C57BL/6新生乳鼠肠神经胶质细胞的提取与培养

doi:10.12307/2025.546

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (31): 6656-6660.doi: 10.12307/2025.546

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

C57BL/6新生乳鼠肠神经胶质细胞的提取与培养

赵楠1，丁勇1，修航2，刘鹏飞2，梁国刚2

大连医科大学附属第一医院，1中西医结合临床国家重点学科实验室，2普外三科，辽宁省大连市 116000

收稿日期:2024-06-27 接受日期:2024-08-31 出版日期:2025-11-08 发布日期:2025-02-20
通讯作者: 梁国刚，博士，主任医师，大连医科大学附属第一医院普外三科，辽宁省大连市 116000
作者简介:赵楠，女，1996年生，山西省运城市人，汉族，大连医科大学在读硕士，主要从事中西医结合胃肠动力障碍方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81873164)，项目负责人：梁国刚

Extraction and culture of enteric glial cells from C57BL/6 newborn neonatal mice

Zhao Nan1, Ding Yong1, Xiu Hang2, Liu Pengfei2, Liang Guogang2

1National Key Laboratory of Clinical Integration of Traditional Chinese and Western Medicine, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116000, Liaoning Province, China; 2Third Department of General Surgery, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116000, Liaoning Province, China

Received:2024-06-27 Accepted:2024-08-31 Online:2025-11-08 Published:2025-02-20
Contact: Liang Guogang, MD, Chief physician, Third Department of General Surgery, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116000, Liaoning Province, China
About author:Zhao Nan, Master candidate, National Key Laboratory of Clinical Integration of Traditional Chinese and Western Medicine, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116000, Liaoning Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81873164 (to LGG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

肠神经胶质细胞：是肠神经系统内固有的免疫效应细胞，其分泌的激素、神经递质或蛋白等细胞外信号可与肠神经元上特异性受体结合，促进肠神经元的存活或启动神经元发生程序性细胞死亡，从而对肠神经系统内肠神经元的数量进行调控。
肠神经系统：中枢神经系统外最大的神经元和胶质细胞的集合体，主要由肌间神经丛和黏膜下神经丛两大神经丛组成神经网络结构，是胃肠道功能和神经反射通路的主要调节器，被称为“第二大脑”或“肠脑”，可独立于中枢神经系统控制肠道运动，协调黏膜的液体交换、局部血流和运动模式以及内分泌功能，并调控对感觉刺激做出反应的上皮细胞活动。

摘要
背景：炎症性肠病的发病机制涉及炎症、免疫激活、内脏高敏感、肠道菌群失调等，其中炎症促使免疫细胞释放炎症递质，损伤肠神经系统。肠神经胶质细胞是肠神经系统的重要组成部分，是研究肠道神经炎症的良好细胞。原代肠神经胶质细胞对于探索肠神经系统疾病的细胞疗法具有至关重要的作用，而目前获得该细胞的方法大多较繁琐，因此找到一种便捷、快速提取该细胞的方法十分关键。
目的：建立优化分离培养及鉴定小鼠肠神经胶质细胞的方法。
方法：通过过量吸入异氟烷处死0-7 d龄C57BL/6乳鼠，将其浸泡于体积分数75%乙醇消毒后腹正中线开腹取出十二指肠(幽门下1 cm至屈氏韧带上1 cm)，用1 mL注射器充满DPBS反复冲洗肠内容物至肠道半透明，剥离肠系膜及血管。将十二指肠剪至1 mm大小，放入含0.25%EDTA胰酶中消化20 min后加入等量DMEM/F12完全培养基终止消化，用100 μm细胞滤器过滤后离心，加入1 mL DMEM/F12完全培养基重悬后培养细胞，细胞贴壁生长密度至80%时消化传代。细胞培养至第3代时用标记肠神经胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白进行免疫荧光鉴定。
结果与结论：分离培养的细胞胶体饱满，突起向外延展，可以传代，胶质纤维酸性蛋白染色阳性。该方法可成功分离培养肠神经胶质细胞，且操作简便，为肠神经系统的病理生理学研究提供稳定的模型。

https://orcid.org/0009-0008-5051-2748 (赵楠)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 肠神经胶质细胞, 乳鼠, 细胞培养, 炎症性肠病, 肠神经系统, 胶质纤维酸性蛋白, 工程化细胞

Abstract: BACKGROUND: The pathogenesis of inflammatory bowel disease involves inflammation, immune activation, visceral hypersensitivity, and dysbiosis of the gut microbiota. Inflammation promotes the release of inflammatory mediators by immune cells, damaging the enteric nervous system. Enteric glial cells are an important component of the intestinal nervous system and are excellent cells for studying intestinal neuroinflammation. Primary enteric glial cells play a crucial role in exploring cell therapies for intestinal nervous system diseases. Currently, the methods for obtaining these cells are mostly cumbersome. Therefore, finding a convenient and fast method for extracting this cell is crucial.
OBJECTIVE: To establish a method for optimizing the isolation, culture, and identification of mouse enteric glial cells.
METHODS: 0-7-day-old C57BL/6 neonatal mice were euthanized by excessive inhalation of isoflurane. After soaking in 75% alcohol for disinfection, the duodenum (1 cm below the pylorus to 1 cm above the Qu's ligament) was removed by laparotomy at the midline of the abdomen. A 1 mL syringe was filled with DPBS and the intestinal contents were repeatedly rinsed until the intestine became translucent, and the mesentery and blood vessels were peeled off. The duodenum was cut to a size of 1 mm and digested in 0.25% EDTA trypsin for 20 minutes. Then an equal amount of DMEM/F12 complete culture medium was added to terminate digestion. The liquid was filtered through a 100 μm cell filter, centrifuged, and the cells were resuspended in 1 mL of DMEM/F12 complete culture medium. When the cell adhesion growth density reached 80%, cells were digested for subculture. When cells were cultured to the third generation, glial fibrillary acid protein labeled with enteric glial cells was used for identification by immunofluorescence method.
RESULTS AND CONCLUSION: The isolated and cultured cells were full of colloids, with protrusions extending outward and passable. Glial fibrillary acid protein staining was positive. This method can successfully isolate and culture enteric glial cells and is easy to operate, providing a stable model for the study of the pathophysiology of the enteric nervous system.

Key words: enteric glial cell, neonatal mouse, cell culture, inflammatory bowel disease, enteric nervous system, glial fibrillary acidic protein, engineered cell

中图分类号:

赵楠, 丁勇, 修航, 刘鹏飞, 梁国刚. C57BL/6新生乳鼠肠神经胶质细胞的提取与培养[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6656-6660.

Zhao Nan, Ding Yong, Xiu Hang, Liu Pengfei, Liang Guogang. Extraction and culture of enteric glial cells from C57BL/6 newborn neonatal mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(31): 6656-6660.

图/表（结果） 2

参考文献

[1] VICENTINI FA, KEENAN CM, WALLACE LE, et al. Intestinal microbiota shapes gut physiology and regulates enteric neurons and glia. Microbiome. 2021 26;9(1):210.
[2] SINGH N, BERNSTEIN CN. Environmental risk factors for inflammatory bowel disease. United European Gastroenterol J. 2022;10(10): 1047-1053.
[3] KHOR B, GARDET A, XAVIER RJ. Genetics and pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 2011;474(7351):307-317.
[4] LI H, FAN C, LU H, et al. Protective role of berberine on ulcerative colitis through modulating enteric glial cells-intestinal epithelial cells-immune cells interactions. Acta Pharm Sin B. 2020;10(3):447-461.
[5] SCHNEIDER KM, BLANK N, ALVAREZ Y, et al. The enteric nervous system relays psychological stress to intestinal inflammation. Cell. 2023; 186(13):2823-2838.e20.
[6] SUMAN S. Enteric Nervous System Alterations in Inflammatory Bowel Disease: Perspectives and Implications. Gastrointest Disord (Basel). 2024;6(2):368-379.
[7] LE BERRE C, NAVEILHAN P, ROLLI-DERKINDEREN M. Enteric glia at center stage of inflammatory bowel disease. Neurosci Lett. 2023;809:137315.
[8] THOMASI B, GULBRANSEN B. Mini-review: Intercellular communication between enteric glia and neurons. Neurosci Lett. 2023;806:137263.
[9] SHARKEY KA, MAWE GM. The enteric nervous system. Physiol Rev. 2023;103(2):1487-1564.
[10] SCHNEIDER KM, KIM J, BAHNSEN K, et al. Environmental perception and control of gastrointestinal immunity by the enteric nervous system. Trends Mol Med. 2022;28(11):989-1005.
[11] AHMADZAI MM, SEGUELLA L, GULBRANSEN BD. Circuit-specific enteric glia regulate intestinal motor neurocircuits. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118(40):e2025938118.
[12] LE BERRE C, NAVEILHAN P, ROLLI-DERKINDEREN M. Enteric glia at center stage of inflammatory bowel disease. Neurosci Lett. 2023;809:137315.
[13] RAO M, GULBRANSEN BD. Enteric Glia. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2024:a041368.
[14] THOMASI B, VALDETARO L, RICCIARDI MC, et al. Enteric glia as a player of gut-brain interactions during Parkinson’s disease. Front Neurosci. 2023;17:1281710.
[15] THOMASI B, VALDETARO L, GULBRANSEN B, et al. Neuroimmune Connectomes in the Gut and Their Implications in Parkinson’s Disease. Mol Neurobiol. 2024;61(4):2081-2098.
[16] SUNARDI M, CIRILLO C. Mini-review: “Enteric glia functions in nervous tissue repair: Therapeutic target or tool?”. Neurosci Lett. 2023;812: 137360.
[17] ZIEGLER AL, CALDWELL ML, CRAIG SE, et al. Enteric glial cell network function is required for epithelial barrier restitution following intestinal ischemic injury in the early postnatal period. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2024;326(3):G228-G246.
[18] WALLRAPP A, YANG D, CHIU IM. Enteric glial cells mediate gut immunity and repair. Trends Neurosci. 2022;45(4):251-253.
[19] ZHANG X, QI F, YANG J, et al. Distribution and ultrastructural characteristics of enteric glial cell in the chicken cecum. Poult Sci. 2024;103(10):104070.
[20] SCHONKEREN SL, KÜTHE TT, IDRIS M, et al. The gut brain in a dish: Murine primary enteric nervous system cell cultures. Neurogastroenterol Motil. 2022;34(2):e14215.
[21] TERAMOTO H, HIRASHIMA N, TANAKA M. A Simple Method for Purified Primary Culture of Enteric Glial Cells from Mouse Small Intestine. Biol Pharm Bull. 2022;45(4):547-551.
[22] ZANOLETTI L, VALDATA A, NEHLSEN K, et al. Cytological, molecular, cytogenetic, and physiological characterization of a novel immortalized human enteric glial cell line. Front Cell Neurosci. 2023;17:1170309.
[23] SMITH TH, NGWAINMBI J, GRIDER JR, et al. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. J Vis Exp. 2013;(78):50688.
[24] WANG Z, OCADIZ-RUIZ R, SUNDARESAN S, et al. Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse. J Vis Exp. 2018;(138):57629.
[25] WINDSTER JD, SACCHETTI A, SCHAAF GJ, et al. A combinatorial panel for flow cytometry-based isolation of enteric nervous system cells from human intestine. EMBO Rep. 2023;24(4):e55789.
[26] 李娜,高慧,张煜鑫,等.胚胎小鼠肠神经胶质细胞的分离与鉴定[J].神经解剖学杂志,2019,35(6):636-640.
[27] SCAVUZZO MA, LETAI KC, MAENO-HIKICHI Y, et al. Enteric glial hub cells coordinate intestinal motility. bioRxiv [Preprint]. 2023:2023. 06.07.544052.
[28] SANTHOSH S, ZANOLETTI L, STAMP LA, et al. From diversity to disease: unravelling the role of enteric glial cells. Front Immunol. 2024;15: 1408744.
[29] WANG F, LI N, WEI X, et al. MRI-Guided Focused Ultrasound-Induced Blood Brain Barrier Disruption to Deliver Glial Cell Line Derived Neurotropic Factor Proteins into Brain to Treat Rat Depression. J Biomed Nanotechnol. 2020;16(5):626-639.
[30] CERANTOLA S, CAPUTI V, MARSILIO I, et al. Involvement of Enteric Glia in Small Intestine Neuromuscular Dysfunction of Toll-Like Receptor 4-Deficient Mice. Cells. 2020;9(4):838.
[31] HE Y, HARA H, NÚÑEZ G. Mechanism and Regulation of NLRP3 Inflammasome Activation. Trends Biochem Sci. 2016;41(12):1012-1021.
[32] NEUNLIST M, ROLLI-DERKINDEREN M, LATORRE R, et al. Enteric glial cells: recent developments and future directions. Gastroenterology. 2014;147(6):1230-1237.
[33] SHARKEY KA. Emerging roles for enteric glia in gastrointestinal disorders. J Clin Invest. 2015;125(3):918-925.
[34] REALE O, BODI D, HUGUET A, et al. Role of enteric glial cells in the toxicity of phycotoxins: Investigation with a tri-culture intestinal cell model. Toxicol Lett. 2021;351:89-98.
[35] WANG X, WU J, LIU X, et al. Engineered liposomes targeting the gut-CNS Axis for comprehensive therapy of spinal cord injury. J Control Release. 2021;331:390-403.
[36] SCHULTE S, DECKER D, NOWDURI B, et al. Improving morphological and functional properties of enteric neuronal networks in vitro using a novel upside-down culture approach. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2024;326(5):G567-G582.
[37] LEFÈVRE MA, SORET R, PILON N. Harnessing the Power of Enteric Glial Cells’ Plasticity and Multipotency for Advancing Regenerative Medicine. Int J Mol Sci. 2023;24(15):12475.
[38] BAGHDADI MB, KIM TH. The multiple roles of enteric glial cells in intestinal homeostasis and regeneration. Semin Cell Dev Biol. 2023; 150-151:43-49.
[39] DRUMM BT, COBINE CA, BAKER SA. Insights on gastrointestinal motility through the use of optogenetic sensors and actuators. J Physiol. 2022; 600(13):3031-3052.
[40] DURAND T, PAUL-GILLOTEAUX P, GORA M, et al. Visualizing enteric nervous system activity through dye-free dynamic full-field optical coherence tomography. Commun Biol. 2023;6(1):236.

引言

炎症性肠病是消化系统常见的疾病之一，以肠道慢性炎症为特征，缺乏特效治疗手段，被称为“绿色癌症”。炎症性肠病的病理机制不是很清楚，可能与肠道微生物[1]、环境[2]、遗传和免疫等多因素相关[3-4]，治疗时以恢复肠道功能为主。研究表明，心理状态、肠道炎症和动力障碍之间密切相关[5]。SUMAN[6]阐明了肠神经系统改变在炎症性肠病病因学及治疗中具有潜在作用。肠神经胶质细胞在炎症性肠病中发挥重要作用[7]。肠道运动功能受到神经-Cajal间质细胞-平滑肌细胞网络控制，其中神经网络结构分布最广泛、数目最大，占主导地位，且“第二大脑”或“肠脑”即为肠神经系统是中枢神经系统外最大的神经元和胶质细胞的集合体，其主要由肌间神经丛和黏膜下神经丛两大神经丛组成神经网络结构，具有独特性、组织连接的复杂性和神经细胞类型的多样性，属于自主神经系统的一个组成部分。THOMASI等[8]揭露肠神经胶质细胞与肠神经元细胞通过不同信号传导通路相互作用并影响肠道功能，SHARKEY等[9]表明肠神经元和肠神经胶质细胞对肠屏障具有调节功能，通过一系列信号启动输出，精准控制消化和肠内稳态，SCHNEIDER
等[10]证实了肠神经系统是一个综合性的感觉系统，在稳态和病理生理条件下具有多种免疫调节功能，调节胃肠道运动、营养物质吸收、免疫反应及血液供应等。肠神经系统含有远多于肠神经元数量的胶质细胞，是肠神经系统中最活跃的信号传导组分之一[11]，对肠道病理生理损伤极其敏感[8]，在炎症性肠病发病过程中发挥保护性作用[12]。RAO等[13]报道了肠神经胶质细胞的发展及其多样性，证明了肠神经胶质细胞的重要性。肠神经胶质细胞作用于肠上皮细胞，抑制肠上皮细胞凋亡，保护肠黏膜屏障，可经迷走神经激活影响肠上皮屏障；作用于肠神经元，抑制凋亡；作用于免疫细胞，抑制其释放相关炎症因子，减轻肠道炎症反应。肠神经胶质细胞涉及几乎所有现有研究发现的炎症性肠病可能发病机制过程。胶质细胞形态改变、数量缺失、胶质网络结构损伤、功能障碍是导致肠道运动异常的重要发病机制，因此迫切寻找一种效果更好的新型治疗方法。肠神经胶质细胞及肠道免疫亦可通过脑-肠轴调控脑部疾病[14-15]。目前成熟的细胞系只有大鼠小肠来源的肠神经胶质细胞，然而很多分选、类器官成熟产品只有小鼠来源，市场上尚无成熟的小鼠小肠来源细胞系，故需获得小鼠小肠来源的肠神经胶质细胞。SUNARDI等[16]报道肠神经胶质细胞的基因编辑将代表肠神经病的有价值的治疗方法，基于肠神经胶质细胞的治疗可能被视为肠神经病及其他疾病的未来策略。ZIEGLER等[17]研究证实了肠胶质细胞活性在驱动黏膜屏障恢复中的重要作用；WALLRAPP等[18]表明肠神经胶质细胞介导肠道免疫和修复；ZHANG等[19]研究证实肠神经胶质细胞通过机械收缩和化学刺激影响肠道运动和免疫功能；SCHONKEREN等[20]总结发现目前提取肠神经胶质细胞均过于繁琐，为更好地研究肠神经胶质细胞的生理功能及其与疾病的关系，有必要创建一种操作简单、取材容易的原代肠神经胶质细胞培养方法。
按照TERAMOTO等[21]报道的方法先用移液器尖端刮去成纤维细胞费时费力而且提取出来细胞纯度不高。按照ZANOLETTI等[22]、SMITH等[23]及WANG等[24]报道的方法进行研磨肠组织：取C57成年鼠( > 8周龄，体质量18-22 g，雌雄不拘)，无菌操作取下十二指肠(幽门下1 cm至屈氏韧带上1 cm)，去除肠内容物后进行环纵肌的剥离(将十二指肠套于棉棒上，沿着肠系膜方向切开几个小口便于剥离)，后续进行消化，结果发现离心后几乎看不到细胞沉淀，猜测可能剥离不充分及消化时间没有把握好，全程下来4 h左右，有些技术难度，对操作人员要求高。后续尝试解剖显微镜镜下剥离，速度很慢，取一部分剥离完的环纵肌层进行免疫荧光观察网络结构可以，不过速度很慢，猜测细胞活性不好可能与速度有关，可通过提前30 min将DPBS置于冰上，通过通气装置产生含体积分数95%O2和体积分数5%CO2的气泡，稳定pH值，维持细胞培养条件，保存细胞活性，需要额外设备维持，对实验室设备要求高。参考WINDSTER等[25]报道的方法提取肠神经胶质细胞：消化后反复吹打肠组织，细胞贴壁量少。参照李娜等[26]报道的方法进行胎鼠胶质细胞提取：无菌操作取出孕14 d左右孕鼠子宫，分离出胎鼠，然后取出全部肠组织，剪碎后进行胰酶消化10 min，离心接种，成功提取出胶质细胞，可以稳定传3代，经免疫荧光鉴定为胶质细胞，但与传统伦理道德有悖，故后续尝试不同周龄的乳鼠，其中> 7 d的乳鼠肠内容物清理不干净，离心后较浑浊，细胞不能很好地分离出来，接种后易污染。经过反复实验发现0-7 d乳鼠提取出的细胞密度及活性好，可以稳定传代3次，经免疫荧光鉴定为肠神经胶质细胞。因肠神经元细胞的完全培养基需要无血清配置加上B27等各种生长因子，而肠神经胶质细胞完全培养基不符合肠神经元细胞生长环境，故3 d后肠神经元细胞逐渐死亡。原代和第1代细胞在细胞融合度80%时加入Ⅱ型胶原酶，通过成纤维细胞与胶质细胞贴壁性不同，可将成纤维细胞去掉，第3代之后细胞基本纯化完成，可进行后续实验。SCAVUZZO等[27]表明靶向肠神经胶质细胞治疗可促进胃肠道疾病的治疗；SANTHOSH等[28]强调肠神经胶质细胞在胃肠道生理学和病理学中的复杂作用对于开发胃肠道疾病的新治疗策略尤为重要。此实验在前期研究的基础上进行优化，旨在创建高纯度的肠神经胶质细胞培养方法，为肠神经系统的病理生理学研究提供稳定的模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 提取并培养原代肠神经胶质细胞。
1.2 时间及地点 实验于2023年7-12月在大连医科大学附属第一医院中西医结合实验室和大连医科大学实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级C57BL/6小鼠10只，雌雄不拘，体质量1.0-2.0 g，0-7 d龄，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK(辽)2020-0001。实验方案经大连医科大学动物伦理委员会批准(批号：AEE23122)，实验过程遵循“3R”原则给予动物福利保护。
1.3.2 主要仪器 超净工作台(Thermo，美国)，二氧化碳培养箱(Thermo，美国)，低速常温离心机(Thermo，美国)，光学显微镜(OLYMPUS，日本)，2-8 ℃医用冷藏冰箱(中科美菱，中国)，荧光倒置相差显微镜(OLYMPUS，日本)。
1.3.3 主要试剂 DMEM/F12(Gibco，美国)，谷氨酰胺(普诺赛，中国)，胎牛血清(Gibco，美国)，青霉素、链霉素和庆大霉素(碧云天，中国)，细胞培养皿、培养板、离心管(NEST，中国)，枪头(赛维尔，中国)，胰蛋白酶(Gibco，美国)，DPBS、PBS、40 g/L多聚甲醛(赛维尔，中国)，免疫荧光封闭液(碧云天，中国)，抗荧光淬灭剂(碧云天，中国)，载玻片(赛维尔，中国)，爬片(索莱宝，中国)，兔抗胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体(武汉三鹰，中国)，DAPI(碧云天，中国)，HRP标记的山羊抗兔IgG(武汉三鹰，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 十二指肠组织获取 异氟烷吸入麻醉0-7 d乳鼠，处死后取十二指肠(幽门至屈氏韧带上)，用吸满DPBS的1 mL注射器针头插入肠管冲洗肠内容物3次，将小肠剪碎至1 mm大小片段，放入DPBS中。
1.4.2 完全培养基配置 DMEM/F12完全培养基组成：88% DMEM/F12+1%谷氨酰胺+1%青霉素、链霉素和庆大霉素+体积分数10%胎牛血清；DMEM/F12终止完全培养基：89% DMEM/F12+1%青霉素、链霉素和庆大霉素+体积分数10%胎牛血清。
1.4.3 消化 将3只乳鼠的全部十二指肠清洗后放入60 mm细胞培养皿，用3 mL含0.25% EDTA的胰蛋白酶于体积分数5%CO2、37 ℃孵箱中消化20 min，用3 mL DMEM/F12终止完全培养基终止消化，机械反复吹打后用注射器尾部研磨，用100 μm细胞筛网过滤杂质，1 000 r/min离心5 min，用DMEM/F12完全培养基重悬细胞沉淀，3只乳鼠细胞沉淀重悬接种于1个60 mm细胞培养皿中开始原代培养。
1.4.4 肠神经胶质细胞的培养与观察 原代孵育24 h后弃去漂浮的死细胞，进行换液，再孵育3 d后细胞融合度达到80%左右进行传代，1个60 mm细胞培养皿传至2个T25培养瓶中，继续孵育2 d后再次传代。倒置显微镜下观察不同阶段的肠神经胶质细胞形态。
1.4.5 肠神经胶质细胞的鉴定 取培养至第3代肠神经胶质细胞接种于提前放入专用圆形细胞爬片的24孔板中，待细胞融合度达到60%-80%时，取出孔板进行后续鉴定操作。免疫荧光染色：PBS洗3次，加入40 g/L多聚甲醛室温下固定30 min，PBS洗3次，每次5 min，加入封闭液室温封闭1 h，吸弃封闭液，PBS洗3次，每次5 min，加入肠神经胶质细胞特异性抗体胶质纤维酸性蛋白(1∶200稀释)于4 ℃孵育过夜，弃去一抗，PBS洗3次，加入荧光二抗羊抗兔(1∶1 000)，室温孵育1 h，弃去二抗，PBS洗3次，每次5 min，加入DAPI，室温避光孵育7 min，PBS洗3次，每次5 min，载玻片上滴加抗荧光淬灭剂，用弯的1 mL注射器针头将爬片取出，将有细胞面放置于载玻片上，荧光显微镜观察拍照。
1.5 主要观察指标 肠神经胶质细胞形态、密度、存活状态及免疫荧光鉴定。

讨论

近年来大量研究表明胶质细胞的缺乏会导致肠神经系统发育缺陷，说明了胶质细胞在肠神经系统发生过程中起关键作用。胶质细胞营养并支持胃肠神经元，发挥神经保护作用及肠道防御功能[29]，亦参与整合及调节胃肠道内神经活动，调控肠道炎症反应，促进胃肠道运动功能恢复[30]。胶质细胞作为肠神经系统的主导细胞之一，和肠神经元、Cajal间质细胞一起构成肠神经系统，发挥协同作用并利用复杂的钙离子信号在肠神经系统进行信号传递，微环境中神经元细胞、胶质细胞、免疫细胞等传递的信息起到整合作用。很多研究试图明确胶质细胞发挥的多效性作用可能会揭示更多更深层的知识[31]，有助于开发针对各种胃肠道疾病的新的靶向治疗方案[32]。
肠神经胶质细胞被认为是细胞整合者，其积极参与运动和上皮屏障功能的调节[33]，在神经元的网络成熟中发挥关键细胞因子的作用。胶质纤维酸性蛋白以单体形式存在，属于酸性细胞骨架蛋白，一般作为肠神经胶质细胞的重要生物标志物参与实验研究。
该实验方法能有效分离和传代胶质细胞，为进一步的研究奠定了基础。实验结果表明分离培养的乳鼠肠神经胶质细胞具有较强的自我更新能力，在原代和传代培养过程中发现部分细胞能连续传3代左右(15 d左右)，操作简便，对操作者及实验室设备要求低。虽然肠神经胶质细胞的研究目前还处于初级阶段，但肠神经胶质细胞的分离培养成功为其深入开发和应用奠定基础。在胶质细胞基础研究方面，它会成为研究肠神经系统疾病病因学的重要对象，为解决胃肠动力障碍开辟新思路。
REALE等[34]研究表明可通过多种细胞共培养三维模型模拟肠道；WANG等[35]应用工程脂质体构建了口服给药靶向调节系统，通过口腔吸收屏障靶向局部肠神经胶质细胞和星形胶质细胞经过体循环治疗相关疾病；通过倒置培养神经网络显示出更高的相似性[36]；LEFÈVRE等[37]研究表明肠神经胶质细胞的可塑性和多能性可推动再生医学的发展，在肠道稳态及再生中具有重要作用[38]；还有研究表明光遗传学传感器和致动器可评估胃肠动力障碍[39]。未来可通过医工交叉，结合类器官、微流控技术、材料等，模拟更适合体内环境培养新模型并通过无染料全视野光学相干断层扫描技术进行可视化和分析[40]。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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C57BL/6新生乳鼠肠神经胶质细胞的提取与培养

Extraction and culture of enteric glial cells from C57BL/6 newborn neonatal mice

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[1]	何龙才, 宋文学, 明江, 陈光唐, 王军浩, 廖益东, 崔君拴, 徐卡娅. SD大鼠乳鼠原代皮质神经元和小胶质细胞同时提取并培养的实验方法[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1395-1400.
[2]	卓秋燕, 蒋群, 夏思, 卢诗颖, 刘燕娣, 戴媺. 骨髓增生异常综合征模型大鼠骨髓造血：活髓方干预免疫检查点的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(36): 7735-7742.
[3]	张熊劲夫, 陈奕达, 程歆怡, 刘岱珲, 施勤. 年轻大鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体逆转老龄大鼠骨髓间充质干细胞衰老[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(36): 7709-7718.
[4]	于辉, 杨阳, 韦婷, 李文丽, 罗文倩, 刘彬. Gadd45b调控星形胶质细胞表型减轻慢性缺血性大鼠脑白质损伤[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(36): 7797-7803.
[5]	姚兰宣, 王雪菲, 刘洋, 杨雨佳, 赵怡, 齐芳芳, 李颖辉. 间充质干细胞及其衍生细胞外囊泡靶向巨噬细胞干预自身免疫性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6772-6781.
[6]	熊正花, 周江洪, 沈怡, 韩雪松. 间充质干细胞及细胞外囊泡修复子宫内膜损伤[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6782-6791.
[7]	袁潇, 梁松林, 谢亚楠, 管冬梅, 樊龙雨, 殷晓轩. 不同来源间充质干细胞治疗炎症性肠病[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6811-6820.
[8]	汪兆艳, 王倩, 刘卫鹏, 杨辉, 栾佐, 屈素清. 纤维连接蛋白对人神经干细胞诱导分化为少突胶质前体细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6661-6666.
[9]	康林之, 刘振帅, 魏佳旭, 常娜, 朱大诚. 盐酸青藤碱抑制急性T淋巴细胞白血病CEM细胞株的作用及转录组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6674-6680.
[10]	李金杰, 肖经雪, 李楠, 宋珍, 周彦云, 马婕. 白细胞介素18在低氧暴露大鼠骨髓及外周血中表达的意义[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6681-6687.
[11]	苏琴, 贾思玮, 郭敏芳, 孟涛, 李雁冰, 穆秉桃, 宋丽娟, 马存根, 尉杰忠. 枸杞多糖干预β-淀粉样蛋白1-42诱导SH-SY5Y细胞损伤：线粒体自噬的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6688-6696.
[12]	林蓉沁, 潘秀颉, 卞丽红. Foxp3在卵巢癌肿瘤微环境中表达与生存预后关系的生物信息分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(29): 6343-6350.
[13]	刘阳, 杨吉垒, 王文丽, 崔颖颖, 孙琦昊, 李友瑞. 温度响应性水凝胶在骨组织工程中的应用特征[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(28): 6094-6100.
[14]	林培琦, 骆勤亮, 张立刚, 黄桂林, 唐建宏, 张霓霓. 硝基油酸对大鼠下颌下腺上皮细胞放射损伤的保护机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(26): 5520-5527.
[15]	冯乙芮, 高天芸, 王亚萍, 黄亚红, 王斌. 白细胞介素10工程化修饰人脐带间充质干细胞优效治疗炎症性肠病[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(23): 4878-4887.