜基因与类风湿关节炎的发生发展密切相关，但不同中医证型下基底膜相关基因在其发病机制中的作用尚不明确。
目的：基底膜基因联合转录组学分析探讨类风湿关节炎5种不同中医证型的发病机制差异，并进行潜在治疗药物预测。
方法：基于GEO数据库整理类风湿关节炎相关中医证型芯片数据以及基底膜相关基因，利用R-limma包筛选差异表达基因，Mfuzz包进行表达趋势分析。借助STRING数据库构建PPI网络，UPset筛选关键基因，通过R-clusterProfiler包对差异表达基因进行GSEA及富集分析，同时绘制ROC曲线评估基底膜相关核心靶点对5种证型分别的诊断价值。基于CIBERSORT核心算法计算每种证型的免疫浸润情况。最后，利用SymMap和COREMINE数据库预测可靶向基底膜相关核心基因治疗类风湿关节炎不同证型的潜在中药及小分子药物。
结果与结论：①在5种类风湿关节炎中医证型中(风湿痹阻证、寒湿痹阻证、肝肾亏虚证、气血两虚证及血瘀阻络证)分别筛选出67，47，59，57，55个基底膜相关差异表达基因，其中关键靶点分别为5，7，5，3，5个。③各证型中富集最多的为细胞基质黏附、免疫细胞迁移及胶原代谢等生物过程以及细胞外基质受体相互作用、PI3K-Akt、局灶性粘连和Rap1信号通路等。④药物预测结果显示，土茯苓、川乌、绵马贯众及黄精是通过影响基底膜基因治疗5种类风湿关节炎中医证型最具潜力的中药。⑤结果证实，基底膜相关基因的异常表达可能是通过调控细胞附着、免疫细胞迁移及炎症反应等多个途径影响类风湿关节炎的发生和发展，在不同证型中有着差异表现，其中ITGA6可作为5种类风湿关节炎证型中共同的诊断标志物。清热解毒类中药可能是类风湿关节炎不同证型治疗中可以贯穿始终的潜在有效药物。

https://orcid.org/0000-0001-8961-4743 (刘源)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Abstract: BACKGROUND: Basement membrane genes are closely related to the occurrence and development of rheumatoid arthritis, but the role of basement membrane-related genes in the pathogenesis of rheumatoid arthritis under different traditional Chinese medicine patterns is not yet clear.
OBJECTIVE: To explore the differences in the pathogenesis of rheumatoid arthritis with five different traditional Chinese medicine syndromes based on the analysis of basement membrane-related genes and transcriptomics, and to predict potential therapeutic drugs.
METHODS: Rheumatoid arthritis-related traditional Chinese medicine syndrome microarray data and basement membrane-related genes were collected from the GEO database. The differentially expressed genes were screened using the R-limma package, and the expression trends were analyzed using the Mfuzz package. The protein-protein interaction network was constructed using the STRING database and key genes were selected using UPset. The differentially expressed genes were subjected to gene set enrichment analysis (GSEA) and enrichment analysis using the R-clusterProfiler package. Receiver operating characteristics curves were plotted to evaluate the diagnostic value of core basement membrane-related targets for each of the five syndromes. The immune infiltration of each syndrome was calculated using the CIBERSORT algorithm. Finally, potential traditional Chinese medicines and small molecule drugs targeting core basement membrane-related genes for the treatment of different traditional Chinese medicine syndromes of rheumatoid arthritis were predicted using SymMap and COREMINE databases.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) 67, 47, 59, 57, and 55 basement membrane-related differentially expressed genes were screened for the five traditional Chinese medicine syndromes of rheumatoid arthritis (obstruction syndrome, cold-dampness obstruction syndrome, liver-kidney deficiency syndrome, qi-blood deficiency syndrome, and blood stasis obstructing collaterals syndrome), with 5, 7, 5, 3, and 5 key targets identified, respectively. (2) The most enriched biological processes in each syndrome were extracellular matrix adhesion, immune cell migration, collagen metabolism, and extracellular matrix receptor interaction, PI3K-Akt, focal adhesion, and Rap1 signaling pathways. (3) According to the predictions, Smilax glabra, Sargentodoxa cuneata, and Polygonatum sibiricum have the most potential as traditional Chinese medicines for the treatment of the five traditional Chinese medicine syndromes of rheumatoid arthritis by affecting basement membrane-related genes. (4) These results indicate that abnormal expression of basement membrane-related genes may affect the occurrence and development of rheumatoid arthritis through the regulation of cell adhesion, immune cell migration, and inflammatory reactions, among other pathways. These effects vary among different syndromes, with ITGA6 serving as a common diagnostic marker for the five traditional Chinese medicine syndromes of rheumatoid arthritis. Traditional Chinese medicines with heat-clearing and detoxifying properties may be potential effective drugs for the treatment of different syndromes of rheumatoid arthritis.

Key words: basement membrane-related gene, phenotype, rheumatoid arthritis, traditional Chinese medicine, transcriptomics analysis, GSEA analysis, immune infiltration, molecular docking, drug prediction, mechanism study

中图分类号:

刘源, 渠源, 万雅坤, 郭婧宇, 姜萍. 基底膜相关基因在类风湿关节炎不同中医证型中的转录组学分析及药物预测[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(25): 5486-5500.

Liu Yuan, Qu Yuan, Wan Yakun, Guo Jingyu, Jiang Ping. Transcriptomic analysis and drug prediction of basement membrane-related genes in different traditional Chinese medicine patterns of rheumatoid arthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(25): 5486-5500.

图/表（结果） 15

2.1 数据预处理及筛选基底膜相关DEGs 通过文献共获得基底膜相关基因226个，与GSE205962数据集中5种类风湿关节炎中医证型筛选出的DEGs分别取交集，共获得67(RA_FSBZ)，47(RA_HSBZ)，59(RA_GSKX)，57(RA_QXLX)及55(RA_XYZL)个基底膜相关DEGs，具体DEGs信息见表1。研究流程见图1。相关差异基因聚类图见图2。
对基底膜相关的DEGs在各证型中的表达趋势进行了预测分析，结果发现在RA_FSBZ，RA_GSKX及RA_QXLX中与健康对照组相比，其基底膜相关DEGs的表达呈现高表达趋势，而在RA_XYZL中呈现低表达趋势，而RA_HSBZ中表达趋势不明显，见图3。

2.2 GSEA与富集分析结果 运用R语言进行GSEA分析，结果以adj.P < 0.05，FDR(qvalue) < 0.25为条件筛选显著富集条目，并将富集显著条目以山峦图进行可视化。RA_FSBZ相关基因集主要富集在mRNA剪接、ROBO受体信号传导等反应途径；RA_HSBZ相关基因集主要富集在B细胞受体信号传导、线粒体翻译等反应途径；RA_GSKX相关基因集主要富集在FCERI介导的和转录因子κB激活反应途径及TCR等信号通路；RA_QXLX相关基因集主要富集在自然杀伤细胞介导的细胞毒作用、T细胞受体等信号通路；RA_XYZL相关基因集主要富集在FcεRI介导的核转录因子κB激活、RUNX3表达和活性的调控等。综合各证型结果发现，5种不同证型的类风湿关节炎基因集主要集中于免疫调控、炎症细胞反应和信号转导等反应途径及通路，见图4。

GO富集分析结果显示，5种类风湿关节炎中医证型分别筛选出(adj.P < 0.05)227(RA_FSBZ)，104(RA_HSBZ)，109(RA_GSKX)，185(RA_QXLX)及66(RA_XYZL)条生物学过程(biological processes，BP)，基底膜相关DEGs大多富集于细胞基质黏附、免疫细胞迁移及胶原代谢等生物学过程。KEGG富集结果显示(adj.P < 0.05)，基底膜相关DEGs主要富集于ECM受体相互作用、PI3K-Akt、局灶性粘连和Rap1等免疫相关信号通路。其中RA_FSBZ共获得21条KEGG通路，RA_HSBZ共获得36条KEGG通路，RA_GSKX共获得16条KEGG通路，RA_QXLX共获得43条KEGG通路，RA_XYZL共获得22条KEGG通路。选取富集倍数前15的条目绘制聚类树，并计算Zscore值以弦图可视化，见图5，6。

2.3 构建PPI网络及筛选出关键hub基因 依次将5种类风湿关节炎证型的基底膜相关DEGs(67，47，59，57，55个)导入STRING数据库，得到各证型PPI网络，见图7。拓扑分析后借助cytoHubba插件，通过MCC，MNC，Degree值和Closeness等4种计算方法筛选出关键hub基因，其中RA_FSBZ共得到5个关键hub基因；RA_HSBZ得到7个关键hub基因；RA_GSKX得到5个关键hub基因；RA_QXLX得到3个关键hub基因；RA_XYZL共得到5个关键hub基因，见图7。将各证型筛选得到的hub基因整合，详细信息见表2。

2.4 免疫浸润与ROC分析结果 免疫浸润分析显示，与健康人相比，类风湿关节炎风湿痹阻证患者外周全血中调节性T细胞、CD8+T细胞、静息状态的自然杀伤细胞、M0巨噬细胞、激活的树突状细胞和中性粒细胞显著升高(P < 0.01)；类风湿关节炎寒湿痹阻证患者外周全血中CD4+T细胞、调节性T细胞、激活的自然杀伤细胞、M0巨噬细胞和激活的树突状细胞较健康人相比显著升高(P < 0.01)；类风湿关节炎肝肾亏虚证患者外周全血中CD8+T细胞、调节性T细胞、激活的自然杀伤细胞、静息状态的自然杀伤细胞和激活的树突状细胞较健康人相比显著升高(P < 0.01)；类风湿关节炎气血两虚证患者外周全血中辅助性T细胞、CD4+T细胞、调节性T细胞、静息状态的自然杀伤细胞及激活的肥大细胞较健康人相比显著升高(P < 0.01)；类风湿关节炎瘀血阻络证患者外周全血中单核细胞、激活的树突状细胞及中性粒细胞较健康人相比显著升高(P < 0.01)。综合分析发现，调节性T细胞、激活的树突状细胞、自然杀伤细胞是类风湿关节炎患者外周血中较为活跃的免疫细胞，见图8，9。

文章对5种类风湿关节炎中医证型中各自筛选出的关键hub基因进行ROC分析，以此来评估hub基因对类风湿关节炎各证型潜在的诊断价值。AUC越接近于1，说明该变量在预测结局上诊断效果越好，目前普遍认为AUC值> 0.7时，该靶标存在诊断价值；AUC值> 0.85时，该靶标存在较高诊断价值[13]。ROC结果见图10，RA_FSBZ中有4个关键hub基因AUC值> 0.7，其中整合素α5(ITGA5；AUC值=1.000)、整合素α6(ITGA6；AUC值=1.000)、层粘连蛋白A5(LAMA5；AUC值=1.000)对该证型具有较高潜在诊断价值；RA_HSBZ中有7个关键hub基因AUC值> 0.7，其中ITGA5(AUC值=1.000)，ITGA6(AUC值=1.000)，ITGB5(AUC值=1.000)，ITGA4(AUC值=1.000)，LAMA5(AUC值=1.000)及LAMA3(AUC值=1.000)对该证型具有较高潜在诊断价值；RA_GSKX中有5个关键hub基因AUC值>
0.7，其中CD44(AUC值=1.000)和MMP14(AUC值=0.875)对该证型具有较高潜在诊断价值；RA_QXLX中有3个关键hub基因AUC值> 0.7，其中ITGA6(AUC值=0.938)和VTN(AUC值=0.875)对该证型具有较高潜在诊断价值；ERA_YXZL中有5个关键hub基因AUC值> 0.85，关键hub基因均对该证型具有较高潜在诊断价值。综合分析发现，各证型关键hub中均有ITGA6存在，且AUC值均大于0.7，说明ITGA6可作为类风湿关节炎诊断的新型潜在生物标志物。

2.5 类风湿关节炎不同中医证型中靶向基底膜相关基因的潜在治疗药物预测与小分子验证结果 将5种类风湿关节炎中医证型中各自关键hub基因以此输入到SymMap数据库中，共计预测出207味相关中药。其中频次≥3的中药共计23味，各证型详细药物信息见表3。综合频次≥3的中药及关键hub基因，绘制关系网络图，见图11。拓扑分析发现，网络中频次前5位的中药为土茯苓、川乌、绵马贯众、黄精及黄芪，可分别靶向8，6，6，6，5个基底膜相关类风湿关节炎关键hub基因，是能够靶向调控基底膜相关基因治疗类风湿关节炎最有潜力的中药。通过对207味中药功效的分析统计，发现对于治疗不同类风湿关节炎证型的潜在预测中药，主要以清热解毒药为主。因此推测清热解毒类中药可能是类风湿关节炎不同证型治疗中可以贯穿始终的潜在有效药物，见图11。
通过COREMINE数据库分别对5种类风湿关节炎证型的关键hub基因联合预测，共筛选得到209种小分子药物(P < 0.05)，选取每种证型中预测得到的显著性最高的小分子与类风湿关节炎潜在生物标志物ITGA6进行分子对接模拟，结果见表4。除
Methylselenocysteine(甲基硒半胱氨酸)外，其余小分子与ITGA6均显示出良好的对接效果(结合热能均小于-20 933.99 J/mol)，具有稳定的氢键结构形成，见图12。使用Discovery Studio (v4.5)软件进行对接模式构象。

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引言

类风湿关节炎是一种多因素引起的全身性自身免疫疾病，其病理特征为慢性、进展性关节炎，可导致关节结构破坏和功能丧失[1]。类风湿关节炎的发病机制尚不明确，但研究表明免疫调节异常、遗传因素、环境触发因素及其相互作用均与类风湿关节炎的发展有关[2]。尽管近年来生物制剂的引入显著改善了类风湿关节炎患者的治疗效果，但费用高及潜在不良反应依旧限制了现有疗法的广泛应用。最近研究发现，在类风湿关节炎的病理过程中，基底膜起到了关键作用[3]。基底膜是一种薄而致密的纤维蛋白质层，位于上皮细胞与底层组织之间，对细胞附着、迁移和分化均有影响[4]。而在类风湿关节炎中，基底膜的完整性受到破坏，这些改变有可能与基底膜相关基因的表达异常有关[3]。了解这些关联基因的表达模式对于探索类风湿关节炎的病理过程具有重要意义。
中医学作为中国传统医学的重要组成部分，对类风湿关节炎拥有独特的诊治方法。中医将类风湿关节炎划分为不同的证型，每种证型代表着身体不同的病理状态和不平衡模式。根据中医理论，不同证型的类风湿关节炎患者应采取不同的治疗方案，以达到调和阴阳、气血流通的效果。然而，中医证型的划分通常基于患者的临床症状和体征，缺乏分子生物学层面的客观评价指标。目前，尚未有研究从基底膜相关基因角度探索对类风湿关节炎不同中医证型的影响机制。随着转录组学技术的发展，通过分析不同中医证型类风湿关节炎患者的基底膜相关基因表达差异，可以更深入地理解类风湿关节炎的病理机制，为中医证型的科学化和客观化评价提供新的视角。此外，基于转录组数据的药物预测不仅有望发现新的治疗靶点，更为个性化医疗和精准医疗提供可能[5]。同时，随着研究的深入，为未来从组织工程方面开发新型生物载体类风湿关节炎靶向药物提供了新的思路。
基于以上背景，课题组通过探究基底膜相关基因在不同中医证型的类风湿关节炎患者中的表达模式，并借助现代分子生物学技术和生物信息学方法，进行转录组学分析和药物靶点预测，以期为从基底膜基因角度治疗类风湿关节炎不同中医证型提供理论支撑。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 类风湿关节炎不同中医证型生物信息学及转录组分析，并进行相关药物预测与分子对接验证。
1.2 时间及地点 于2023年12月至2024年3月在山东中医药大学第一临床医学院完成。
1.3 资料 从Gene Expression Omnibus数据库(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中检索与类风湿关节炎不同中医证型相关的数据集，筛选标准定义为：人类全血样本；样本信息完整且总样本量≥6个。最终得到数据集GSE205962(GPL16043平台，GeneChip® PrimeView™ Human Gene Expression Array)[6]，该数据集共包含20个类风湿关节炎患者全血样本，其中风湿痹阻证(RA_FSBZ)样本3个、寒湿痹阻证(RA_HSBZ)样本3个、肝肾亏虚证(RA_GSKX)样本3个、气血两虚证(RA_QXLX)样本4个、血瘀阻络证(RA_XYZL)样本3个，健康对照样本4个，均作为实验集。利用R语言(v4.3.1)中limma包对数据集进行背景校正及归一化处理[7]，得到各证型相关表达矩阵，同时以adj.P < 0.05，|log2 fold change (logFC)|≥1为条件筛选差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)。基底膜相关基因信息表从文献[8]中获取并进行整理，共计得到226个基底膜相关基因。利用Venn图法分别与类风湿关节炎相关5种证型的DEGs取交集，得到基底膜相关DEGs，并使用R语言Mfuzz包模糊c均值聚类对其进行表达趋势分析。
1.4 方法
1.4.1 GSEA分析及富集分析 利用R包“clusterProfiler[9]”“org.Hs.eg.db”“msigdbr”对类风湿关节炎 5种中医证型进行GSEA分析，参考基因集设定为：c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt。以adj.P < 0.05及FDR(qvalue) < 0.25为条件筛选显著富集条目。使用clusterProfiler包及GOplot包进行基因本体论(gene ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，同时计算Zscore值，以adj.P < 0.05为条件筛选富集显著的GO条目及KEGG通路。
1.4.2 蛋白互作网络的构建及关键靶点筛选 将筛选出的类风湿关节炎 5种中医证型基底膜相关DEGs分别导入STRING 12.0数据库(https://string-db.org)，物种选择“Human”，高等置信度得分设定为> 0.7，以确保分析结果的准确性和相关性。这一高置信度标准帮助课题组构建出可靠的蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络，从而揭示这些基因在病理过程中可能的互作和功能关系。结果保存为“TSV”格式，将导出的“TSV”格式文件输入Cytoscape 3.10.1软件中，进行PPI网络优化。拓扑分析后使用cytoHubba插件，选择MCC，MNC，Degree值和Closeness等4种计算方法来筛选关键hub基因。
1.4.3 免疫浸润分析及关键hub基因的诊断价值分析 为观察类风湿关节炎患者5种不同中医证型分别在免疫细胞中的浸润情况，通过CIBERSORT(CIBERSORT.R脚本分析)核心算法，利用CIBERSORTx网站(https://cibersortx.stanford.edu/)提供的22种免疫细胞的markers来计算5种证型中两组样本免疫浸润情况差异。使用R语言ggplot2包绘制对比箱式图及丰度堆积图进行可视化[10]。ROC曲线图是反映敏感性与特异性之间关系的曲线。曲线下的面积(area under curve，AUC)常用于诊断试验的评估，AUC取值范围一般在0.5和1之间，AUC越接近于1，说明该变量在预测结局上诊断效果越好。使用R语言pROC包对5种不同证型中的关键hub基因数据进行ROC分析[11]，结果用ggplot2包进行可视化。
1.4.4 基底膜相关的类风湿关节炎不同中医证型潜在治疗药物预测及小分子验证 将每种证型中筛选出的关键hub基因分别输入至SymMap数据库(http://www.symmap.org/)[12]，筛选条件为：P < 0.05，FDR < 0.05，得到可潜在靶向治疗关键hub基因的中药，并对得到的数据进行分析统计。按照类风湿关节炎不同证型筛选出的关键hub基因，分证型依次输入至COREMINE数据库(https://coremine.com/medical/)，以P < 0.05为条件筛选出每种证型显著性最高的潜在治疗小分子。Chem3D(19.0版本)对小分子进行力学优化，随后将小分子化合物导入AutoDockTools(1.5.6版本)中进行判断可旋转键并保存为“PDBQT”格式文件。从RCSBPDB数据库(http://www.rcsb.org)下载核心靶蛋白3D结构，利用PyMOL(2.3.0版本)去除水分和多余小分子配体。将处理好的受体蛋白导入AutoDockTools(1.5.6版本)中加氢、计算电荷、添加原子类型并保存为“PDBQT”文件。借助AutoDock Vinna进行分子对接验证，同时使用Discovery Studio (v4.5)进行结果构象。
1.5 主要观察指标 基底膜相关基因在类风湿关节炎不同中医证型中的表达差异。

1.6 统计学分析 数据满足正态分布，采用x±s表示，组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

基底膜的完整性由多种成分和相关基因调节，是稳定关节结构与功能的关键[14]。近期研究揭示，类风湿关节炎的发病机制与基底膜的结构异常及其相关基因表达紧密相关。在类风湿关节炎进程中，基底膜相关基因的异常通常与自身免疫反应及慢性炎症环境有关，导致基底膜成分如Ⅳ型胶原蛋白和层粘连蛋白的分解增加，是类风湿关节炎病理过程中滑膜充血、侵蚀性关节损害的关键因素[15-16]。这种破坏过程由基底膜成分特异性的自身抗体介导，这些抗体可直接诱发免疫复合物的沉积，同时激活补体系统，并通过吸引中性粒细胞和巨噬细胞等炎症细胞，引发细胞因子和金属蛋白酶的过度释放，进一步加剧关节破坏[17]。此外，与基底膜相关的信号通路异常，如β1整联蛋白亚型的改变，可能导致细胞黏附失调，加重滑膜炎症和软骨侵蚀[18]。最新的基因敲除模型研究更是提示，基底膜蛋白丧失不仅影响关节结构，还可能通过影响免疫细胞的浸润和活性，间接参与类风湿关节炎的免疫异常[19]。类风湿关节炎的另一个特征是关节和周边软组织的破坏，这在很大程度上由于炎症因子刺激下的基质金属蛋白酶(如基质金属蛋白酶14)的过度表达导致，这些酶可以分解基底膜的关键组成部分，如层粘连蛋白和胶原蛋白，导致基底膜结构的破坏和组织完整性的丧失，进而加重关节组织破坏进程[20]。因此，基底膜相关基因的研究不仅有助于阐明类风湿关节炎的疾病机制，也为发现新的治疗靶点提供了可能。对于临床诊疗，通过分析类风湿关节炎不同中医证型的基底膜相关基因表达模式，可以为制定个性化的中西医治疗方案和精准医疗提供理论支撑，从而提高类风湿关节炎的治疗效果，提高“减毒增效”优势，改善患者生活质量。
实验通过整理并分析关于类风湿关节炎各中医证型的芯片数据集，以及与基底膜相关的基因。分别从不同证型中筛选出67，47，59，57和55个与基底膜相关DEGs。关键靶点基因数量分别为5，7，5，3和5个。这些关键DEGs主要参与了细胞基质黏附、免疫细胞迁移、胶原代谢等与免疫有关的生物过程，以及细胞外基质受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、局灶性粘连和Rap1等炎症相关的生物通路。综合各证型筛选出的关键hub基因，共获得15个关键hub，其中ITGA6，ITGA5，LAMA5，LAMC2，LAMA4，ITGB3，ITGB5，LAMA3，ITGAV，MMP14，CD44在各证型中均呈现上调表现，ITGA4，VTN，ITGA2B，COL4A2在各证型呈现下调表现。
近年来，ITGA6在类风湿关节炎的发病机制中的作用日益受到关注。ITGA6作为细胞外基质与细胞相互作用的重要介质，具有调控细胞黏附、免疫传导和细胞分化等多种生物学功能[20]。最新研究发现，ITGA6水平在类风湿关节炎患者的滑膜细胞中显著升高，并与疾病的严重程度相关联[21]。此外，实验性关节炎模型中，ITGA6抑制剂的使用能够减轻关节炎的症状，减缓关节损伤的进展[22]。在此研究中，ITGA6是各证型中共有的关键hub基因，这表明ITGA6不仅可以作为类风湿关节炎炎症活性的生物标志物，也为类风湿关节炎的治疗提供了一个新的潜在靶点。ITGA5是一种细胞黏附因子，属于整合素家族的一部分。研究显示，ITGA5能够与纤维连接蛋白相互作用，进而促进成纤维细胞样滑膜细胞迁移至炎症部位，侵入并破坏关节结构[23]。ITGAV是一种细胞表面的受体，与多种胞外基质蛋白相结合，参与调控炎症、免疫反应以及细胞迁移等过程[24]。最新研究指出，ITGAV在类风湿关节炎患者的关节滑膜细胞以及成纤维细胞样滑膜细胞中表达水平升高，并且与炎症反应的维持和关节组织的侵袭性紧密相关[25]。研究发现，通过靶向ITGAV的等位基因可以抑制成纤维细胞样滑膜细胞的侵袭性，减轻炎症反应，具有潜在的治疗作用[26]。LAMA5，LAMC2，LAMA4及LAMA3均属于层粘连蛋白。研究发现，层粘连蛋白能够通过影响前炎性细胞因子的释放，如白细胞介素1β和白细胞介素17，从而影响免疫调节，在类风湿关节炎早期阶段可能起到关键作用[27]。此外，层粘连蛋白不仅在局部关节炎症反应中有重要作用，还可能通过影响循环免疫复合物的沉积，间接参与类风湿关节炎患者心血管等其他合并症的发展[28]。
基质金属蛋白酶14是金属蛋白酶家族中的一员，具有在细胞表面降解细胞外基质的功能[29]。研究发现，基质金属蛋白酶14的表达在类风湿关节炎患者的滑膜组织和关节液中均有上调，尤其是在侵袭性成纤维细胞样滑膜细胞中更为显著[30]。成纤维细胞样滑膜细胞能通过释放基质金属蛋白酶14破坏关节周围的软骨和骨结构，导致关节疼痛、肿胀和功能丧失。有研究显示，通过小分子抑制剂减少基质金属蛋白酶14的活性，可以显著减轻胶原诱导型大鼠关节严重程度[31]。这暗示基质金属蛋白酶14可能是类风湿关节炎治疗的潜在新靶点。CD44是一种细胞表面糖蛋白，它参与细胞-细胞和细胞-基质的相互作用。研究表明，CD44与类风湿关节炎炎症环境中的多种途径相互作用，尤其是在促进炎症细胞浸润、滑膜增生和软骨破坏中的作用[32]。CD44的主要配体是透明质酸，而透明质酸的积聚在类风湿关节炎关节液中是一个显著特征。在类风湿关节炎患者中，过量的透明质酸与CD44结合，促进了炎症细胞，尤其是巨噬细胞和T细胞的迁移和滞留[33]。此外，CD44参与激活MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)、核转录因子κB等信号通路，调控关节中的炎症和免疫反应[34]。根据关键hub基因的作用和调控路径，开发靶向这些基因的治疗方案。包括根据预测出的潜在中药开发新的中药复方，或者在现有的药物基础上进行优化和调整，使其更好地针对特定的基因表达模式。
为了进一步探究免疫细胞浸润在类风湿关节炎进展中的作用机制，对不同证型之间的样本进行了免疫浸润分析。调节性T细胞(Treg)、活化的树突状细胞和自然杀伤细胞(NK)的异常活化是类风湿关节炎免疫病理生理过程中的关键因素。Treg是维护机体免疫稳态和免疫耐受的重要细胞群，但在类风湿关节炎患者体内，Treg的免疫调节功能可能受损，致使自身免疫反应失控[35]。树突状细胞则是抗原呈递的力量，它们能够激活免疫响应，增强T细胞的免疫监视能力。在类风湿关节炎患者中，树突状细胞的激活可能促使炎症反应加剧[36]。自NK细胞作为天然的免疫细胞，在清除已感染和转化的细胞方面发挥作用，但在类风湿关节炎中，NK细胞过度的活化可能导致对自身组织产生损害[37]。对于关键炎症递质和信号途径的探析，发现与这些免疫细胞密切相关，尤其是Treg的功能性变化与类风湿关节炎关节炎症进程显著相关。当前治疗类风湿关节炎的策略正朝着靶向调节免疫细胞和信号途径方向发展。对Treg功能缺陷的修复、树突状细胞激活状态的调控以及NK细胞活性的平衡，都是潜在的治疗方向。
类风湿关节炎在中医学中归属于“痹证”之类，由于风湿邪气侵袭关节导致气血瘀阻，经脉血络不通，形成痹阻。中医学观点认为，肝肾虚损，脏腑功能失调为类风湿关节炎的病理基础，治疗上应扶正祛邪、调和脏腑。近年研究发现，中草药能够通过调节免疫反应、抑制炎症递质生成以及改善血液微循环等多途径对类风湿关节炎产生良好的治疗效果。基于此，中医药调控基底膜相关基因表达可能对于类风湿关节炎特别是当前生物治疗无响应的患者提供了新的治疗思路，同时也为类风湿关节炎未来治疗提供新的可能。在此研究药物预测中，频次出现最多的前5名为土茯苓、川乌、绵马贯众、黄精和黄芪。土茯苓是治疗关节炎的常用中药，具有解毒除湿、通利关节的功效。研究表明，土茯苓能够通过抑制炎症细胞因子如肿瘤坏死因子α及白细胞介素6等的产生，以及通过阻断核转录因子κB信号通路来减轻滑膜炎症和关节破坏[38]。此外，土茯苓中的有效成分如黄酮类和皂苷，已被证实能减少关节区域的炎症细胞浸润和关节软骨破坏[39]。川乌，气微、味辛辣，具有祛风除湿、温经止痛的功效，是治疗风寒湿痹导致局部疼痛的常用药。最新研究表明，川乌提取物能够降低类风湿关节炎模型小鼠的关节肿胀和炎症细胞浸润[40]。此外，川乌还可降低Th17细胞和促炎性细胞因子的表达，调节免疫反应[41]。黄芪所含的皂甙成分被认为可以抑制炎症细胞因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的释放，从而减轻关节炎症[42]。一项随机对照试验显示，黄芪提取物与传统抗风湿药物联用能够提高治疗效果，改善患者的症状和生活质量[43]。后续研究中，可以结合中药土茯苓、川乌、绵马贯众、黄精和黄芪的主要活性成分，通过现代药理学研究，分析这些成分对上述关键hub基因的调控作用，在分子水平上解释这些中药的作用机制，实现临床转化应用。功效统计分析发现，预测出的中药大多属于清热解毒类中药，这与全国名中医张鸣鹤教授“清热解毒法治疗痹症”的学术观点相吻合，张老认为热毒是类风湿关节炎的主要病机，最早提出“清热解毒法”为主治疗类风湿关节炎的新思路[44]。
综上所述，此研究所筛选出的关键hub基因及生物途经主要涉及细胞基质黏附、免疫细胞迁移、胶原代谢、细胞外基质受体相互作用、PI3K-Akt及局灶性粘连等方面。基底膜相关基因异常表达影响了细胞外基质的黏附的过程，并使得免疫细胞如T细胞和巨噬细胞对关节组织定向移动，同时在局部环境中促进炎症因子的产生与释放，从而导致类风湿关节炎进展。在此研究中，ITGA6作为细胞与基底膜互动的重要介质，在5种类风湿关节炎不同中医证型中均呈现为关键hub基因，且ROC分析均表现出较高的诊断价值，暗示其在类风湿关节炎的病理机制中扮演着至关重要的角色，可能是潜在的新型诊断标志物。清热解毒类中药可能是类风湿关节炎不同证型治疗中可以贯穿始终的潜在有效药物。此研究为基于基底膜相关基因的治疗策略在类风湿关节炎中医证型的科学化和客观化评价提供新的视角，并为类风湿关节炎治疗提供了新可能性，包括精准治疗、治疗效果改善以及提高生活质量。但由于生物信息学存在局限性，仅从转录组学及分子角度进行了浅析，样本量较小，后续还应通过大量基础实验验证，使得研究结果在类风湿关节炎不同中医证型的应用更具临床意义。未来研究方向应着眼于基因表达与类风湿关节炎临床表现的关联研究、药物开发和优化、组合治疗策略的探索等。多学科联动推动基因学、药物学、免疫学、组织工程学及临床医学等多学科的合作，以全面理解和利用基因信息，提高类风湿关节炎的临床治疗效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

基底膜相关基因在类风湿关节炎不同中医证型中的转录组学分析及药物预测

Transcriptomic analysis and drug prediction of basement membrane-related genes in different traditional Chinese medicine patterns of rheumatoid arthritis

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