钛表面多酚介导铜离子涂层制备及抗菌抗氧化性能

doi:10.12307/2025.417

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (10): 1997-2005.doi: 10.12307/2025.417

• 抗菌抗病毒材料 antibacterial and antiviral materials • 上一篇下一篇

钛表面多酚介导铜离子涂层制备及抗菌抗氧化性能

官振菊1，2，谢永林2，向守刚3，张成栋1，李小龙1，李兴平3，蒲超4，张波4，罗栩伟4，肖东琴1

川北医学院第二临床学院·南充市中心医院，1组织工程与干细胞研究所，2口腔科，4骨科，四川省南充市 637000；3成飞医院骨科，四川省成都市 610031

收稿日期:2024-01-11 接受日期:2024-03-23 出版日期:2025-04-08 发布日期:2024-08-20
通讯作者: 通讯作者：肖东琴，博士，副研究员，川北医学院第二临床学院·南充市中心医院组织工程与干细胞研究所，四川省南充市 637000 通讯作者：谢永林，硕士，主任医师，川北医学院第二临床学院·南充市中心医院口腔科，四川省南充市 637000
作者简介:官振菊，女，1993年生，宁夏回族自治区吴忠市人，川北医学院在读硕士，主要从事口腔修复和种植研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82002289)，项目负责人：肖东琴；四川省自然科学基金项目(2022NSFSC0685)，项目负责人：肖东琴；四川省自然科学基金项目(2022NSFSC0609)，项目负责人：罗栩伟；四川省自然科学基金项目(2023NSFSC1740)，项目负责人：张成栋；四川省医学科研课题计划项目(Q22061)，项目负责人：蒲超；四川省医学科研课题计划项目(Q22034)，项目负责人：李兴平；南充市市校合作科研项目(22SXJCQN0002)，项目负责人：肖东琴；南充市市校合作科研项目(22SXQT0386)，项目负责人：谢永林；南充市市校合作科研项目(22SXQT0310)，项目负责人：张波

Preparation of polyphenol-mediated copper ion coating on titanium surface and antibacterial and antioxidant properties

Guan Zhenju1, 2, Xie Yonglin2, Xiang Shougang3, Zhang Chengdong1, Li Xiaolong1, Li Xingping3, Pu Chao4, Zhang Bo4, Luo Xuwei4, Xiao Dongqin1

1Research Institute of Tissue Engineering and Stem Cells, 2Department of Stomatology, 4Department of Orthopedics, Nanchong Central Hospital · Second Clinical College of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; 3Department of Orthopedics, Chengfei Hospital, Chengdu 610031, Sichuan Province, China

Received:2024-01-11 Accepted:2024-03-23 Online:2025-04-08 Published:2024-08-20
Contact: Corresponding author: Xiao Dongqin, MD, Associate researcher, Research Institute of Tissue Engineering and Stem Cells, Nanchong Central Hospital · Second Clinical College of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China Corresponding author: Xie Yonglin, Master, Chief physician, Department of Stomatology, Nanchong Central Hospital · Second Clinical College of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China
About author:Guan Zhenju, Master candidate, Research Institute of Tissue Engineering and Stem Cells, and Department of Stomatology, Nanchong Central Hospital · Second Clinical College of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82002289 (to XDQ); Sichuan Natural Science Foundation Project, No. 2022NSFSC0685 (to XDQ); Sichuan Natural Science Foundation Project, No. 2022NSFSC0609 (to LXW); Sichuan Natural Science Foundation, No. 2023NSFSC1740 (to ZCD); Sichuan Medical Research Project, No. Q22061 (to PC); Sichuan Medical Research Project, No. Q22034 (to LXP); Nanchong City School Cooperation Research Project, No. 22SXJCQN0002 (to XDQ); Nanchong City School Cooperation Research Project, No. 22SXQT0386 (to XYL); Nanchong City School Cooperation Research Project, No. 22SXQT0310 (to ZB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
细菌生物膜：附着在表面或聚集在细胞外基质中的固着、复杂细菌群落。细菌附着在钛植入体表面会在植入体周围形成有利于细菌生长的生物膜，生物膜感染会导致植入体松动、移位甚至脱落。
活性氧：含有氧自由基的高活性物质，主要包括羟基自由基、超氧化物和过氧化物。

背景：钛植入体因比强度高及良好的生物相容性被广泛应用于临床，然而在植入手术过程中，细菌感染及组织受损环境产生大量活性氧物质易导致组织延迟愈合与手术失败，因此开发具有抗菌和抗氧化性能的钛植入体极为重要。
目的：鉴于铜离子良好的抗菌性能及多酚类物质优良的抗氧化性能，拟在钛表面制备多酚介导的铜离子涂层，评价其体外抗菌及抗氧化性能。
方法：利用碱热法在钛表面制备纳米结构，然后将钛片置于单宁酸及铜离子溶液中，获得多酚介导的铜离子涂层，检测样品的表面形貌与水接触角，利用原子吸收光谱法检测铜离子的携载及释放。将金黄色葡萄球菌分别接种于纯钛片(空白组)、碱热处理钛片(对照组)、多酚介导的铜离子修饰钛片(实验组)表面，观察细菌存活状态。将成骨前体细胞MC3T3-E1分别接种于3组钛片表面，评价材料的抗氧化性能及生物活性。
结果与结论：①扫描电镜下可见多酚介导的铜离子修饰钛片表面存在棒状纳米结构，并且涂层无裂纹；多酚介导的铜离子修饰钛片表面亲水性接近纯钛片；原子吸收光谱结果显示，多酚介导后钛片表面铜离子的携载量增加了51%，铜离子呈均匀释放。②空白组、对照组、实验组钛片的抗菌率为0%，21.65%，93.75%；活死染色与CTC染色显示，空白组钛片表面的活细菌最多，实验组钛片表面的活细菌最少。③活死染色与CCK-8检测结果显示，3组钛片均具有良好的细胞相容性，并且实验组钛片更有利于MC3T3-E1细胞增殖；活性氧荧光探针检测显示，相较于其他两组，实验组钛片表面活性氧荧光强度明显减弱；碱性磷酸酶与茜素红S染色结果显示，相较于其他两组，实验组钛片表面MC3T3-E1细胞的成骨分化与细胞外基质矿化能力更强。④结果表明，多酚介导的铜离子涂层具有较强的抗菌、抗氧化及促成骨分化性能。
https://orcid.org/0009-0001-7952-5584 (官振菊)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 钛, 植入体, 抗菌, 抗氧化, 多酚, 铜离子, 涂层

Abstract: BACKGROUND: Titanium implants are widely used in clinical practice because of their high strength and good biocompatibility. However, during implantation, bacterial infection and tissue damage environment produce a large number of reactive oxygen species, which can easily lead to delayed tissue healing and surgical failure. Consequently, the development of titanium implants with antimicrobial and antioxidant properties becomes paramount.
OBJECTIVE: Considering the potent antimicrobial attributes of copper ions and the remarkable antioxidant qualities of polyphenols, we proposed the fabrication of polyphenol-mediated copper ion coatings on titanium surfaces. These coatings were subsequently assessed for their in vitro antimicrobial and antioxidant properties.
METHODS: Nanostructures were generated on the titanium surface using the alkali thermal method. The titanium was immersed in a solution containing tannic acid and copper ions to achieve polyphenol-mediated copper ion coatings. The surface morphology and water contact angle were detected. The loading and release of copper ions were examined using atomic absorption spectroscopy. Staphylococcus aureus was inoculated on the surface of pure titanium sheet (blank group), alkali heat treated titanium sheet (control group), and polyphenol mediated copper ion modified titanium sheet (experimental group) to observe the bacterial survival status. Osteoblast precursor cells MC3T3-E1 were co-cultivated on the surface of three groups of titanium sheets to assess their antioxidant properties and bioactivity.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscopy showed that the polyphenol-mediated copper ion modified titanium sheet had rod-like nanostructures and no cracks on the surface. The surface hydrophilicity of copper ion modified titanium sheet mediated by polyphenol was close to that of pure titanium sheet. Atomic absorption spectrometry results showed a 51% increase in the loading capacity of copper ions after polyphenol mediation, with a uniform release of copper ions. (2) The antibacterial rates of titanium sheets in the blank group, control group, and experimental group were 0%, 21.65%, and 93.75%, respectively. The live/dead staining and CTC staining showed that the live bacteria on the surface of titanium plates in the blank group were the most, and the live bacteria on the surface of titanium plates in the experimental group were the least. (3) The results of live/dead staining and CCK-8 assay showed that the three groups of titanium sheets had good cytocompatibility, and the titanium sheets in the experimental group were more conducive to the proliferation of MC3T3-E1 cells. Active oxygen fluorescence probe detection exhibited that compared with the other two groups, the fluorescence intensity of active oxygen on the surface of the experimental group was significantly reduced. The results of alkaline phosphatase and alizarin red S staining showed that the osteogenic differentiation and extracellular matrix mineralization of MC3T3-E1 cells on the surface of titanium sheets in the experimental group were stronger than those in the other two groups. (4) These results show that the polyphenol-mediated copper ion coating has strong antibacterial and antioxidant properties and promotes osteogenic differentiation.

Key words: titanium, implants, antibacterial, antioxidant, polyphenol, copper ion, coating

中图分类号:

官振菊, 谢永林, 向守刚, 张成栋, 李小龙, 李兴平, 蒲超, 张波, 罗栩伟, 肖东琴. 钛表面多酚介导铜离子涂层制备及抗菌抗氧化性能[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(10): 1997-2005.

Guan Zhenju, Xie Yonglin, Xiang Shougang, Zhang Chengdong, Li Xiaolong, Li Xingping, Pu Chao, Zhang Bo, Luo Xuwei, Xiao Dongqin. Preparation of polyphenol-mediated copper ion coating on titanium surface and antibacterial and antioxidant properties[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(10): 1997-2005.

图/表（结果） 9

2.1 各组钛片的表面形貌及元素组成采用扫描电镜观察钛片的表面形貌，低倍镜下可见3组钛片表面无明显区别；高倍镜下可见Ti-OH及Ti-TA-Cu表面均观察到棒状纳米结构，并且涂层无裂纹存在，见图1A，B。利用能谱仪对Ti-TA-Cu表面元素分布进行表征，发现其表面存在Ti、O、C、Cu元素，并且铜离子在涂层表面均匀分布，见图1C。利用X射线光电子能谱对Ti-TA-Cu涂层元素进行分析，发现钛表面有Ti、O、C、Cu的存在(图2)，提示钛表面生成了含铜涂层。

2.2 钛片表面涂层的结合力采用胶带法(ASTM D 3359)对涂层结合力进行测试，发现胶带表面没有可见涂层残留(图3)，Ti-OH和Ti-TA-Cu组涂层结合力均被评为5B级，结果表明Ti-OH和Ti-TA-Cu表面涂层与钛基材结合紧密。

2.3 各组钛片表面亲水性评估接触角测量结果显示，Ti表面的水接触角为(53.4±0.9)°，Ti-OH涂层表面的水接触角为(25.9±1.8)°，Ti-TA-Cu涂层表面的接触角为(57.5±1.1)°(图4A)。相较于纯钛片，Ti-OH组水接触角减小(P < 0.000 1)，Ti-TA-Cu组水接触角无明显变化(P > 0.05)。

2.4 含涂层钛片表面铜离子的携载及释放为了评估单宁酸对钛片表面铜离子携载量的影响，将Ti-OH分别浸泡在只含铜离子与含单宁酸/铜离子的溶液中，浸泡12 h后对上清液中铜离子进行检测(图4B)，当溶液中无单宁酸时，钛片表面的铜离子携载量为1.98 mg，而当溶液中添加单宁酸时，钛片表面铜离子携载量为3.01 mg，相比于前者携载量增加了51%，由此可知，单宁酸的存在有利于介导铜离子沉积在钛片表面。将Ti-TA-Cu置于生理盐水中测定其离子释放情况(图4C)，发现随着时间的延长，铜离子呈现均匀释放，14 d后累计释放率达到80%左右，21 d后累计释放率达到100%。

2.5 各组钛片的体外抗菌性能琼脂培养板接种实验显示，Ti-OH组抗菌率为21.65%，Ti-TA-Cu组抗菌率为93.75%(P < 0.05)(图5)。活死细菌染色结果显示，Ti、Ti-OH组可见大量绿色荧光，Ti-TA-Cu组可见大量红色荧光伴少量绿色荧光(图6A，B)。CTC染色结果显示，Ti、Ti-OH组红色荧光较多，Ti-TA-Cu组红色荧光少(图6C，D)，表明Ti-TA-Cu组具有良好的抗菌效果，并且其抗菌能力可能是通过抑制细菌呼吸链实现的。

2.6 各组钛片的生物相容性培养7 d后的活死细胞染色结果显示，3组钛片表面死细胞数量较少、活细胞数量较多，尤其是Ti-TA-Cu组活细胞数量多于其他两组(图7A，B)。CCK-8检测结果显示，细胞培养1 d后，各组钛片表面细胞数量无明显差异；培养7 d后，各组样品表面的细胞数量均较1d时增多，并且Ti-TA-Cu组细胞数量多于其他两组(图7C)。结果表明3种钛片均具有良好的细胞相容性，并且沉积铜离子涂层后更有利于细胞增殖。

2.7 各组钛片的活性氧清除能力 MDCFH-DA染色结果显示，与Ti-OH组、Ti组向比较，Ti-TA-Cu组活性氧强度和数量显著减少(图8)，表明单宁酸介入后增强了涂层的抗氧化性能。

2.8 各组钛片的促成骨性能
促成骨分化能力：碱性磷酸酶染色结果显示，Ti-TA-Cu组表面被染成蓝紫色的MC3T3-E1细胞数量最多，Ti-OH表面次之，Ti表面最少(图9A，B)。证明沉积铜离子的涂层更能促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。
促细胞外基质矿化能力：茜素红S染色结果显示，Ti-TA-Cu组表面的MC3T3-E1细胞内形成的桔红色钙结节含量最多，Ti-OH表面次之，Ti表面最少(图9C，D)。表明沉积铜离子的涂层促进MC3T3-E1细胞的细胞外基质矿化能力更强。

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引言

钛植入体因质量轻、比强度高和良好的生物相容性成为口腔医学工程领域内理想的功能材料[1]，然而，钛植入体作为生物惰性材料缺乏骨诱导性，不能与周围组织形成有效的化学键合，不利于骨整合[2-3]。因此，目前的研究大部分集中于如何增强钛植入体的成骨性能，例如：WU等[4]采用阳极氧化法在钛表面制备了二氧化钛纳米管，增强了骨整合的作用；XIAO等[5]利用钙改性钛种植体表面增加骨结合；DING等[6]利用溶胶凝胶法在钛表面制备钽功能涂层以增强成骨分化。但不容忽视的是，围术期伤口周围细菌感染也会引发种植体周围炎症，导致种植手术失败[7-9]；此外，种植过程中造成的组织损伤微环境中会诱发过量活性氧自由基产生，主要包括超氧化物自由基(O2·–)、羟基自由基(·OH)和过氧化氢(H2O2)[10]。研究表明，活性氧自由基的存在会造成细胞氧化损伤，导致炎症环境，不利于组织愈合[11-12]。因此，开发具有抗氧化功能及抗菌功能的钛植入体表面，对于提高植入体骨整合效率具有重要的意义。
铜离子作为人体必需的微量元素，在体内参与结缔组织和骨骼的新陈代谢，对钙磷沉积和骨代谢具有积极的调节作用。在适宜浓度下，铜离子能够促进碱性磷酸酶的表达，增加骨量[13-15]；同时作为广谱抗菌剂，铜离子对革兰阴性菌和阳性菌均具有良好的抗菌性能，它与细菌的细胞膜和细胞壁发生反应，降低脱氢酶的活性，破坏微生物的增殖能力[16]。但是，铜离子发挥生物学效应的关键在于合理控制其释放量，高浓度的铜离子可能产生细胞毒性，而适度浓度的铜离子则能提高成骨细胞的活力。研究表明，健康人血清中铜的质量浓度为1.5 mg/L，平均每日摄入量约为1 mg，摄入过量可能表现为毒性反应，如结缔组织缺陷、骨质疏松和胃肠道不适[13]，因此合理控制铜离子的释放率显得尤为关键。研究表明，多酚中的儿茶酚基团能够与多种金属离子(Mg2+、Ca2+)发生螯合反应，进而有利于在金属基底表面制备厚度可控的薄膜[17]。
为了在钛金属表面制备释放可控的铜离子涂层，此次实验拟引入多酚来调控铜离子在钛表面的沉积与释放。单宁酸是一种天然多酚类化合物，广泛存在于绿茶、水果、红酒和谷物中，其结构由1个中心葡萄糖单元和10个没食子酸组成，形成了含有没食子酰基的典型结构序列。多酚类化合物含有丰富的酚羟基基团，因而具备优良的活性氧自由基清除能力和优异的抗氧化特性，同时含多个酚结构，可通过共价作用与金属离子形成动态配位，进而螯合金属离子[18-19]。研究表明，单宁酸对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有良好的抗菌活性[19]。因此，将单宁酸与铜离子结合后，极有希望在增强涂层表面铜离子稳定性的同时增强其抗菌性能。目前有较多研究集中在钛表面构建含铜涂层，如REN等[20]利用高功率脉冲磁控溅射在钛表面制备含铜涂层，不仅增强了支架表面的抗菌活性，还有利于内皮细胞的活性和增殖，但这些技术比较复杂，需要特殊的设备，而多酚介导的材料表面离子沉积简单易行。基于此，此次实验采用多酚介导铜离子在钛表面制备含铜涂层，以期制备具有抗菌兼抗氧化功能的钛涂层用于促进骨组织修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料设备、理化性质表征、体外抗菌及抗氧化实验，两组数据间比较采用t检验分析，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年6月至2023年6月在川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院组织工程与干细胞研究所完成。
1.3 材料 12 mm×1 mm医用纯钛片(无锡鑫标金属材料有限公司提供，纯度99.6%)；小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1、金黄色葡萄球菌(北京北纳创联生物技术研究院)。
主要试剂与仪器：氢氧化钠(成都科隆，中国)；二水合氯化铜(天津科密欧，中国)；单宁酸(阿拉丁，中国)；营养琼脂(青岛海博，中国)；铜离子检测试剂盒(南京建成，中国)；脑心浸出液肉汤(青岛海博，中国)；丙酮、无水乙醇、(成都科隆，中国)；活/死细菌双染试剂盒(上海懋康，中国)；活性氧荧光探针DCFH-DA(碧云天生物技术，中国)；5-氰基-2，3-二甲本基四氮唑(5-cyano-2，3-ditolyl tetrazolium chloride，CTC，上海懋康，中国)；BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒(碧云天，中国)；α-MEM、胎牛血清、1%青链霉素(Gibco公司，美国)；1%茜素红染料(索莱宝，中国)；细菌培养箱、生物安全柜(Thermo公司，美国)；酶联免疫分析仪(杭州奥盛，中国)；细菌培养皿(Nest，美国)；荧光倒置显微镜(Nikon，上海)；气浴恒温振荡器(上海旻泉，中国)；台式电热恒温鼓风干燥机(上海精宏，中国)；原子吸收光谱仪AA-7000(岛津，日本)；场发射扫描电镜(美国-FEI-NOVA NANOSEM 230)；能谱仪(X-MAX50)；接触角测量仪(德国-Dataphysics-OCA20)。
1.4 实验方法
1.4.1 钛片清洗将12 mm×1 mm圆形医用纯钛片用800目砂纸打磨抛光，依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗10 min，置入氢氟酸/硝酸的混合水溶液中(摩尔比1∶6)酸蚀30 s，再用去离子水超声清洗20 min，37 ℃烘干备用，获得未改性的纯钛片(命名为Ti)。
1.4.2 钛表面涂层的制备将清洗后的钛片浸泡在NaOH溶液(5 mol/L)中80 ℃下反应24 h，用去离子水超声清洗10 min，获得碱热处理的钛片(命名为Ti-OH)。将单宁酸和铜离子按照质量比1∶1溶于去离子水中获得混合溶液(铜离子质量浓度为1 mg/mL)，将碱热处理的钛片置于混合溶液中37 ℃浸泡12 h，去离子水超声清洗10 min后烘干，得到多酚介导的铜离子修饰钛表面(命名为Ti-TA-Cu)。此外，将碱热处理后的钛片置于单独铜离子溶液(1 mg/mL)中37 ℃浸泡12 h，获得钛表面铜离子涂层(命名为Ti-Cu)。
1.4.3 钛表面涂层理化性质表征利用场发射扫描电镜观察Ti、Ti-OH、Ti-TA-Cu的表面形貌，能谱分析仪和X射线光电子能谱检测Ti-TA-Cu涂层元素组成，接触角测量仪评估Ti、Ti-OH、Ti-TA-Cu的表面亲水性。
1.4.4 钛表面涂层结合力采用胶带法(ASTM D 3359)检测表面涂层与基材间的结合力[21-22]。用特定刀具垂直于Ti-OH和Ti-TA-Cu表面制备平行切口网格(0.5 cm×0.5 cm)，然后将钛片置于平坦区域，将3 M胶带粘在钛片表面并用手指加压摩擦胶带，实现胶带与涂层的紧密接触，在加压的60 s内评估胶带表面残留物情况。基于ASTM D 3359的评级标准，5B：胶带表面没有可见脱离的涂层；4B：涂层去除面积< 5%；3B：涂层去除面积为5%-15%；2B：涂层去除面积> 15%且< 35%；1B：涂层去除面积为35%-65%；0B：涂层去除面积> 65%。
1.4.5 铜离子在钛植入体表面的携载及释放采用原子吸收光谱法检测Ti-TA-Cu与Ti-Cu中的铜离子释放。将两种钛片分别置于24孔板中，每组3个平行样，每孔加入2 mL生理盐水，浸泡1，4，7，14，21 d，提取2 mL上清液并重新加入新鲜生理盐水2 mL，采用原子吸收光谱仪测定铜离子浓度，计算铜离子累计释放率。
1.4.6 各组钛片的抗菌性能测定
实验分组与干预：将Ti、Ti-OH、Ti-TA-Cu置于紫外灯下正反面各灭菌1 h，置于无菌24孔板中。利用生理盐水将金黄色葡萄球菌液稀释使其浓度在105-107 CFU/mL范围内，用移液枪吸取100 µL菌悬液分别种植在3组钛片上，置于37 ℃恒温培养箱中孵育20 min。
细菌存活率：置于37 ℃恒温培养箱中孵育20 min后，加入1 mL液体培养基(脑心浸出液肉汤)于37 ℃气浴恒温振荡器振荡(150 r/min)孵育6 h；吸取100 µL菌悬液置于琼脂培养板上，涂布均匀，放置30 min后置于37 ℃恒温培养箱中倒置过夜。使用Image J软件计算平板上的细菌数，以Ti作为对照组，计算抗菌率，抗菌率=[(对照组细菌菌落数-实验组细菌菌落数)/对照组细菌菌落数]×100%。每组3个平行样，实验重复3次。
活死细菌染色：置于37 ℃恒温培养箱中孵育20 min后，加入1 mL液体培养基培养12 h，每孔取1 mL菌液于无菌EP管中，加入3 µL染料混合液(SYTO 1.5 µL+PI 1.5 µL)染色暗室室温孵育15 min，取6 µL滴于载玻片，荧光显微镜下观察拍照，使用Image J软件定量分析平均荧光强度。
CTC染色：置于37 ℃恒温培养箱中孵育20 min后，加入1 mL液体培养基培养12 h，取出钛片，将400 µL CTC染色工作液(5 mmol/L)滴加在钛片表面孵育15 min，多聚甲醛固定终止孵育，荧光显微镜下观察拍照，使用Image J软件定量平均荧光强度。
1.4.7 各组钛片的生物活性
实验分组与干预：将Ti、Ti-OH及Ti-TA-Cu置于紫外灯下正反面各灭菌1 h，分别置于24孔板内，每组3个平行样。将MC3T3-E1细胞悬液以1×104/孔的密度接种到各钛片表面，每孔加入600 µL α-MEM 完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青链霉素)，每2 d换液1次。
活死细胞染色：培养7 d后，用无菌PBS清洗孔板2次，向每孔加入500 µL 1×Assay Buffer和0.5 µL LiveDye及0.5 µL NucleiDye混合染色液37 ℃避光孵育20 min，用PBS清洗孔板2次，荧光显微镜下观察活细胞和死细胞，使用Image J软计数细胞数量。CCK-8检测：培养1，7 d后，吸弃旧培养基，用PBS清洗孔板3次，每孔加入400 µL CCK-8 检测液与α-MEM培养基的混合液(两者体积比为1∶10)孵育1 h，每孔取100 µL液体，使用酶标仪检测 450 nm 处的吸光度值。
1.4.8 各组钛片的活性氧清除能力按照1.4.7中的实验分组与干预，培养24 h后吸去培养基，加入含300 µmol/L H2O2的α-MEM培养基刺激细胞1 h[23]。用PBS 清洗孔板2次，加400 µL活性氧荧光探针DCFH-DA孵育15 min，用PBS 清洗孔板 2次，荧光显微镜下观察拍照，使用多功能酶标仪于波长488/525 nm处检测吸光度值。
1.4.9 各组钛片的促成骨性能
碱性磷酸酶染色检测成骨分化能力：按照1.4.7中的实验分组与干预，培养24 h后首次更换新鲜培养基，第3天将培养基更换为α-MEM成骨诱导分化培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青链霉素、0.2%抗坏血酸、1%β-甘油磷酸钠、0.01%地塞米松)，此后每2 d更换新鲜培养基1次。成骨诱导培养14 d后，吸弃旧培养基，用PBS清洗孔板3次，多聚甲醛固定15 min，用PBS再次清洗孔板，每孔加入1 mL BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色液室温避光孵育30 min，用PBS清洗孔板，体视显微镜下观察被染成深蓝色的细胞数量，根据碱性磷酸酶试剂盒说明书进行碱性磷酸酶活性定量检测。
茜素红S染色检测钙结节形成：按照1.4.7中的实验分组与干预，培养24 h后首次更换新鲜培养基，第3天将培养基更换为α-MEM成骨诱导分化培养基，此后每2 d更换新鲜培养基1次。成骨诱导培养21 d后，吸弃旧培养基，用PBS清洗孔板，多聚甲醛固定15 min，用PBS清洗孔板，每孔加入1 mL 1%茜素红S染色液孵育5 min，用PBS清洗孔板，体视显微镜下观察桔红色钙结节形成情况。拍照结束后向孔板内加入400 µL 10%氯化十六烷基吡啶溶液，待钙结节完全溶解后吸取100 µL于96孔板，使用多功能酶标仪检测562 nm处的吸光度值。
1.5 主要观察指标 ①铜离子在钛植入体表面的携载及释放情况；②各组样品的抗菌性能、抗氧化能力与促成骨作用。
1.6 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，两组数据间比较采用t检验分析，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05认为有差异显著性意义。该文统计学方法已经川北医学院生物统计学专家审核。

讨论

时含多个酚结构，可通过共价作用与金属离子形成动态配位，进而螯合金属离子[18-19]。研究表明，单宁酸对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有良好的抗菌活性[19]。因此，将单宁酸与铜离子结合后，极有希望在增强涂层表面铜离子稳定性的同时增强其抗菌性能。目前有较多研究集中在钛表面构建含铜涂层，如REN等[20]利用高功率脉冲磁控溅射在钛表面制备含铜涂层，不仅增强了支架表面的抗菌活性，还有利于内皮细胞的活性和增殖，但这些技术比较复杂，需要特殊的设备，而多酚介导的材料表面离子沉积简单易行。基于此，此次实验采用多酚介导铜离子在钛表面制备含铜涂层，以期制备具有抗菌兼抗氧化功能的钛涂层用于促进骨组织修复。
相较于前者携载量增加了51%；此外，单宁酸介导后铜离子呈现均匀释放，这是因为单宁酸含有多酚结构，能与铜离子发生螯合作用，从而增强了铜离子在纳米结构上的携载量，同时减缓涂层中铜离子的释放速度，有利于涂层的长期缓释[32]。体外抗菌实验表明，以纯钛作为空白对照时，Ti-OH组抗菌率为21.65%，Ti-TA-Cu组抗菌率为93.75%；此外，细菌CTC染色结果表明，Ti-TA-Cu涂层表面活细菌数量最少，说明铜离子对细菌呼吸链具有抑制和破坏作用，阻碍细菌增殖[33]。这是因为铜离子带正电荷，而细菌的细胞膜和细胞壁带负电荷，由于异性电荷相吸的原因，铜离子与细菌发生相互作用，导致细菌的生存微环境紊乱，这种相互作用抑制细菌呼吸，最终导致细菌死亡[34]。此次实验将金黄色葡萄球菌种植在制备涂层的钛表面，通过活死细菌染色及菌落计数实验方法评估了涂层的抗菌效果，实验结果显示Ti-TA-Cu涂层展现出了显著的抗菌性能(抑菌率93.75%)；同时细菌CTC染色结果发现，Ti、Ti-OH涂层表面活细菌较为丰富，Ti-TA-Cu涂层表面活细菌较少，这一差异提示涂层有可能通过抑制和破坏细菌的呼吸链来实现其抗菌作用。相似的抗菌结果在MAHMOUDI-QASHQAY等[35]的研究中也有发现，他们利用共溅射法在钛表面制备了含铜薄膜，薄膜杀菌率达到99.9%，扫描电镜观察到细菌发生了皱缩和塌陷，他们提出钛表面的含铜薄膜能释放出铜离子，然后铜离子与细菌直接接触来破坏细菌膜，起到杀菌作用；同时，铜还可以通过氧化还原反应产生活性氧，抑制细菌生长[36]。此外，单宁酸的作用机制也在细菌的生长抑制中可能发挥关键作用。HUANG等[37]的研究表明，单宁酸中酚羟基赋予其许多功能，比如通过非共价键相互作用，特别是氢键和离子配位赋予其抗菌性能。一方面，单宁酸通过抑制糖和氨基酸的吸收来抑制细菌生长；另一方面，单宁酸穿过细菌的胞壁抵达细胞膜，从而干扰细菌的代谢过程，破坏细菌增殖[19]。需要注意的是，单宁酸具有强大的抗氧化性能[38]，但活性氧的清除也可能减弱部分抗菌效果。尽管如此，此次实验制备的涂层仍表现出良好的抗菌效果。
在赋予钛表面抗菌功能的同时也要考虑其是否具有良好的生物相容性。将MC3T3-E1细胞种植在钛样品表面，CCK-8和活死细胞染色结果显示各样品均不具有细胞毒性，表现出良好的生物相容性，并且MC3T3-E1细胞在沉积铜离子钛片表面的增殖速度快于碱热钛片和纯钛。碱性磷酸酶和茜素红染色结果显示，Ti-TA-Cu涂层表面碱性磷酸酶数量和钙结节数量多于Ti-OH、Ti，说明Ti-TA-Cu涂层成骨性能最好，这是因为碱热处理为钛表面提供了有利于骨整合的纳米结构和钛酸盐层[39]。研究表明，铜离子显著增加血管内皮生长因子和核糖核酸酶的表达，从而促进血管生成[40]。血管生成为骨生成提供了必需的营养元素。铜离子还能促使胶原纤维的沉积，进而刺激骨代谢；此外，铜离子能够上调碱性磷酸酶活性，增加成骨相关基因(骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、骨钙蛋白)的表达，促进成骨细胞的黏附和增殖，从而促进成骨分化[28]。除此之外，单宁酸也为钛表面提供了有利于成骨的酚基基团，通过与钙离子结合增强成骨性能[41-42]。
活性氧是氧化应激反应中的关键信号分子。在一些病理条件下，如骨质疏松和创伤性损伤，活性氧的过度累积会破坏细胞内的稳态，导致氧化应激微环境恶化，这种恶化的环境严重阻碍了植入物与骨结合的过程[43]。研究表明，通过抑制活性氧的过度产生可以显著增加骨量，为骨结合提供更有利的环境[44]。此次实验重点考察了氧化应激环境下Ti-TA-Cu涂层对MC3T3-E1细胞活性氧表达的影响，发现涂层能有效清除氧化应激环境下细胞内活性氧的表达，增强细胞活力。类似的结果在XU等[45]的研究中也有观察到。此外，秦祎雄等[46]进一步研究了茶多酚对正常条件和氧化应激条件下MC3T3-E1细胞增殖分化的影响，发现相比于正常条件下，氧化应激条件下的细胞增殖和分化都受到抑制，但茶多酚的加入能降低氧化应激水平，促进细胞的增殖分化，从而逆转氧化应激环境对细胞造成的不良影响。因此，此次实验利用单宁酸在钛表面制备铜沉积涂层来清除活性氧，根据DCFH-DA染色结果发现Ti-TA-Cu涂层表面的荧光强度减弱，这是因为单宁酸含有大量酚基基团，这些基团能够与自由基发生反应阻断氧化反应，保护细胞免受损伤；同时，这些基团与金属离子结合后抑制金属离子的催化作用，从而减少了氧化反应的产生[47]。因此，单宁酸介导铜离子涂层沉积有利于增强钛表面的抗氧化能力。
综上所述，实验成功在钛表面制备了多酚介导的铜离子涂层，该涂层不仅提升了钛表面的抗菌性能，还具有抗氧化活性和促细胞成骨分化的功能，然而该涂层植入机体后的具体抗菌及成骨性能还有待进一步研究。尽管如此，此次实验为制备具有抗菌兼抗氧化功能的钛表面提供了一种简单易行的方法，有望应用于临床钛植入体的改性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

钛表面多酚介导铜离子涂层制备及抗菌抗氧化性能

Preparation of polyphenol-mediated copper ion coating on titanium surface and antibacterial and antioxidant properties

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