静电纺丝聚偏氟乙烯压电仿生骨膜的生物相容性评价

doi:10.12307/2025.257

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (4): 730-737.doi: 10.12307/2025.257

• 组织工程骨材料 tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

静电纺丝聚偏氟乙烯压电仿生骨膜的生物相容性评价

赵帅1，李冬瑶2，魏岁艳3，曹怡静4，许燕5，徐国强6，7

1青岛市即墨区人民医院口腔科，山东省青岛市 266200；2新疆乌鲁木齐市口腔医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000；新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)，3口腔放射科，6口腔修复种植科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；4南昌大学附属口腔医院(黏膜牙周科)，江西省南昌市 330000；5新疆大学机械工程学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830047；7新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2023-12-06 接受日期:2024-02-19 出版日期:2025-02-08 发布日期:2024-05-30
通讯作者: 徐国强，主任医师，副教授，新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)口腔修复种植科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:赵帅，女，1996年生，新疆维吾尔自治区哈密市人，汉族，硕士，医师，主要从事口腔修复学的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(51965057)，项目负责人：许燕

Biocompatibility of poly(vinylidene fluoride) piezoelectric bionic periosteum prepared by electrospinning

Zhao Shuai1, Li Dongyao2, Wei Suiyan3, Cao Yijing4, Xu Yan5, Xu Guoqiang6, 7

1Department of Stomatology, Qingdao Jimo District People’s Hospital, Qingdao 266200, Shandong Province, China; 2Urumqi Stomatology Hospital, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 3Department of Oral Radiology, 6Department of Prosthodontics and Implantology, First Affiliated Hospital (Affiliated Stomatological Hospital) of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 4Dental Hospital Affiliated to Nanchang University (Department of Mucosal Periodontitis), Nanchang 330000, Jiangxi Province, China; 5College of Mechanical Engineering, Xinjiang University, Urumqi 830047, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 7Insitute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2023-12-06 Accepted:2024-02-19 Online:2025-02-08 Published:2024-05-30
Contact: Xu Guoqiang, Chief physician, Associate professor, Department of Prosthodontics and Implantology, First Affiliated Hospital (Affiliated Stomatological Hospital) of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Insitute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Zhao Shuai, Master, Physician, Department of Stomatology, Qingdao Jimo District People’s Hospital, Qingdao 266200, Shandong Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 51965057 (to XY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
静电纺丝技术：是指聚合物熔体或者溶液在高压静电场作用下形成纤维的过程。与电喷技术形成的是单分散微米或者纳米聚合物球不同，静电纺丝技术是通过使带电荷的高分子熔体或者溶液在高压静电场中喷射、拉伸、劈裂，固化或者溶剂挥发，最终形成纤维状物质的过程，是目前制备一维纳米结构材料的重要方法之一。
聚偏氟乙烯：是一种多晶型的半结晶氟塑料，具有良好的压电性和生物相容性，用其制备出的电刺激型医用膜可促进各种生长因子的表达和分泌，进而影响细胞的增殖和分化过程，是研究较为广泛的电活性生物材料之一。
背景：课题组前期研究发现，静电纺丝聚偏氟乙烯仿生骨膜具有良好的细胞相容性，但其生物相容性尚不清楚。
目的：评价掺Zn2+、Mg2+聚偏氟乙烯仿生骨膜的生物相容性。
方法：取前期研究采用静电纺丝技术制备的聚偏氟乙烯、掺1%Zn2+聚偏氟乙烯、掺1%Mg2+聚偏氟乙烯、掺1%Zn2++1%Mg2+聚偏氟乙烯仿生骨膜，制备各组仿生骨膜浸提液，选择SD大鼠为实验对象，进行溶血实验、短期全身毒性实验、热源实验，选择豚鼠为实验对象，进行皮肤致敏实验，检测4组仿生骨膜的生物相容性。
结果与结论：①溶血实验结果显示，掺1%Zn2+聚偏氟乙烯、掺1%Mg2+聚偏氟乙烯、掺1%Zn2++1%Mg2+聚偏氟乙烯仿生骨膜及聚偏氟乙烯浸提液的溶血率分别为(0.130±0.013)%，(0.149±0.020)%，(0.466±0.018)%，(0.037±0.018)%，符合生物材料血液相容性性标准；②短期全身毒性实验结果显示，4组仿生骨膜浸提液灌胃干预后未引起SD大鼠体质量减轻、摄食量变化及呼吸困难等毒性体征，对大鼠的主要脏器无毒性作用；③热源实验结果显示，掺1%Zn2+聚偏氟乙烯、掺1%Mg2+聚偏氟乙烯、掺1%Zn2++1%Mg2+聚偏氟乙烯及聚偏氟乙烯仿生骨膜浸提液干预后，SD大鼠体温升高值分别为(0.133±0.058)，(0.100±0.010)，(0.300±0.010)，(0.300±0.017) ℃，均小于0.6 ℃，体温升高度数总和均小于1.4 ℃；④皮肤致敏实验结果显示，4组仿生骨膜浸提液干预后豚鼠皮下未见红斑与水肿。结果表明：聚偏氟乙烯与掺Zn2+、Mg2+聚偏氟乙烯仿生骨膜具有良好的生物相容性。
https://orcid.org/0009-0007-9554-413X(赵帅)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 静电纺丝, 聚偏氟乙烯, 仿生骨膜, 锌离子, 镁离子, 生物相容性

Abstract: BACKGROUND: Our previous studies have found that poly(vinylidene fluoride) bionic periosteum prepared by electrospinning has good cytocompatibility, but its biocompatibility is unknown.
OBJECTIVE: To evaluate the biocompatibility of poly(vinylidene fluoride) bionic periosteum doped with Zn2+ and Mg2+.
METHODS: Poly(vinylidene fluoride), poly(vinylidene fluoride) bionic periosteum doped with 1% Zn2+, doped with 1% Mg2+, and doped with 1% (Zn2++Mg2+) were prepared by electrospinning to make bionic periosteum extract. SD rats were selected as the experimental subjects for hemolysis test, short-term systemic toxicity test, and heat source test. Guinea pigs were selected as the experimental subjects for skin sensitization test. The biocompatibility of bionic periosteum of four groups was tested.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The hemolysis test results showed that the hemolysis rates of 1% Zn2+ poly(vinylidene fluoride), 1% Mg2+ poly (vinylidene fluoride), 1% Zn2++1% Mg2+ poly(vinylidene fluoride) bionic periosteum and poly(vinylidene fluoride) extract were (0.130±0.013)%, (0.149±0.020)%, (0.466±0.018)%, and (0.037±0.018)%, respectively, which met the hemocompatibility standard of biomaterials. (2) The results of short-term systemic toxicity test showed that the four groups of bionic periosteal extract had no toxic signs such as body mass reduction, food intake changes, and dyspnea in SD rats, and had no toxic effects on major organs of rats. (3) Heat source test results showed that after intervention with poly(vinylidene fluoride) bionic periosteum doped with 1% Zn2+, doped with 1% Mg2+, and doped with 1% (Zn2++Mg2+), and poly(vinylidene fluoride) bionic periosteum extract, the elevated body temperature values of SD rats were (0.133±0.058), (0.100±0.010), (0.300±0.010), and (0.300±0.017) °C, respectively. All were less than 0.6 °C, and the total temperature increase was less than 1.4 °C. (4) The results of skin sensitization test showed that no erythema or edema was observed under the skin of guinea pigs after the intervention of bionic periosteum extract of four groups. (5) The results showed that poly(vinylidene fluoride) and poly(vinylidene fluoride) bionic periosteum doped with Zn2+ and Mg2+ had good biocompatibility.

Key words: electrospinning, poly(vinylidene fluoride), bionic periosteum, zinc ion, magnesium ion, biocompatibility

中图分类号:

赵帅, 李冬瑶, 魏岁艳, 曹怡静, 许燕, 徐国强. 静电纺丝聚偏氟乙烯压电仿生骨膜的生物相容性评价[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 730-737.

Zhao Shuai, Li Dongyao, Wei Suiyan, Cao Yijing, Xu Yan, Xu Guoqiang. Biocompatibility of poly(vinylidene fluoride) piezoelectric bionic periosteum prepared by electrospinning[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(4): 730-737.

图/表（结果） 11

2.1 仿生骨膜浸提液溶血实验结果 PVDF-Zn、PVDF-Mg、PVDF-Zn-Mg、PVDF仿生骨膜浸提液的溶血率(0.130± 0.013)%，(0.149±0.020)%，(0.466±0.018)%，(0.037±0.018)%，如表2所示，实验样品的溶血率均符合生物材料的血液相容性标准，即小于5%，表明PVDF仿生骨膜材料不会引发溶血反应。

2.2 仿生骨膜浸提液短期全身毒性实验结果实验2周内，各实验组和对照大鼠食物利用率比较差异无显著性意义(P > 0.05)，如表3所示。各实验组和对照组大鼠体质量增长量如表4所示，5组大鼠体质量增长均呈上升趋势(图1)。各实验组和对照组大鼠每周体质量相对增长率见表5。大体观察5组大鼠的临床毒性分级均为正常。

将所有大鼠称体质量后解剖，观察各脏器颜色、形态和结构未见明显异常，如图2所示。去除脏器包膜后，分析天平称质量，对各脏器系数进行统计分析，实验组各脏器系数与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，如表6所示，表明4组PVDF仿生骨膜浸提液对大鼠脏器未产生影响。图3为各组大鼠主要脏器组织病理切片的苏木精-伊红染色结果，各组脏器组织正常，无明显的组织水肿、组织空泡等异常表现。

2.3 仿生骨膜浸提液热源实验结果 PVDF-Zn、PVDF-Mg、PVDF-Zn-Mg、PVDF仿生骨膜浸提液注射3 h后的SD大鼠体温升高值分别为(0.133±0.058)，(0.100±0.010)，(0.300±0.010)，(0.300±0.017) ℃，均小于0.6 ℃，体温升高值总和均小于1.4 ℃，如表7所示，符合医疗器械生物学评价，说明4组PVDF仿生骨膜无致热作用。

2.4 仿生骨膜浸提液致敏实验结果各PVDF仿生骨膜浸提液完全浸透后的滤纸直接接触豚鼠皮肤后均未见红斑和水肿，并且皮肤反应与对照组相似。大体观察，根据时间点即(24±2)，(48±2)，(72±2) h对各组豚鼠敷贴部位的皮肤反应评分。各组豚鼠敷贴实验大体观察结果如图4所示。各组豚鼠敷贴实验等级计分均小于1，见表8，判定4组仿生骨膜浸提液无潜在致敏物质。

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引言

因骨创伤、骨结核、骨肿瘤等手术治疗造成的骨缺损修复是骨科及口腔种植科面临的一大难题[1-3]。临床上常用的修复骨缺损的方法有自体骨、同种异体骨、异种骨和人工骨移植4种[4]。自体骨移植物被认为是骨缺损修复和重建的“金标准”[5]，但自体骨来源不能完全满足骨缺损面积的需求[6]；异体骨移植存在免疫排斥等不良反应，使其临床应用受到一定限制，因此如何构建出促进骨缺损修复的生物材料一直是学者们研究的热点[7]。
在骨缺损愈合过程中骨膜发挥着不可替代的作用[8]。骨膜作为一种良好的成血管化组织覆盖在皮质骨的外表面[9]，通过协调骨膜细胞、骨髓间充质干细胞、成骨细胞等各类细胞促进骨的生物矿化，其中成骨和成软骨祖细胞以及其他相关的生物活性因子为骨提供血液循环[10]，骨膜缺失会导致骨的营养供应不足，从而导致骨愈合不良或失败。国内外研究表明，骨膜存在的骨缺损部位自身成骨效果较好，而去除骨膜则会导致骨修复范围减少[11-12]，因此生物相容性好的人工骨膜材料逐渐受到许多外科医生和研究者们的重视。
电学微环境是骨组织所处的重要微环境之一，骨骼的固有特性之一是压电性[13]，电刺激信号有利于骨的形成，骨的压电性是由于胶原和各种离子流体运动响应机械负载产生的电势[14]。骨的压电性不仅能维持和调节骨组织的稳态和再生，还能促进骨的功能改建[15]，因此，压电材料在没有外部电刺激的情况下通过施加外力使材料变形，将电信号传递给细胞，在骨修复方面具有一定的潜力[16-17]。生物相容性好且具有压电性的半结晶氟塑料——聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)在临床上的应用较为广泛[18]，以其作为原材料制备的纳米纤维膜在促进生长因子表达和分泌的同时还影响着细胞的增殖与分化[19]。制备纳米纤维膜的方法包括溶胶-凝胶法、分子自组装技术、静电纺丝法等[20-21]。使用溶胶-凝胶法制备纳米纤维膜的一般过程包括制备溶胶、加入生物活性剂、凝胶化和干燥，该方法的主要优点是原料在分子水平上能均匀分布，然而该方法较复杂，难以实现大规模的应用[22]。分子自组装技术是指分子自发地组织和排列以形成有序、复杂的超分子结构的方法，成本低，但是自组装的过程不可控。静电纺丝技术是制备具有纤维结构和压电性膜最有效的方法[23-24]。在静电纺丝过程中，将外部电场应用于聚合物溶液中制备纳米纤维，这些纳米纤维相互交织成网状，其微观结构与骨膜纤维层相类似，并且接近于天然细胞外基质结构，有助于细胞的生长。静电纺丝技术的优点是纤维尺寸和孔隙度可控、制造方便。
通过在基础纳米纤维膜上加入有益的微量元素，从而达到促进骨组织再生的目的，是目前常用的一种骨缺损修复的策略[25]。在骨组织工程应用中一些金属微量元素已表现出良好的成骨能力，包括Zn2+、Cu2+等[26]。Zn缺乏会降低成骨细胞和碱性磷酸酶的活性，从而影响成骨[27]。Mg是骨骼中影响骨矿化和参与体内代谢过程的关键元素，其弹性模量更接近于骨的弹性模量[28]；此外，Mg的存在也增加了骨密度和延展性，减少了骨折的概率。
任何预期应用于人体的医疗器械和材料，无论是直接接触于人体还是间接接触于人体，均必须通过生物学评价检测。课题组前期研究采用静电纺丝技术制备了掺Zn2+、Mg2+的PVDF仿生骨膜，预期应用于人体以修复骨缺损，所以在具有与人体相似解剖结构和生化条件的动物体内进行模拟实验，是检测材料生物相容性的重要环节[29]。此次实验选取溶血实验、短期全身毒性实验、热源实验和致敏实验对掺Zn2+、Mg2+的PVDF仿生骨膜进行生物相容性评价。
课题组前期研究对掺Zn2+、Mg2+的PVDF仿生骨膜浸提液进行检测，发现掺1%Zn2+、Mg2+的PVDF仿生骨膜在为期14 d的浸提实验中两种元素均为微量释放状态，浓度均处于可促进成骨的范围，并且低于抑制成骨的浓度，具有良好的细胞相容性[30]。为了评价该仿生骨膜的生物相容性，此次实验选取掺1%Zn2+、1%Mg2+、1%Zn2++1%Mg2+的PVDF仿生骨膜，参照YYT 1651.1-2019和GB/T16886系列标准进行生物相容性评价[31]，以期为临床修复骨缺损的材料提供基础性参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计仿生骨膜生物相容性评估，计量资料用Shapiro-Wilk行正态性检验，分类资料用例数表示。
1.2 时间及地点实验于2021年6月至2023年1月在新疆医科大学第一附属医院实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 主要材料和仪器 PVDF、掺1%Zn2+ PVDF(PVDF-Zn)、掺1%Mg2+ PVDF(PVDF-Mg)、掺1%Zn2++1%Mg2+ PVDF(PVDF- Zn-Mg)仿生骨膜由新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)口腔修复种植科提供[30]；完全弗氏佐剂(S30541，上海源叶，中国)；2%草酸钾抗凝剂(R22392，上海源叶，中国)；舒泰50®(83887902，维克有限公司，法国)；苏木精-伊红染液(BL700B，Biosharp，中国)；组织包埋盒(31050102W，世泰，中国)；环保浸蜡脱蜡透明液(BL170A，Biosharp，中国)；全波长酶标仪(Multiskan GO，Thermo Fisher，中国)、离心机(TDL-5A菲恰尔，中国)。
1.3.2 实验动物健康8周龄SD大鼠41只，购自新疆医科大学第一附属医院实验动物中心，许可证号：SCXK (新)2018-0002，雌雄不拘，体质量约200 g，用于溶血实验、短期全身毒性实验、热源实验；健康清洁级2月龄豚鼠15只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：北京百善 SCXK(京)2021-0006，雌雄不拘，体质量250-300 g，用于致敏实验。
实验方案已获得新疆医科大学动物伦理委员会批准，伦理审批号为IACUC-20220520-15。动物实验过程严格遵循《关于善待实验动物的指导性意见》[32]。
1.4 实验方法
1.4.1 仿生骨膜浸提液的制备将PVDF、PVDF-Zn、PVDF-Mg、
PVDF-Zn-Mg仿生骨膜经过120 ℃高温高压灭菌消毒90 min后备用。按样品表面积/浸提液体积=6 cm2/mL，将4种仿生骨膜分别在生理盐水浸提介质中恒温水浴浸泡72 h[33]，制备仿生骨膜浸提液。仿生骨膜浸提液经0.22 μm滤器过滤，密封于无菌瓶中，保存于4 ℃冰箱，24 h内使用完毕。
1.4.2 仿生骨膜浸提液的溶血实验取健康SD大鼠1只，腹主动脉采血5-10 mL，立即进行抗凝处理。取0.1 mL稀释后的抗凝鼠血，加入5 mL蒸馏水，利用酶标仪测量545 nm处的吸光度值。
实验分组与处理：实验设置阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(蒸馏水)、PVDF组、PVDF-Zn组、PVDF-Mg组、PVDF-Zn-Mg组，每组6个平行样本，将6组装有对应的5 mL溶液或仿生骨膜浸提液的离心管放于(37±1) ℃恒温水浴中保温30 min；取抗凝鼠血0.1 mL分别加入各组离心管内，轻摇匀，37 ℃恒温水浴中保温60 min，2 000 r/min离心5 min，保留上清液，利用酶标仪测量545 nm处的吸光度值[34]。溶血率=(A-B)/(C-B)×100%，A为各实验组吸光度值，B为阴性对照组吸光度值，C为阳性对照组吸光度值。
评价指标：阴性对照组吸光度值≤0.03，阳性对照组吸光度值在(0.9±2)范围内。反之，应重复实验。若实验组的溶血率小于5%时，说明该材料不溶血。
1.4.3 仿生骨膜浸提液的短期全身毒性实验取SD大鼠25只，采用随机数字表法分为对照组、PVDF组、PVDF-Zn组、PVDF-Mg组、PVDF-Zn-Mg组，每组5只。灌胃前需禁食4 h。对照组大鼠灌胃给予生理盐水5 mL/kg，其余4组灌胃给予对应的仿生骨膜浸提液5 mL/kg，1次/d，连续灌胃1周。灌胃1周后继续观察1周。通过每日记录各组各大鼠的体质量和摄食量，来对每只大鼠的食物利用率和增体质量变化进行描述和统计。
按照以下体征对大鼠的中毒体征进行分级，若一笼存在大鼠中毒体征轻重程度不等时，以最重者为准。毒性体征分为5度，即正常反应(未见毒性反应)、轻度反应(运动功能减退、呼吸困难、腹部刺激不显著)、中度反应(腹部刺激明显、呼吸困难、运动功能减退、眼睑下垂、腹泻、体质量减轻)、显著反应(出现虚脱、震颤和严重腹泻、眼睑下垂、腹泻或体质量迅速减轻)和死亡。
观察期内，判定材料无毒性的指征如下：被灌胃给予仿生生物骨膜浸提液的大鼠反应均小于或与对照组大鼠相同。判定材料具有毒性的指征如下：如果被灌予浸提液实验组出现大于2只大鼠表现为中度中毒，甚至死亡。当出现以下情况时，需要重复实验：若实验组大鼠出现轻度中毒现象超过2只时以及实验组中不超过1只大鼠表现为中度中毒甚至死亡时。重复实验后，若实验组大鼠反应均小于或与对照组大鼠相同，即可判定该材料无毒性。
观察期结束后，所有大鼠腹腔注射舒泰50® 0.2 mL/kg，待全身麻醉后处死，对大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏进行宏观观察，是否有颜色异常、有无充血变化或水肿等，去除脏器包膜后置于分析天平称质量，得出主要脏器的脏器系数，评价仿生骨膜是否对大鼠脏器产生影响。
评价指标：脏器系数(%)=脏器质量/体质量×100%。食物利用率(%)=体质量增长数(g)/1周内食用食物总量(g)×100%。体质量相对增长率(%)=体质量增长数(g)/原始体质量(g)×100%。1周后体质量增长量(g)=1周后体质量(g)-原始体质量(g)。2周后体质量增长量(g)=2周后体质量(g)-原始体质量(g)。
1.4.4 仿生骨膜浸提液的热源实验取SD大鼠15只，采用随机数字表法分为对照组、PVDF组、PVDF-Zn组、PVDF-Mg组、PVDF-Zn-Mg组，每组3只。实验前大鼠禁食不禁水2 h，测量其肛温为基础体温，若最大温差≤0.4 ℃则符合作为实验动物的标准，以供实验。15 min后待大鼠状态稳定时，对照组大鼠腹腔注射生理盐水10 mL/kg，其余4组大鼠腹腔注射对应仿生骨膜浸提液10 mL/kg，注射后测温3次，每次间隔1 h，间隔期间正常饮食，测量完成后取3次温度的平均值，作为大鼠体温，计算出大鼠升高的体温度数。
评价指标：各组的每只大鼠体温升高均≤0.6 ℃，体温升高的总度数< 1.4 ℃时，说明该仿生骨膜材料不致热。

1.4.5 仿生骨膜浸提液的致敏实验取豚鼠15只，采用随机数字表法分为对照组、PVDF组、PVDF-Zn组、PVDF-Mg组、PVDF-Zn-Mg组，每组3只。以各材料浸提液与完全弗氏佐剂为实验组供试液，生理盐水与完全弗氏佐剂为对照组供试液。按照GBT16886.10-2005医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验规定，用最大剂量法进行致敏实验并按致敏反应计分标准，描述各致敏部位的皮肤反应情况，如表1所示。致敏实验分为皮肤诱导阶段、局部诱导阶段、激发阶段和观察阶段。

皮肤诱导阶段：①实验开始之前用电动剃刀和脱毛膏除去所有豚鼠背部和肩胛骨部位的毛，以4 cm×6 cm的面积作为实验区和观察区，左为1区，右为2区；②实验第1天，在上述步骤的备皮区域完成溶液或仿生骨膜浸提液的皮内注射，每一注射点的注射剂量为0.1 mL，每2个注射部位间隔2 mm，A1/A2点、B1/B2点、C1/C2点(左侧为A1-C1点，右侧为A2-C2点)被从头到尾标记完成；③A1/A2点：将完全弗氏佐剂与生理盐水按1∶1体积比混合制成稳定性乳化剂，共1 mL，取0.1 mL皮内注射于A1及A2点；④B1/B2点：将各仿生骨膜浸提液、生理盐水分别皮内注射0.1 mL于B1/B2点；⑤将完全弗氏佐剂与生理盐水按1∶1体积比混合，再将该混合液与各仿生骨膜浸提液按1∶1体积比混合，制成混合液；⑥C1/C2点：注射0.1 mL上述制成的混合液于C1/C2点；⑦实验第2-6天，观察并记录注射区变化并及时将新长出的毛剃去。

局部诱导阶段：①在局部诱导敷贴阶段前(24±2) h，也就是主实验第7天，将10%十二烷基硫酸钠石蜡液导入各豚鼠的备皮区域，对照组豚鼠给予与实验组相同的操作。②导入(24±2) h后，即实验第8天，将B1、B2点浓度的仿生骨膜浸提液充分浸透8 cm2(2 cm×4 cm)滤纸，在每只豚鼠的肩胛骨内侧精确敷贴，覆盖注射部位，对照组给予空白液，固定滤纸选用封闭式包扎带、压敏胶带等，注意固定的松紧适中，避免豚鼠窒息。(48±2) h后包扎带和敷贴片被完全去除。③连续记录2周各组豚鼠注射区的皮肤变化。
激发阶段：①在上述阶段完成后的(14±1) d，用同样的备皮方法在各豚鼠未实验部位即豚鼠上腹部分别备皮，左为1区，右为2区；②在主实验的第24天，用部位C选定的浓度，同样用各仿生骨膜浸提液或生理盐水充分浸透8 cm2(2 cm×4 cm)滤纸，对各组豚鼠备皮处进行刺激。
观察阶段：于(24±2) h将敷贴全部去除后，连续3 d观察豚鼠的皮肤反应，按照致敏反应计分标准，对敷贴部位的皮肤反应进行描述和计分，确保准确读数。根据形成红斑和焦痂的严重程度分为正常、轻微、明显、中度至重度和严重至轻微焦痂，依次计分0-4；根据皮肤水肿形成程度依次分为无、轻微、轻度、中度、重度水肿，依次计分0-4。
评价指标：在对照组大鼠计分< 1、实验组大鼠计分≥1时，提示材料有致敏体征。在对照组大鼠计分≥1，实验组大鼠反应较对照组最严重反应重时，提示材料致敏。当激发部位计分≥2时，即可认为材料致敏。
1.5 主要观察指标 4组仿生骨膜的生物相容性。
1.6 统计学分析将收集的临床信息及理化检查结果录入Excel表格中，采用SPSS 21.0软件进行数据统计分析，以α=0.05作为组间比较的检验水准。计量资料用Shapiro- Wilk行正态性检验，符合正态分布的计量资料用x±s，分类资料用例数表示。该文统计学方法已经新疆医科大学统计学专家审核。

讨论

经调查全球每年有超过2 000万的骨缺损患者[35]，通常是由骨肿瘤、创伤等导致，口腔种植技术也面临着骨缺损修复的问题。骨膜移植是治疗骨损伤最常用的方法之一[36]，然而天然骨膜移植仍有无法攻克的缺陷，比如常见的免疫排斥反应、有限的自体供体面积和数量等。基于此，研究者们将目光放向了骨组织替代材料。
生物陶瓷是一种常见的骨修复材料，主要指磷酸钙陶瓷，包括羟基磷灰石或β-磷酸三钙，由于优良的骨导电性和可吸收性被用于骨缺损修复的临床研究[37-38]，然而羟基磷灰石在骨组织工程中的发展一直受到机械性能较差的限制。Bio-oss骨粉是临床常用的骨组织替代材料，通常用于牙种植骨缺损的修复，具有低免疫原性、稳定性良好、植入成功率高的特点[39]，缺点是无压电性，无法通过电刺激促进骨的再生。课题组前期研究利用静电纺丝技术在制备PVDF压电仿生骨膜的过程中加入了对成骨有益的Zn2+、Mg2+，具有压电性的同时生物相容性良好，但是并没有将该材料植入大鼠皮下，其成骨和成血管化性能究竟如何尚不清楚，因此还需后续实验进行更深入的研究。
学者们将研究目光集中于骨修复材料时，忽视了骨组织的一个重要特性——压电性。PVDF是一种具有压电性的生物相容性材料，有学者利用静电纺丝法制备出聚氨酯/PVDF压电性细胞支架，体内外研究发现该支架的压电性可以刺激成纤维细胞，增强该细胞的迁移、黏附和分泌，为新型创伤敷料制备提供新思路[40]。研究者提出用PVDF作为制备医用纱布的主要材料，通过轻触或敲打伤者身上的纱布产生的微小电流，可以加速伤口愈合[41]。在骨缺损愈合过程中获得大的血管化骨组织仍然是一个巨大的挑战，有研究表明，许多离子成分对血管化和骨再生有显著影响，一些无机离子，如Mn2+作为酶的必要辅助因子可以激活离子通道或辅助信号传导，利于血管化和骨再生[42]；其他，如Zn2+、Mg2+、Sr2+可促进血管生成和成骨[43]。SARKAR等[44]的研究表明Zn2+对骨的形成有刺激作用，并且细胞增殖显著增加。
课题前期制备出的掺Zn2+、Mg2+ PVDF仿生骨膜预期应用于临床，有参考价值的生物学评价必须基于高质量的生物相容性实验。此次研究选取溶血实验、短期全身毒性实验、热源实验和致敏实验对PVDF仿生骨膜进行生物相容性评价，为应用于人体提供基础数据。溶血实验是为了检测材料或其浸提液有无毒性，该毒性能否导致血中的血红细胞溶解且有一定数量的血红蛋白逸出，游离在血浆和组织中[45]，是材料能否应用于临床的基本实验。溶血实验结果表明，掺Zn2+ PVDF仿生骨膜的溶血率虽然较PVDF仿生骨膜稍高，但仍在血液相容性的标准范围内，并且从组织病理切片中观察到Zn2+ 的加入并没有导致大鼠主要脏器出现异常表现，说明Zn2+ 在体内降解的过程在实验动物能承受的范围之内。掺Zn2+、Mg2+ PVDF仿生骨膜为一种不易降解的材料，降解后的产物是否会对人体产生毒害作用尚不知晓，因此进行短期全身毒性实验，为期14 d实验结果表明Zn2+、Mg2+成分进入大鼠体内后短期未见明显的全身毒性，没有导致大鼠体质量减轻、饮食减少、呼吸困难甚至死亡，大鼠主要器官未见明显的组织水肿等异常现象，说明掺Zn2+、Mg2+ PVDF仿生骨膜无短期全身毒性，该膜有无长期毒性还需进行长期全身毒性实验以得出更准确的结论。热源实验结果说明掺Zn2+、Mg2+ PVDF仿生骨膜对大鼠无致热作用。致敏实验观察结果显示，去除敷贴后24，48，72 h未见散发性、斑点状、重度红斑或水肿，实验组和对照组动物计分均小于1，表明掺Zn2+、Mg2+ PVDF仿生骨膜不存在潜在的致敏物质。
实验结果表明，静电纺丝PVDF压电仿生骨膜不溶血、无短期全身毒性、不致敏、不致热，具有较好的生物相容性。课题的设计和实现涉及到的许多需要解决的理论、方法和技术问题，均需要在以后的测试中加以积累和改进。后续研究可以选取长期全身毒性实验、植入实验、皮肤刺激或皮内反应实验等评价该仿生骨膜植入体内的安全性。若完善上述不足之处，相信静电纺丝PVDF压电仿生骨膜将在修复骨缺损的临床应用中有较好的发展潜力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

静电纺丝聚偏氟乙烯压电仿生骨膜的生物相容性评价

Biocompatibility of poly(vinylidene fluoride) piezoelectric bionic periosteum prepared by electrospinning

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