脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架促进大鼠皮肤缺损的修复

doi:10.12307/2025.229

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (4): 745-751.doi: 10.12307/2025.229

• 细胞外基质材料 extracellular matrix materials • 上一篇下一篇

脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架促进大鼠皮肤缺损的修复

吴辰1，江佳慧1，苏豆1，刘晨2，慈超1

皖南医学院第一附属医院，1皮肤性病科，2脊柱外科，安徽省芜湖市 241001

收稿日期:2023-11-18 接受日期:2024-01-25 出版日期:2025-02-08 发布日期:2024-05-30
通讯作者: 刘晨，博士，副教授，皖南医学院第一附属医院脊柱外科，安徽省芜湖市 241001 慈超，副教授，皖南医学院第一附属医院皮肤性病科，安徽省芜湖市 241001
作者简介:吴辰，女，1988年生，安徽省宿松县人，汉族，硕士，主治医师，主要从事皮肤性病科及皮肤缺损修复方面的研究。
基金资助:
安徽省自然科学基金面上项目(2208085MH211)，项目名称：多模态力学刺激下组织工程化纤维环的构建及纤维环修复的实验研究，项目负责人：刘晨

Decellularized skin matrix/polyurethane blended fibrous scaffolds promote repair of skin defects in rats

Wu Chen1, Jiang Jiahui1, Su Dou1, Liu Chen2, Ci Chao1

1Department of Dermatology, 2Department of Spine Surgery, First Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241001, Anhui Province, China

Received:2023-11-18 Accepted:2024-01-25 Online:2025-02-08 Published:2024-05-30
Contact: Liu Chen, PhD, Associate professor, Department of Spine Surgery, First Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241001, Anhui Province, China Corresponding author: Ci Chao, Associate professor, Department of Dermatology, First Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241001, Anhui Province, China
About author:Wu Chen, Master, Attending physician, Department of Dermatology, First Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241001, Anhui Province, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Anhui Province, No. 2208085MH211 (to LC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
脱细胞基质：是运用酶解、化学或机械等方法去除原有组织中的细胞成分，从而保存以细胞外基质为主的其他成分，不仅保留了细胞外基质的生物学功能，还明显降低了免疫原性。
静电纺丝：是一种利用聚合物溶液或熔体在强电场作用下形成喷射流进行纺丝加工的工艺，制备的材料纤维直径可达纳米级，具有较高的孔隙率和较大的比表面积。
背景：研究证实，将脱细胞基质与聚合物进行混合纺丝不仅可改善纤维的结构性质，还可保存脱细胞基质的生物学活性，但是目前将聚氨酯与脱细胞皮肤基质进行静电纺丝制备皮肤组织工程支架还没有相关报道。
目的：观察脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架对大鼠皮肤缺损的修复作用。
方法：利用静电纺丝技术分别制备聚氨酯静电纺丝纤维支架和脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架。扫描电镜下观察纤维结构；将大鼠脂肪间充质干细胞分别接种于两组支架上，扫描电镜下观察支架上的细胞形态。取10只SD大鼠，在每只大鼠背部制作3个1 cm×1 cm的全层皮肤缺损，其中2处缺损分别植入聚氨酯静电纺丝纤维支架(对照组)、脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架(实验组)，剩余缺损处不植入任何材料(空白对照组)。术后第1，2，3周，观察皮肤创面愈合情况；植入后第3周，进行创面苏木精-伊红染色，计算创面瘢痕面积。
结果与结论：①扫描电镜下可见两种静电纺丝纤维均为网状结构，并且大鼠脂肪间充质干细胞在两种支架上沿纤维附着，黏附良好。②随着术后时间的延长，各组皮肤创面逐渐愈合，至术后第3周，实验组、对照组皮肤创面基本愈合，空白对照组创面可见小溃疡形成。皮肤创面苏木精-伊红染色显示，对照组、实验组创面表皮覆盖基本完整，真皮层内可见成纤维细胞长入和炎症细胞浸润，并且实验组创面胶原纤维较为丰富、排列规则有序，与表皮面基本平行；空白对照组创面表皮仍有缺损。实验组创面瘢痕面积小于其他两组(P < 0.05，P < 0.01)。③结果表明，脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架可以有效修复大鼠全层皮肤缺损、改善创面瘢痕形成。
https://orcid.org/0000-0003-4825-0722(吴辰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 脱细胞皮肤基质, 聚氨酯, 静电纺丝, 皮肤缺损, 瘢痕

Abstract: BACKGROUND: It has been confirmed that the mixing of decellularized matrix and polymer electrospinning can not only improve the structural properties of fibers, but also preserve the biological decellularized of decellularized matrix. However, there is no relevant report on the preparation of skin tissue engineering scaffolds by electrospinning polyurethane and decellularized skin matrix.
OBJECTIVE: To investigate the reparative effect of a decellularized skin matrix/polyurethane blended fibrous scaffold on rat skin defects.
METHODS: Polyurethane electrospun fibrous scaffold and decellularized skin matrix/polyurethane blended fibrous scaffold were fabricated using the electrospinning technique. The fiber structure was observed under scanning electron microscope. Rat adipose mesenchymal stem cells were inoculated on two kinds of scaffolds respectively. The morphology of the scaffolds was observed under scanning electron microscope. Three full-thickness skin defects of 1 cm×1 cm were fabricated on the back of 10 SD rats. Polyurethane electrospun fibrous scaffolds (control group) and decellularized skin matrix/polyurethane blended fibrous scaffolds (experimental group) were implanted in two of the defects, and no material was implanted in the remaining defects (blank control group). The skin wound healing was observed at 1, 2, and 3 weeks after operation. At 3 weeks after implantation, the wound was stained with hematoxylin and eosin and the scar area was calculated.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Under scanning electron microscope, the two kinds of electrospun fibers were reticulated, and the rat adipose mesenchymal stem cells attached to the fibers on the two kinds of scaffolds, and the adhesion was good. (2) With the extension of the postoperative time, the skin wounds of each group gradually healed. By week 3 after the operation, the skin wounds of the experimental group and the control group were basically healed, and small ulcers could be seen on the wounds of the blank control group. Hematoxylin-eosin staining of skin wounds showed that the epidermal coverage of the wound was basically complete in the control group and the experimental group, and fibroblast growth and inflammatory cell infiltration could be seen in the dermis. In addition, the collagen fibers of the wound in the experimental group were abundant and arranged in a regular order, basically parallel to the epidermal surface. The wound epidermis of blank control group was still defective. The scar area of the experimental group was smaller than that of the other two groups (P < 0.05, P < 0.01). (3) These results indicate that the decellularized skin matrix/polyurethane blended fibrous scaffold can effectively repair full-thickness skin defects and improve scar formation in rats.

Key words: decellularized skin matrix, polyurethane, electrospinning, skin defect, scar

中图分类号:

吴辰, 江佳慧, 苏豆, 刘晨, 慈超. 脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架促进大鼠皮肤缺损的修复[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 745-751.

Wu Chen, Jiang Jiahui, Su Dou, Liu Chen, Ci Chao. Decellularized skin matrix/polyurethane blended fibrous scaffolds promote repair of skin defects in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(4): 745-751.

图/表（结果） 8

2.1 脱细胞皮肤基质的表征利用酶解法从猪皮中制备出了脱细胞皮肤基质，苏木精-伊红染色显示未行脱细胞之前猪皮可见细胞及皮肤附属器(图3A)，脱细胞之后可见脱细胞皮肤基质为胶原纤维，未见明显的细胞成分，说明脱细胞处理完全(图3B)。对脱细胞皮肤基质进行傅里叶变换红外光谱分析，发现了胶原蛋白的特征性吸收峰如酰胺一代为1 638.12 cm-1 ，说明脱细胞皮肤基质的主要成分为胶原(图4)。

2.2 静电纺丝支架的表征利用静电纺丝技术制备出脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架，透射电镜显示聚氨酯、脱细胞皮肤基质不均匀分布在单根纤维纺丝上(图5)，扫描电镜下可见两种静电纺丝支架均为网状结构(图6)，大鼠脂肪间充质干细胞在两种支架上沿纤维附着，并且黏附良好(图7)。

2.3 静电纺丝支架修复大鼠皮肤创面的效果
2.3.1 实验动物数量分析术后10只大鼠进食、进水、活动及精神状态等情况均正常。10只大鼠全部进入结果分析。
2.3.2 各组创面愈合情况随着术后时间的延长，3组创面逐渐愈合，至术后第3周，实验组、对照组创面基本愈合，空白对照组创面仍有小溃疡形成(图8)。

2.3.3 各组创面瘢痕面积比较术后第3周，对照组、实验组、空白对照组创面瘢痕平均面积分别为(18.16±3.15)，(14.37±2.43)，(22.35±5.89) mm2，3组创面瘢痕平均面积比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图9。

2.3.4 各组创面组织学观察术后第3周苏木精-伊红染色显示，对照组、实验组创面表皮覆盖基本完整，真皮层内可见成纤维细胞长入和炎症细胞浸润，其中实验组创面胶原纤维较为丰富、排列规则有序，与表皮面基本平行，炎性细胞少于对照组；空白对照组创面表皮仍有缺损
(图10)。

参考文献

[1] RANI S, RITTER T. The Exosome-A Naturally Secreted Nanoparticle and its Application to Wound Healing. Adv Mater. 2016;28(27):5542-5552.
[2] SCHLOTTMANN F, BUCAN V, VOGT PM, et al. A Short History of Skin Grafting in Burns: From the Gold Standard of Autologous Skin Grafting to the Possibilities of Allogeneic Skin Grafting with Immunomodulatory Approaches. Medicina. 2021;57(3):225.
[3] ZHANG X, XU W, HU X. Tissue-Engineered Skin Regenerative Units for Epidermal Keratinocytes Expansion and Wound Healing. Med Sci Monit. 2021;27:e932978.
[4] WANG YC, ZHANG Y, LI T, et al. Adipose Mesenchymal Stem Cell Derived Exosomes Promote Keratinocytes and Fibroblasts Embedded in Collagen/Platelet-Rich Plasma Scaffold and Accelerate Wound Healing. Adv Mater. 2023;35(40):e2303642.
[5] ZHOU GY, ZHU JY, INVERARITY C, et al. Fabrication of Fibrin/Polyvinyl Alcohol Scaffolds for Skin Tissue Engineering via Emulsion Templating. Polymers (Basel). 2023;15(5):1151.
[6] MA PF, LI MY, HU JL, et al. New skin tissue engineering scaffold with sulfated silk fibroin/chitosan/hydroxyapatite and its application. Biochem Biophys Res Commun. 2023;640:117-124.
[7] GSIB O, EGGERMONT LJ, EGLES C, et al. Engineering a macroporous fibrin-based sequential interpenetrating polymer network for dermal tissue engineering. Biomater Sci. 2020;8(24):7106-7116.
[8] ALAM MR, ALIMUZZAMAN S, SHAHID MA, et al. Collagen/ Nigella sativa/chitosan inscribed electrospun hybrid bio-nanocomposites for skin tissue engineering. J Biomater Sci Polym Ed. 2023;34(11):1517-1538.
[9] SU T, ZHANG MY, ZENG QK, et al. Mussel-inspired agarose hydrogel scaffolds for skin tissue engineering. Bioact Mater. 2020;6(3):579-588.
[10] VARGAS M, MARTINEZ-GARCIA F, OFFENS F, et al. Viscoelastic properties of plasma-agarose hydrogels dictate favorable fibroblast responses for skin tissue engineering applications. Biomater Adv. 2022; 139:212967.
[11] MOLINA MI, CHEN CA, MARTINEZ J, et al. Novel Electrospun Polycaprolactone/Calcium Alginate Scaffolds for Skin Tissue Engineering. Materials (Basel). 2022;16(1):136.
[12] GUO YJ, WANG XY, LI BB, et al. Oxidized sodium alginate crosslinked silk fibroin composite scaffold for skin tissue engineering. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2022;110(12):2667-2675.
[13] SALESA B, LLORENS-GÁMEZ M, SERRANO-AROCA Á. Study of 1D and 2D carbon nanomaterial in alginate films. Nanomaterials (Basel). 2020;10(2):206.
[14] XU J, FANG H, SU Y, et al. A 3D bioprinted decellularized extracellular matrix/gelatin/quaternized chitosan scaffold assembling with poly (ionic liquid)s for skin tissue engineering. Int J Biol Macromol. 2022;220: 1253-1266.
[15] XU J, FANG H, ZHENG SS, et al. A biological functional hybrid scaffold based on decellularized extracellular matrix/gelatin/chitosan with high biocompatibility and antibacterial activity for skin tissue engineering. Int J Biol Macromol. 2021;187:840-849.
[16] XIA B, KIM DH, BANSAL S, et al. Development of A Decellularized Meniscus Matrix-Based Nanofibrous Scaffold for Meniscus Tissue Engineering. Acta Biomater. 2021;128:175-185.
[17] BASARA G, OZCEBE SG, ELLIS BW, et al. Tunable human myocardium derived decellularized extracellular matrix for 3D bioprinting and cardiac tissue engineering. Gels. 2021;7(2):70.
[18] GAO X, WEN ML, LIU Y, et al. Synthesis and Characterization of PU/PLCL/CMCS Electrospun Scaffolds for Skin Tissue Engineering. Polymers (Basel). 2022;14(22):5029.
[19] HAJIKHANI M, EMAM-DJOMEH Z, ASKARI G. Fabrication and characterization of mucoadhesive bioplastic patch via coaxial polylactic acid (PLA) based electrospun nanofibers with an- timicrobial and wound healing application. Int J Biol Macromol. 2021;172:143-153.
[20] CHENG CC, YANG XJ, FAN WL, et al. Cytosine-Functionalized Supramolecular Polymer-Mediated Cellular Behavior and Wound Healing. Biomacromolecules. 2020;21(9):3857-3866.
[21] MOVAHEDI M, ASEFNEJAD A, RAFIENIA M, et al. Potential of novel electrospun core-shell structured polyurethane/starch (hyaluronic acid) nanofibers for skin tissue engineering: In vitro and in vivo evaluation. Int J Biol Macromol. 2020;146:627-637.
[22] LAKRA R, KIRAN MS, KORRAPATI PS, et al. Electrospun gelatin-polyethylenimine blend nanofibrous scaffold for biomedical applications. J Mater Sci Mater Med. 2019;30(12):129.
[23] JOY J, AID-LAUNAIS R, PEREIRA J, et al. Gelatin-polytrimethylene carbonate blend based electrospun tubular construct as a potential vascular biomaterial. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020;106:110178.
[24] PATEL KH, TALOVIC M, DUNN AJ, et al. Aligned nanofibers of decellularized muscle extracellular matrix for volumetric muscle loss. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2020;108(6):2528-2537.
[25] GAO S, GUO WM, CHEN MX, et al. Fabrication and characterization of electrospun nanofibers composed of decellularized meniscus extracellular matrix and polycaprolactone for meniscus tissue engineering. J Mater Chem B. 2017;5(12):2273-2285.
[26] LIU C, JIN ZX, GE X, et al. Decellularized Annulus Fibrosus Matrix/Chitosan hydrogels for annulus fibrous tissue engineering. Tissue Eng Part A. 2019;25(23-24):1605-1613.
[27] NAMVIRIYACHOTE N, MUANGMAN P, CHINAROONCHAI K, et al. Polyurethanebiomacromolecule combined foam dressing containing asiattcoside: fabricatton, characterizatton and clinical efffcacy for traumattc dermal wound treatment. Int J Biol Macromol. 2020;143: 510-520.
[28] SADEGHIANMARYAN A, KARIMI Y, NAGHIEH S, et al. Electrospinning of Scaffolds from the Polycaprolactone/Polyurethane Composite with Graphene Oxide for Skin Tissue Engineering. Appl Biochem Biotechnol. 2020;191(2):567-578.
[29] SOLARTE DAVID VA, GÜIZA-ARGÜELLO VR, ARANGO-RODRÍGUEZ ML,
et al. Decellularized Tissues for Wound Healing: Towards Closing the Gap Between Scaffold Design and Effective Extracellular Matrix Remodeling. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:821852.
[30] CHAUDHARI AA, VIG K, BAGANIZI DR, et al. Future Prospects for Scaffolding Methods and Biomaterials in Skin Tissue Engineering: A Review. Int J Mol Sci. 2016;17(12):1974.
[31] SHEIKHOLESLAM M, WRIGHT MEE, CHENG N, et al. Electrospun Polyurethane-Gelatin Composite: A New Tissue-Engineered Scaffold for Application in Skin Regeneration and Repair of Complex Wounds. ACS Biomater Sci Eng. 2020;6(1):505-516.
[32] PRASAD T, SHABEENA EA, VINOD D, et al. Characterization and in vitro evaluation of electrospun chitosan/polycaprolactone blend fibrous mat for skin tissue engineering. J Mater Sci Mater Med. 2015;26(1):5352.
[33] PEREIRA AL, SEMITELA Â, GIRÃO AF, et al. Three-dimensional nanofibrous and porous scaffolds of poly(ε-caprolactone)-chitosan blends for musculoskeletal tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 2023;111(7):950-961.
[34] HERNÁNDEZ-RANGEL A, MARTIN-MARTINEZ ES. Collagen based electrospun materials for skin wounds treatment.J Biomed Mater Res A. 2021;109(9):1751-1764.
[35] GIL-CIFUENTES L, JIMÉNEZ RA, FONTANILLA MR. Evaluatton of collagen type I scaffolds including gelattn-collagen microparttcles and Aloe vera in a model of full-thickness skin wound. Drug Deliv Transl Res. 2019;9(1):25-36.
[36] GILPIN A, YANG Y. Decellularization Strategies for Regenerative Medicine: From Processing Techniques to Applications. Biomed Res Int. 2017:2017:9831534.
[37] 郭宝林,陈志强,王术勇,等.猪皮细胞外基质促进创伤小鼠再表皮化的实验研究[J].军事医学,2018,42(3):169-175,181.
[38] CARVALHO J, ZANATA F, ALOISE AC, et al. Acellular dermal matrix in skin wound healing in rabbits - histological and histomorphometric analyses. Clinics (Sao Paulo). 2021;76:e2066.
[39] QI YJ, DONG ZX, CHU HZ, et al. Denatured acellular dermal matrix seeded with bone marrow mesenchymal stem cells for wound healing in mice. Burns. 2019;45(7):1685-1694.
[40] GHORBANI F, MORADI L, SHADMEHR MB, et al. In-vivo characterization of a 3D hybrid scaffold based on PCL/decellularized aorta for tracheal tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2017;81:74-83.

引言

烧伤、创伤和难治性皮肤溃疡等均可造成皮肤缺损，不仅严重影响患者的外观和功能，同时给患者造成严重的心理负担[1]。临床上常用自体皮修复皮肤缺损，但是存在供区受损、来源有限且术后瘢痕挛缩影响功能等缺点[2]。近年来皮肤组织工程发展日新月异，其利用生物学和工程学原理构建出皮肤替代物，移植于需要修复、重建的皮肤病损处，为皮肤缺损修复提供了新的治疗方式[3-5]。
合适的支架材料是组织工程皮肤领域的核心和热点，目前广泛应用的皮肤组织工程支架有天然生物材料、合成高分子材料及复合材料等。天然生物材料包括丝素蛋白[6]、纤维蛋白[7]、壳聚糖[8]、琼脂糖[9-10]、藻酸盐[11-13]、脱细胞基质等[14-15]，其中脱细胞基质是运用化学、酶解或机械等方法去除组织中的细胞成分，而保存以细胞外基质为主的其他成分，不仅维持了材料原有的力学特性和生物学功能，还明显降低了材料的免疫原性[16]。由于脱细胞基质保留了大量的细胞外基质和原有组织的部分结构，有利于各种细胞黏附、扩增和分化的同时还可以促进组织的再生[17]。但是脱细胞皮肤基质的力学性能较差，单独作为皮肤组织工程的支架材料仍存在不足，因而需要适宜的材料加强其力学性能。
合成高分子材料包括聚氨酯、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇等[18-20]，其中聚氨酯是主链上含有重复氨基甲酸酯基团的大分子化合物，目前已被经广泛应用于皮肤组织工程[21]。作为外源高分子材料，聚氨酯本身或降解产物均具有一定的免疫原性，可引起炎症反应，不利于皮肤缺损的愈合。复合材料是将2种或2种以上具有互补特征的材料按一定比例和方式组合，设计出性能优越的三维支架材料。
静电纺丝是一种利用聚合物溶液或熔体在强电场作用下形成喷射流进行纺丝加工的工艺，制备的材料纤维直径可达纳米级，具有较高的孔隙率和较大的比表面积[22]。将脱细胞基质与聚合物进行混合纺丝，不仅改善了纤维的结构性质，还保存了脱细胞基质的生物学活性[23]，例如：将脱细胞肌肉基质和脱细胞半月板基质分别与聚合物混纺，不仅提高了力学性能，还改善了细胞的黏附、扩增和分化能力[24-25]。但是，目前将聚氨酯与脱细胞皮肤基质进行静电纺丝制备皮肤组织工程支架还没有相关报道。此次实验拟制备脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架，以期获得与实际皮肤组织相似的仿生皮肤，应用于皮肤缺损的修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料制备，体外细胞实验+体内动物实验，组间差异采用方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年12月至2023年11月在皖南医学院第一附属医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 10只雄性SD大鼠，6-8周龄，体质量250 g左右，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，使用许可证号：SYXK(冀)2021-006。实验方案已获得皖南医学院伦理委员会批准(受理编号：LLSC-2022-105)。
1.3.2 细胞、试剂与仪器 SD大鼠脂肪间充质干细胞购自广州赛业公司；聚氨酯购自上海维塔化学试剂有限公司；DNase和RNase购自美国Thermo Fisher公司；0.25%胰蛋白酶、南美胎牛血清和DMEM-HG 培养基购自美国Gibco公司；Triton X-100和六氟异丙醇购自上海阿拉丁试剂有限公司；HZ-02汇智电纺机购自青岛诺康环保科技有限公司；JEM-1200EX型透射电镜和JSM-840型扫描电镜购自日本电子株式会社；NICOLET iS10型傅里叶变换红外线光谱分析仪购自美国赛默飞公司。
1.4 方法

1.4.1 脱细胞皮肤基质的制备及表征将猪皮组织(来源于菜市场普通猪肉的猪皮)剪碎成大小约为1 mm×1 mm×1 mm的组织块放于研钵中，加入液氮冷冻使猪皮组织块僵硬；用研钵将组织进一步碾碎移入50 mL离心管中，加入0.25%胰酶溶液，放于37 ℃恒温振荡器中消化24 h，每4 h更换1次胰酶；用PBS洗3次，每次30 min；加入核酶溶液(DNase浓度为50 U/mL，RNase 浓度为1 U/mL)，置于37 ℃恒温振荡器消化12 h；用1%Triton X-100溶液常温下处理24 h；2 000 r/min离心10 min，去上清，将组织沉淀用PBS清洗6次，每次8 h；2 000 r/min离心10 min，去上清，将沉淀在37 ℃ 恒温烘干箱中烘干，获得脱细胞皮肤基质(图1)[26]。通过苏木精-伊红染色观察猪脱细胞皮肤基质的脱细胞效果；通过傅里叶变换红外线光谱分析仪分析脱细胞皮肤基质的主要成分。

1.4.2 静电纺丝支架的制备和表征将1.5 g聚氨酯和0.6 g脱细胞皮肤基质均溶于6 g六氟异丙醇中，制备聚氨酯质量分数为25%和脱细胞皮肤基质质量分数为10%的混合溶液，利用静电纺丝装置对上述混合溶液进行纺丝，喷头和接收器的距离为15 cm，接收器转速为200 r/min，获得脱细胞皮肤基质/聚氨酯混合纺丝支架。将1.5 g聚氨酯溶于6 g六氟异丙醇制备质量分数为25%的聚氨酯溶液，利用静电纺丝装置对聚氨酯溶液进行纺丝，喷头和接收器的距离为15 cm，接收器转速为200 r/min，获得聚氨酯静电纺丝支架。通过透射电镜观察脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架的单根纤维结构；通过扫描电镜观察两种静电纺丝支架的三维结构。
1.4.3 SD大鼠脂肪间充质干细胞在静电纺丝支架上的培养 SD大鼠脂肪间充质干细胞复苏后培养至第3代，所用培养基为含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。将两种静电纺丝支架用60Co辐照灭菌，剂量为15 kGy，放置于24孔细胞培养板中，随后将SD大鼠脂肪间充质干细胞接种于两种静电纺丝支架上，细胞密度为2 000个/孔。培养3 d后，将细胞-支架复合物用PBS清洗2次，2.5%戊二醛固定30 min，分别用体积分数50%，60%，70%，80%，90%和95%乙醇溶液和无水乙醇依次梯度脱水10 min，扫描电镜下观察细胞在支架上的形态。
1.4.4 两种静电纺丝支架修复大鼠皮肤缺损实验

皮肤缺损模型的建立和植皮过程：取10只雄性SD大鼠，异氟烷吸入性麻醉后俯卧位固定，术区脱毛，背部切除全层皮肤至肌肉筋膜，每只大鼠背部作3个同样大小的皮肤缺损，创面大小约1 cm×1 cm，缺损间距为1.5 cm左右。创面建立后，用生理盐水及适量青霉素液浸洗创面，3个创面作如下处理(图2)：创面1植入灭菌后的聚氨酯静电纺丝纤维支架(对照组)，创面2为植入灭菌后的脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架(实验组)，将材料平铺在皮肤创面上，适当拉伸并轻压静电纺丝支架，用单层凡士林纱布覆盖静电纺丝支架，油纱上覆盖纱布；创面3不植入任何材料(空白对照组)，任其自然愈合，用单层凡士林纱布覆盖创面，油纱上覆盖纱布。

创面愈合观察：术后第1周打开纱布，观察创面愈合情况，有无感染，移植物与自体正常皮肤融合情况。术后第3周对创面进行拍照，同时使用Dragonfly图像分析软件(版本号：2022.1，加拿大蒙特利尔)分析得出各组创面瘢痕面积。
组织学观察：术后第3周切取创面移植物后迅速固定，梯度乙醇脱水处理，二甲苯透明，将石蜡浸入组织中，取代组织中的透明剂，石蜡包埋，切片、铺片，贴片、烘片，依次将切片放入二甲苯Ⅰ 10 min、二甲苯Ⅱ 10 min、无水乙醇Ⅰ 5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、体积分数95%乙醇5 min、体积分数90%乙醇5 min、体积分数80%乙醇5 min、体积分数70%乙醇5 min，蒸馏水洗。切片入Harris苏木精染液染8 min，自来水洗，1%盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗，0.6%氨水返蓝，流水冲洗。切片入伊红染液中染色3 min，脱水封固，显微镜下观察。
1.5 主要观察指标两组静电纺丝支架上大鼠脂肪间充质干细胞的形态，以及修复大鼠皮肤缺损的效果。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计学软件分析。计量资料用x±s表示，组间差异采用方差分析，组间差异采用方差分析，通过对3组数据方差齐性检验结果判断，选用 Welch方差分析的校正统计结果，P < 0.05表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经皖南医学院生物统计学专家审核。

讨论

理想的组织工程皮肤支架材料应具备较好的组织相容性、机械强度和可降解性。聚氨酯人造皮肤因能够避免细菌感染等特性也被逐步应用于临床，例如：NAMVIRIYACHOTE等[27]制备了多种聚氨酯组合泡沫敷料应用于创伤性皮肤创面患者，发现该泡沫敷料可以促进创面愈合；SADEGHIANMARYAN等[28]制备了聚氨酯/聚己内酯静电纺丝纤支架，发现该支架对皮肤成纤维细胞具有生物相容性，证明了该支架在皮肤组织工程中的潜在用途。但聚氨酯是人工合成聚合物，植入体内后会引起免疫反应。脱细胞皮肤基质与皮肤的天然成分接近，具有更为优秀的生物相容性[29]，同时减少了对移植物的免疫反应，但其力学性能较差。单一的基材难以同时满足生物相容性和力学强度的要求，因此同时拥有人工合成材料和天然材料优势的复合材料应运而生，为皮肤组织工程的支架的制备提供了新的思路[30]。SHEIKHOLESLAM等[31]将20%聚氨酯引入明胶支架制备成明胶80-聚氨酯20支架，在不改变细胞活性的情况下可显著提高支架的抗降解性、抗屈强度和伸长率，动物实验表明该支架植入相较于真皮再生基质植入的巨噬细胞和肌成纤维细胞更少。PRASAD等[32]制备了壳聚糖/聚己内酯静电纺丝纤维支架和聚己内酯静电纺丝纤维支架，将人类角质细胞(HaCaT)和大鼠成纤维细胞(L-929)分别种植到两种支架上，评估细胞黏附、存活、增殖和肌动蛋白分布情况，结果表明壳聚糖/聚己内酯静电纺丝纤维支架适合角质细胞的附着和增殖，是一种潜在的用于皮肤组织工程的材料。因此，此次实验将人工合成材料聚氨酯良好的机械强度和天然材料脱细胞皮肤基质良好的组织相容性和可降解性优势相结合，制备出脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架用于大鼠皮肤缺损的修复。
从大鼠植皮区愈合情况来看，术后第3周聚氨酯静电纺丝纤维支架组和脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架组的创面已经基本愈合，而空白对照组大鼠背部植皮区仍有小面积皮肤溃疡，支架组创面愈合较快的原因可能和支架的三维结构相关：扫描电镜下可见两种支架材料均为三维纤维网状多孔结构，具有较高的比表面积，细胞不仅可以在支架表面沿着纤维黏附生长，还可以生长至支架内部，较高的孔隙率尽可能模拟细胞外基质的三维立体结构，允许细胞营养物质的适当交换[33]。Dragonfly图像软件分析结果显示，脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架组术后第3周的瘢痕面积小于聚氨酯静电纺丝纤维支架组和空白对照组。创面瘢痕苏木精-伊红染色结果显示脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架组的真皮层胶原纤维较为丰富，排列规则有序，与表皮面基本平行，说明脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架较聚氨酯混纺纤维支架有着较强的创面修复能力，推测脱细胞皮肤基质在其中扮演关键角色。
脱细胞皮肤基质是将供体皮肤去细胞化而保留其结构和生物活性物质。此次实验利用酶解法制备出猪脱细胞皮肤基质，苏木精-伊红染色显示其没有细胞残留，傅里叶变化红外光谱结果显示其主要成分为胶原。胶原蛋白是一种具有优秀特性的纤维蛋白，具有优良的生物相容性、可降解性以及促进细胞附着和增殖的能力[34]。GIL-CIFUENTES等[35]的研究表明，成纤维细胞可在胶原支架上保持细胞活性与增殖速率，刺激创面愈合加快。GILPIN等[36]证实了脱细胞皮肤基质内含有多种信号因子，能有效地促进细胞黏附、增殖、分化和细胞外基质分泌，进而促进创面愈合。先前的相关研究也证实，脱细胞皮肤基质有助于皮肤缺损的修复。郭宝林等[37]将猪皮脱细胞基质用于修复小鼠全层皮肤损伤，术后2周发现猪皮脱细胞基质组大鼠皮肤创面已经愈合，明显低于生理盐水组(4周)，说明脱细胞皮肤基质可以促进创面愈合。CARVALHO等[38]用组织学和组织形态计量学分析脱细胞真皮基质对兔皮肤创面愈合的影响，发现使用脱细胞真皮基质增加了真皮和表皮层的厚度以及Ⅰ型和Ⅲ型胶原的量。QI等[39]的研究发现，由焦痂切开后丢弃的烧伤皮肤制备而成的变性脱细胞真皮基质也具有促进创面愈合的作用，对变性脱细胞真皮基质制备方法进行了改进，并且将骨髓间充质干细胞-变性脱细胞真皮基质复合体植入小鼠皮肤创面，发现骨髓间充质干细胞存活良好，该复合体显著促进了创面愈合。
苏木精-伊红染色结果显示，脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架植入组创面内炎性细胞较少，分析可能和混纺纤维支架中含有脱细胞皮肤基质有关，因脱细胞皮肤基质的主要成分是胶原，其加入复合支架后的免疫原性显著降低，植入创面后排异反应较为轻微，这与之前的研究结果相似。GHORBANI等[40]制备了Ⅰ型胶原蛋白/聚己内酯静电纺丝纤维支架植入兔胸锁乳突肌中，苏木精-伊红染色和阿尔新蓝染色显示其生物相容性优于表面接枝了Ⅰ型胶原蛋白的聚己内酯静电纺丝纤维支架。
实验仍有一定的局限性：没有观察脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架在大鼠体内的降解；没有将大鼠移植创面行免疫组织化学染色观察炎性和皮肤蛋白(细胞角蛋白10和细胞角蛋白14)表达情况；没有从细胞层面分析大鼠脂肪间充质干细胞在两种静电纺丝支架上的皮肤细胞外基质相关基因表达和蛋白分泌请况。在未来的研究中，会将大鼠脂肪间充质干细胞种植到两种静电纺丝支架上，同时予以碱性成纤维细胞生长因子诱导，观察细胞在支架上的黏附及增殖情况、皮肤相关基质Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白分泌情况；将两种静电纺丝支架植入大鼠皮下，观察两种支架在大鼠体内的降解情况；对大鼠创面行免疫组织化学染色，观察两种支架植入大鼠皮肤创面后的炎性和皮肤蛋白(细胞角蛋白10和细胞角蛋白14)表达情况。
实验通过混合静电纺丝技术制备出脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架，相对于聚氨酯静电纺丝纤维支架可以有效地修复大鼠全层皮肤缺损，改善创面瘢痕形成，可以作为一种良好的皮肤组织工程支架材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

脱细胞皮肤基质/聚氨酯混纺纤维支架促进大鼠皮肤缺损的修复

Decellularized skin matrix/polyurethane blended fibrous scaffolds promote repair of skin defects in rats

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[1]	张煜, 徐睿安, 方蕾, 历龙飞, 刘姝妍, 丁凌雪, 王悦熹, 郭子琰, 田丰, 薛佳佳. 梯度人工骨修复支架调控骨骼系统组织的修复与再生[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 846-855.
[2]	孙现娟, 王秋花, 张锦艺, 杨杨杨, 王文双, 张晓晴. 不同静电纺丝膜上骨髓间充质干细胞的黏附、增殖与成血管平滑肌分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 661-669.
[3]	李永航, 李文铭, 严才平, 王星宽, 向超, 张袁, 蒋科, 陈路. 抗纤维化与促“H”型血管核壳结构生物支架修复临界骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(16): 3420-3431.