血管生成素样蛋白4通过调节成纤维细胞和内皮细胞功能影响糖尿病足进程

doi:10.12307/2025.516

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (25): 5396-5402.doi: 10.12307/2025.516

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

血管生成素样蛋白4通过调节成纤维细胞和内皮细胞功能影响糖尿病足进程

宋庆宏1，吴楠1，史燕1，崔洪雨1，刘飞1，刘汉冲1，周宁1，姚斌2

1天津市人民医院血管疾病诊疗中心，天津市 300121；2天津大学，天津市 300072

收稿日期:2024-04-02 接受日期:2024-06-03 出版日期:2025-09-08 发布日期:2024-12-26
通讯作者: 姚斌，博士，副教授，天津大学，天津市 300072
作者简介:宋庆宏，男，1979年生，天津市人，博士，副主任医师，主要从事血管外科相关性疾病的诊治工作。
基金资助:
国家重点研发计划项目(2022YFC2403100)，项目负责人：姚斌；天津市卫生健康委员会科技项目(ZC20112)，项目负责人：宋庆宏

Angiopoietin-like protein 4 affects progression of diabetic foot by regulating fibroblast and endothelial cell functions

Song Qinghong1, Wu Nan1, Shi Yan1, Cui Hongyu1, Liu Fei1, Liu Hanchong1, Zhou Ning1, Yao Bin2

1Vascular Disease Diagnosis and Treatment Center, Tianjin Union Medical Center, Tianjin 300121, China; 2Tianjin University, Tianjin 300072, China

Received:2024-04-02 Accepted:2024-06-03 Online:2025-09-08 Published:2024-12-26
Contact: Yao Bin, MD, Associate professor, Tianjin University, Tianjin 300072, China
About author:Song Qinghong, MD, Associate chief physician, Vascular Disease Diagnosis and Treatment Center, Tianjin Union Medical Center, Tianjin 300121, China
Supported by:
National Key Research & Development Project, No. 2022YFC2403100 (to YB); Science and Technology Project of Tianjin Health Commission, No. ZC20112 (to SQH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like protein4，ANGPTL4)：是血管生成素样蛋白家族成员之一，由406个氨基酸组成，它包含一个N末端螺旋域、联结子和C末端纤维蛋白原样域，是一种分泌信号多肽，蛋白组构与血管生成素相似。血管生成素样蛋白4在脂质和葡萄糖代谢过程中发挥至关重要的作用，并且它可通过损坏调节器分子来抑制脂蛋白脂酶活性，进而提高血浆中三酰甘油的浓度。
糖尿病足：糖尿病患者因下肢远端神经异常和不同程度的血管病变导致的足部感染、溃疡和(或)深层组织破坏。一般分为3种类型，神经型、缺血型和神经缺血型(也称混合型)，轻者可仅表现为皮肤瘙痒、干燥、无汗、色素沉着，脚部微痛、感觉迟钝、间歇性跛行、关节变形、皮肤表面溃疡；中度者可以出现较深的溃疡合并感染；严重者可累及骨，造成骨折和骨坏死。

摘要
背景：研究表明，血管因素对糖尿病足的发生具有重要影响。
目的：探讨血管生成素样蛋白4在糖尿病足形成中的重要作用。
方法：①对糖尿病足患者的基因表达谱数据进行生物信息学分析，找到关键基因。收集糖尿病足患者以及无糖尿病健康人的皮肤标本进行苏木精-伊红染色、免疫组化染色以及qRT-PCR实验，检测血管生成素样蛋白4表达情况。②培养人永生化皮肤成纤维细胞系和原代人脐静脉内皮细胞，将2种细胞分别分为对照组和外源性补充血管生成素样蛋白4组，通过划痕实验以及CCK-8实验分别检测成纤维细胞的迁移能力和增殖能力，通过Ki67实验检测内皮细胞的增殖能力。
结果与结论：①生信分析发现，血管生成素样蛋白4基因的下调可能是导致糖尿病足形成的关键基因。②苏木精-伊红染色结果显示，与正常皮肤相比，血管生成素样蛋白在糖尿病足皮肤内弱表达，且其mRNA水平相对表达量降低(P < 0.01)。③划痕实验结果显示，与对照组相比，血管生成素样蛋白4组成纤维细胞迁移能力明显增强；CCK-8细胞增殖实验显示，血管生成素样蛋白4组成纤维细胞的吸光度值在24，48 h均高于对照组(P < 0.01，P < 0.001)；提示血管生成素样蛋白4可增强高糖处理的成纤维细胞迁移及增殖能力。④Ki67实验结果显示，与对照组相比，血管生成素样蛋白4组内皮细胞Ki67阳性细胞数目明显多于对照组；CCK-8细胞增殖实验显示，血管生成素样蛋白4组内皮细胞的吸光度值在24，48 h均高于对照组(P < 0.05，P < 0.001)。⑤以上结果均提示血管生成素样蛋白4可增强高糖处理内皮细胞的增殖能力。

https://orcid.org/0000-0002-1122-2763 (宋庆宏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 血管生成素样蛋白4, 成纤维细胞, 血管内皮细胞, 糖尿病足, 生物信息学分析

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that vascular factors have an important impact on the occurrence of diabetic foot.
OBJECTIVE: To investigate the important role of angiopoietin-like protein 4 in the formation of diabetic foot.
METHODS: (1) Bioinformatics analysis was performed on the gene expression profile data of diabetic foot patients to find the key genes. The skin samples of diabetic foot patients and healthy people were collected for hematoxylin-eosin staining, immunohistochemical staining, and qRT-PCR experiments to detect the expression of angiopoietin-like protein 4. (2) The immortalized human skin fibroblast cell line and primary human umbilical vein endothelial cells were cultured. The two kinds of cells were divided into control group and exogenous angiopoietin-like protein 4 supplemented group. The migration ability and proliferation ability of fibroblasts were detected by scratch assay and CCK-8 assay. The proliferation ability of endothelial cells was detected by Ki67 assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Bioinformatics analysis results showed that the down-regulation of angiopoietin-like protein 4 gene might be the key gene leading to the formation of diabetic foot. (2) Hematoxylin-eosin staining exhibited that compared with normal skin, angiopoietin-like protein 4 was weakly expressed in diabetic foot skin, and the mRNA level was decreased (P < 0.01). (3) Scratch assay results demonstrated that compared with the control group, fibroblast migration ability was significantly enhanced in the angiopoietin-like protein 4 group. CCK-8 assay showed that the absorbance value of fibroblasts in the angiopoietin-like protein 4 group was higher than that of the control group at 24 and 48 hours (P < 0.01, P < 0.001). It is suggested that angiopoietin-like protein 4 can enhance the migration and proliferation of fibroblasts. (4) Ki67 assay results demonstrated that the number of Ki67 positive cells in the angiopoietin-like protein 4 group was significantly more than that in the control group. CCK-8 assay results showed that the absorbance value of endothelial cells in the angiopoietin-like protein 4 group was higher than that of the control group at 24 and 48 hours (P < 0.05, P < 0.001). (5) All findings suggest that angiopoietin-like protein 4 can enhance the proliferation of endothelial cells treated with high glucose.

Key words: angiopoietin-like protein 4, fibroblast, vascular endothelial cell, diabetic foot, bioinformatics analysis

中图分类号:

宋庆宏, 吴楠, 史燕, 崔洪雨, 刘飞, 刘汉冲, 周宁, 姚斌. 血管生成素样蛋白4通过调节成纤维细胞和内皮细胞功能影响糖尿病足进程[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(25): 5396-5402.

Song Qinghong, Wu Nan, Shi Yan, Cui Hongyu, Liu Fei, Liu Hanchong, Zhou Ning, Yao Bin. Angiopoietin-like protein 4 affects progression of diabetic foot by regulating fibroblast and endothelial cell functions[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(25): 5396-5402.

图/表（结果） 2

2.1 生信分析筛选糖尿病足形成中与血管相关的关键基因 根据预先设定的筛选标准共筛选出351个差异基因，包含216个上调的基因和135个下调的基因(图1A)。对下调的基因进行GO注释，结果表明排名前5的生物功能条目为上皮化、角质细胞分化、类固醇生物合成、脂质代谢和血管形成(图1B)。KEGG通路主要与代谢通路、脂质和动脉粥样硬化、雌激素通路和类固醇合成等有关(图1C)。从生物功能中进一步查找与血管明确相关的条目，发现除血管形成外，还有阳性调节NF-kappaB转录因子活性，阳性调节血管形成、响应缺氧、阳性调节血管内皮生长因子的产生及阳性调节平滑肌细胞增殖等生物过程下调(图1D)。因此，血管生成功能障碍可能是导致糖尿病足形成的关键因素。为进一步筛选关键基因，对血管生成和下调基因取交集，发现血管生成素样蛋白4基因的下调可能是导致糖尿病足形成的关键基因(图1E)。

2.2 血管生成素样蛋白4在糖尿病足中低表达 见图2。足部皮肤苏木精-伊红染色结果显示，糖尿病足皮肤角质层明显增厚，但角质形成细胞明显减少，真皮层内汗腺及血管形态正常，但周围伴有较多的炎性细胞浸润。免疫组化染色结果显示，正常皮肤内ANGPLT4主要在汗腺、血管内皮及成纤维细胞内中等强度表达，而在糖尿病足皮肤内弱表达。qRT-PCR结果显示，与正常皮肤相比糖尿病足皮肤血管生成素样蛋白4 mRNA相对表达量降低(P < 0.01)，为对照组的(72.54±8.27)%。
2.3 血管生成素样蛋白4对高糖处理的成纤维细胞迁移和增殖的影响 见图3。划痕实验结果显示，外源性补充血管生成素样蛋白4可明显增强高糖处理的成纤维细胞增殖能力，血管生成素样蛋白4组48 h已基本闭合。CCK-8细胞增殖实验显示，血管生成素样蛋白4组的吸光度值在24，48 h均高于对照组(P < 0.01，P < 0.001)。因此，外源性补充血管生成素样蛋白4可增强高糖处理的成纤维细胞迁移及增殖能力。
2.4 血管生成素样蛋白4对高糖处理的内皮细胞增殖的影响 见图4。Ki67细胞免疫荧光染色结果显示，Ki67主要在细胞核内表达，血管生成素样蛋白4组Ki67阳性细胞数目明显多于对照组(随机选取3个视野，统计Ki67阳性细胞数量占该视野细胞数量百分比，对照组Ki67阳性细胞占比均值为55%，血管生成素样蛋白4组占比均值为78%，P < 0.01)。CCK-8细胞增殖实验显示，血管生成素样蛋白4组的吸光度值在24，48 h均高于对照组(P < 0.05，P < 0.001)。因此，外源性补充血管生成素样蛋白4可增强高糖处理的内皮细胞增殖能力。

参考文献

[1] 中华医学会糖尿病分会. 中国2型糖尿病防治指南(2020年版)[J]. 中华内分泌代谢杂志,2021,37(4):311-398.
[2] 中国老年2型糖尿病防治临床指南编写组, 中国老年医学学会老年内分泌代谢分会, 中国老年保健医学研究会老年内分泌与代谢分会, 等. 中国老年2型糖尿病防治临床指南(2022年版)[J] .中华内科杂志,2022,61(1):12-50.
[3] ARMSTRONG DG, TAN TW, BOULTON AJM, et al.Diabetic Foot Ulcers: A Review. JAMA. 2023;330(1):62-75.
[4] REARDON R, SIMRING D, KIM B, et al.The diabetic foot ulcer.Aust J Gen Pract. 2020;49(5):250-255.
[5] MI F, LIU Z, WANG X, et al.Deep Red Light Driven Hydrogen Evolution by Heterojunction Polymer Dots for Diabetic Wound Healing.Angewandte Chemie.Angew Chem Int Ed Engl. 2024;6: e202402133.
[6] ALKHAMI F, RUBIN S, BORDERIE G, et al.Increased risk of renal events in people with diabetic foot disease: A longitudinal observational study.Diabetes Metab. 2024;50(4):101536.
[7] VAN NETTEN JJ, AAN DE STEGGE WB, DIJKGRAAF MGW, et al.Cost-effectiveness of temperature monitoring to help prevent foot ulcer recurrence in people with diabetes: A multicenter randomized controlled trial. Diabetes Metab Res Rev. 2024;40(4):e3805.
[8] BAKADIA BM, ZHENG R, QAED AHMED AA, et al.Teicoplanin-Decorated Reduced Graphene Oxide Incorporated Silk Protein Hybrid Hydrogel for Accelerating Infectious Diabetic Wound Healing and Preventing Diabetic Foot Osteomyelitis. Adv Healthc Mater. 2024;24:e2304572.
[9] VAN NETTEN JJ, APELQVIST J, BUS SA, et al.The unique multidisciplinarity of diabetes-related foot disease. Diabetes Metab Res Rev. 2024;40(4):e3804.
[10] OROPALLO AR, SERENA TE, ARMSTRONG DG, et al. Molecular Biomarkers of Oxygen Therapy in Patients with Diabetic Foot Ulcers. Biomolecules. 2021;11(7):925.
[11] MACDONALD KE, STACEY HJ, HARKIN G, et al.Patient perceptions of phage therapy for diabetic foot infection. PLoS One. 2020;15(12): e0243947.
[12] FRYKBERG RG.Topical Wound Oxygen Therapy in the Treatment of Chronic Diabetic Foot Ulcers. Medicina (Kaunas). 2021;57(9):917.
[13] SHARMA R, SHARMA SK, MUDGAL SK, et al.Efficacy of hyperbaric oxygen therapy for diabetic foot ulcer, a systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials. Sci Rep. 2021;11(1):2189.
[14] NALISA DL, MONERUZZAMAN M, CHANGWE GJ, et al.Stem Cell Therapy for Diabetic Foot Ulcers: Theory and Practice. J Diabetes Res. 2022;2022:6028743.
[15] YANG J, CHEN Z, PAN D, et al. Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Combined Pluronic F127 Hydrogel Promote Chronic Diabetic Wound Healing and Complete Skin Regeneration. Int J Nanomedicine. 2020;15:5911-5926.
[16] YU Q, QIAO GH, WANG M, et al. Stem Cell-Based Therapy for Diabetic Foot Ulcers.Front Cell Dev Biol. 2022;10:812262.
[17] YU X, LIU P, LI Z, et al. Function and mechanism of mesenchymal stem cells in the healing of diabetic foot wounds. Front Endocrinol (Lausanne). 2023;14:1099310.
[18] ZHANG J, LIU H, YU Q, et al.Hair Derived Microneedle Patches for Both Diabetic Foot Ulcer Prevention and Healing. ACS Biomater Sci Eng. 2023;9(1):363-374.
[19] SUH HP, KEDAR DJ, LEE YH, et al.Use of Recanalized Vessels for Diabetic Foot Reconstruction: Pushing the Boundaries of Reconstruction in a Vasculopathic Lower Extremity. Plast Reconstr Surg. 2023;151(3):485e-494e.
[20] RAI V, MOELLMER R, AGRAWAL DK.Stem Cells and Angiogenesis: Implications and Limitations in Enhancing Chronic Diabetic Foot Ulcer Healing. Cells. 2022;11(15):2287.
[21] MASTROGIACOMO M, NARDINI M, COLLINA MC, et al. Odorisio, Innovative Cell and Platelet Rich Plasma Therapies for Diabetic Foot Ulcer Treatment:The Allogeneic Approach.Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:869408.
[22] WANG X, DAI S, ZHENG W, et al.Identification and verification of ferroptosis-related genes in diabetic foot using bioinformatics analysis.Int Wound J. 2023;20(8):3191-3203.
[23] ARYAL B, PRICE NL, SUAREZ Y, et al.ANGPTL4 in Metabolic and Cardiovascular Disease. Trends Mol Med. 2019;25(8):723-734.
[24] PLOUG M.ANGPTL4: a new mode in the regulation of intravascular lipolysis. Curr Opin Lipidol. 2022;33(2):112-119.
[25] ZUO Y, DAI L, LI L, et al. ANGPTL4 Regulates Psoriasis via Modulating Hyperproliferation and Inflammation of Keratinocytes. Front Pharmacol. 2022;13:850967.
[26] QIN Y, DINABANDHU A, CAO X, et al.ANGPTL4 influences the therapeutic response of patients with neovascular age-related macular degeneration by promoting choroidal neovascularization. JCI Insight. 2022;7(13):e157896.
[27] CHO DI, AHN MJ, CHO HH, et al.ANGPTL4 stabilizes atherosclerotic plaques and modulates the phenotypic transition of vascular smooth muscle cells through KLF4 downregulation. Exp Mol Med. 2023; 55(2):426-442.
[28] FERNÁNDEZ-HERNANDO C, SUÁREZ Y. ANGPTL4: a multifunctional protein involved in metabolism and vascular homeostasis. Curr Opin Hematol. 2020;27(3):206-213.
[29] ZUO Y, HE Z, CHEN Y, et al.Dual role of ANGPTL4 in inflammation. Inflamm Res. 2023;72(6):1303-1313.
[30] SINGH AK, CHAUBE B, ZHANG X, et al. Fernandez-Hernando, Hepatocyte-specific suppression of ANGPTL4 improves obesity-associated diabetes and mitigates atherosclerosis in mice. J Clin Invest. 2021;131(17):e140989.
[31] HE J, ZHOU S, WANG J, et al.Anti-inflammatory and anti-oxidative electrospun nanofiber membrane promotes diabetic wound healing via macrophage modulation. J Nanobiotechnology. 2024;22(1):116.
[32] LIN Y, ZHANG Y, CAI X, et al.Design and Self-Assembly of Peptide-Copolymer Conjugates into Nanoparticle Hydrogel for Wound Healing in Diabetes.Int J Nanomedicine. 2024;19:2487-2506.
[33] PRASATHKUMAR M, GEORGE A, SADHASIVAM S.Influence of chitosan and hydroxyethyl cellulose modifications towards the design of cross-linked double networks hydrogel for diabetic wound healing. Int J Biol Macromol. 2024;265(Pt 1):130851.

引言

随着糖尿病患者数量的日益增加，糖尿病足作为其常见并发症之一，已经成为全球公共卫生领域面临的一大挑战[1-2]。糖尿病足的形成机制复杂，涉及微血管病变、神经病变、免疫系统异常及炎症反应等多种因素的交互作用[3]，其中血管病变是糖尿病足尤为关键的致病因素[4]。
微血管病变是糖尿病足发病的核心环节，其特点是静息时血管流量增加，静脉和小动脉功能反应减弱，毛细血管通透性升高，这些复杂的血管变化共同导致水肿的发生，经皮氧压下降，经皮二氧化碳压升高[5-6]，直接影响到组织的氧合和营养供应。糖尿病微血管病变导致组织灌注受损，使足部容易出现局部免疫力低下、感染和愈合延迟进而加剧组织损伤和延缓伤口愈合[7-10](糖尿病足是一个连续的伤口，从非常浅表的溃疡开始，发展到深层组织感染，然后是骨髓炎[11])。已报道有多种方法可以通过改善微血管病变对糖尿病足溃疡起到治疗作用[12-13]。除了传统治疗方法外，一些新技术的应用也为治疗糖尿病足提供了新思路，比如干细胞的应用，可以通过促进血管形成来达到治疗目的[14-15]。血管成形术也可以作为干细胞治疗的补充治疗[16]。尽管经过科学研究证明了多种结构和功能微血管异常[17-20]，但微血管病变对糖尿病足溃疡及其愈合的相对重要性尚未得到充分了解，因此深入探索糖尿病足中血管因素的变化及其对疾病进展的影响，对于研究糖尿病足的发病机制和寻找有效的预防治疗方法具有重要意义[20-21]。
在分子生物学和基因组学快速发展的推动下，生物信息学成为了揭示疾病分子机制的强大工具。利用生物信息学手段，可以在分子水平上深入分析疾病的发生发展过程，尤其是对于糖尿病足这类与血管功能障碍密切相关的复杂性疾病，生物信息学分析方法能够帮助识别出与血管功能变化相关的关键基因和信号通路，揭示基因之间的相互作用，为疾病的治疗提供新的思路和目标[22]。
血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like protein4，ANGPTL4)作为一种已知参与调节脂质代谢、炎症反应、血管生成及细胞增殖等多种生理和病理过程的重要分子[23]，在糖尿病足的发病机制中的具体作用和机制尚未被明确。此项研究通过生物信息学分析方法，针对糖尿病足患者的基因表达谱数据进行深入分析，成功筛选出血管生成素样蛋白4作为糖尿病足形成过程中与血管功能障碍密切相关的关键基因。旨在通过实验验证的方式，深入探讨血管生成素样蛋白4在糖尿病足发病中的作用及其对成纤维细胞和内皮细胞功能的影响，从而揭示其在糖尿病足发病过程中的潜在治疗价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞学实验，组间比较采用两样本均数t检验。
1.2 时间及地点 实验于2023年 6-12月在天津大学先进医用材料与医疗器械全国重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 皮肤标本 该研究根据《赫尔辛基宣言》的原则制定临床实验规则，获得天津市人民医院伦理委员会审查，伦理审查编号：(2020)年快审第(C05)号。在取得患者知情同意情况下，取3例年龄为(56±6)岁的男性糖尿病足患者创面周围正常皮肤标本，该糖尿病足患者符合国际糖尿病诊断标准，足部溃疡创面持续2个月未愈合；并以3例年龄为(62±9)岁无糖尿病的健康男性皮肤标本为对照组，其标本取自血糖水平正常的骨折患者术后剩余足部皮肤。每例样本中一半行石蜡包埋后用于苏木精-伊红染色及免疫组化染色，另一半用于qRT-PCR检测。
1.3.2 主要试剂 免疫组化检测试剂盒(中杉金桥)；胎牛血清、DMEM培养基、40 g/L多聚甲醛、苏木精-伊红染色试剂盒、山羊血清(索莱宝Solarbio)；TRIzol试剂(美国Ambion公司)；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(宝日医生物TakaraBio技术有限公司)；CCK-8试剂(日本同仁公司)；兔抗血管生成素样蛋白4抗体(ab206420，Abcam)；兔抗Ki67抗体(ab15580，Abcam)；重组人血管生成素样蛋白4(Recombinant Human Angiopoietin-like 4 protein，ab191677，Abcam公司)；葡萄糖粉末(D-Glucose，货号：HY-B0389，MedChemExpress公司)。
1.3.3 细胞和培养基 课题所需人永生化皮肤成纤维细胞系(human skin fibroblast，HSF)和原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)均购于上海赛百慷生物技术股份有限公司。人皮肤成纤维细胞培养基成分：完全Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，含体积分数10% FBS、1%青霉素/链霉素；人脐静脉内皮细胞培养基成分：内皮细胞培养基，含体积分数5% FBS、内皮细胞生长添加剂、1% P/S。
1.4 实验方法
1.4.1 数据获取 从GEO公共数据库下载微阵列转录组测序数据GSE68183。该数据集包含3例糖尿病足(非溃疡及非神经病变糖尿病足)和3例非糖尿病样本的测序数据。由于微血管病变是糖尿病足发病的主要致病机制，因此，此次研究重点关注参与调控血管出芽、沿伸、发育、成熟的基因。血管形成相关基因Anginogenesis从GSEA在线网站Molecular Signatures Database中获取。
1.4.2 差异基因的筛选及富集通路分析 使用R语言(4.3.3版本)中的limma包，对糖尿病足和非糖尿病样本进行差异分析。以|log2 FC| > 0.5，P < 0.05作为筛选差异基因的标准。Pheatmap包用于绘制热图，ggpubr和ggthemes包用于绘制火山图。选取差基因中下调的基因在DAVID基因注释在线网站中进行GO/KEGG 富集通路分析。GO 分类包括生物功能(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)以及分析功能(molecular function，MF)。
1.4.3 关键基因的筛选 将下调的差异基因和血管形成相关基因集Anginogenesis取交集，并绘制venn图。
1.4.4 皮肤组织苏木精-伊红染色 将皮肤组织固定于40 g/L多聚甲醛，常规石蜡包埋切片。烤片，二甲苯脱蜡，不同浓度梯度的乙醇进行复水，每个静置2 min，最后浸泡于蒸馏水中2 min。苏木素溶液中染色20 min，使用自来水流水冲10 min，直至切片颜色变成蓝色。酸性乙醇中分化，切片颜色变成红色。自来水流水冲洗，切片颜色恢复为蓝色。伊红溶液中浸染色10 min，自来水流水冲洗5 min。使用不同浓度梯度的乙醇进行脱水，再将石蜡切片置入二甲苯溶液中透明3 min。最后使用中性树脂滴加封存。倒置显微镜下观察病理变化(n=3)。
1.4.5 血管生成素样蛋白4免疫组化染色 将皮肤组织固定于40 g/L多聚甲醛，常规石蜡包埋切片。将切片置入抗原修复液，微波中火5 min、小火8 min加热。室温冷却后，再取出切片，将石蜡切片置入PBS冲洗浸泡3次。双氧水室温孵育10 min灭活内源酶活性。PBS冲洗3次。0.3% Triton溶液打孔10 min，打孔结束后，使用山羊血清封闭液按照适合的比例稀释血管生成素样蛋白4一抗(浓度为1∶500)，保持切片湿润，放置于4 ℃冰箱孵育过夜。二抗孵育结束后，室温复温30 min，使用DAB溶液滴加在切片上，显微镜下观察染色情况，自来水冲洗终止。将石蜡切片置入苏木素溶液中浸泡复染2 min，直至细胞核变蓝色。使用自来水流水冲洗10 min，直至切片颜色变成蓝色。脱水、透明、封固(n=3)。

1.4.6 qRT-PCR检测血管生成素样蛋白4基因表达 用组织剪取0.1 g新鲜皮肤组织，放入组织研磨器中冰上研磨，分次加入总共1 mL TRIzol，反复旋转研磨器，直至组织呈现白色膜状为止。收集于无酶EP管中，低温离心机中离心，2 000 r/min，5 min，去除组织沉渣，更换EP管。按照TRIzol∶氯仿= 5∶1的比例加入氯仿，离心，4 ℃，12 000×g，15 min。离心后用移液枪吸取RNA水相，置于无酶EP管中。加入等量异丙醇溶液，离心，体积分数75%乙醇洗涤沉淀，空气干燥，加入20 μL DEPC水溶解沉淀。根据TaKaRa反转录试剂盒说明书进行操作设置反转录程序：20 μL体系，37 ℃15 min；85 ℃5 s；4 ℃直至结束。PCR仪反应程序：分为三步预变性(90 ℃，30 s，循环1次)，退火(95 ℃，5 s，循环40次)，延伸(60 ℃，34 s，循环40次)；n=3。引物序列见表1。

1.4.7 划痕实验 ①用灭菌PBS溶解葡萄糖粉末，配置为10×贮存液(浓度为350 mmol/L，D-Glucose相对分子质量180.16)，使用0.22 μm滤器过滤，4 ℃冰箱密封保存，确保一两周用完，按照1∶10比例加入DMEM完全培养基，使葡萄糖终浓度为35 mmol/L。②使用灭菌去离子水溶解外源性补充重组人血管生成素样蛋白4，配置为100×贮存液(质量浓度为200 µg/mL)，保存于-80 ℃低温冰箱，使用前提前1 d转移至4 ℃冰箱解冻，解冻后的蛋白贮存液1周内用完，避免反复冻融；按照1∶100比例加入DMEM完全培养基，使重组人血管生成素样蛋白4终质量浓度为2 µg/mL。③将成纤维细胞分对照组和外源性补充血管生成素样蛋白4组。对照组细胞经高糖+等量灭菌去离子水处理；外源性补充血管生成素样蛋白4组细胞经高糖+重组人血管生成素样蛋白4处理。④在六孔板底部划线，以直尺为参照物，线条平行于六孔板长边，每条线间隔0.5 cm，每孔划5条线。使用胰蛋白酶消化人皮肤成纤维细胞，计算细胞数量。按照1.5×105/孔的密度接种，再加入培养基补充至2 mL，放入恒温培养箱中培养24 h。显微镜观察细胞状态，每孔细胞达90%融合率时，用100 μL移液枪枪头平行于六孔板短边划线，再贴壁加入PBS轻轻摇晃去除未贴壁细胞，吸取PBS弃掉。分别在0，24，48 h拍照，观察成纤维细胞迁移情况。
1.4.8 CCK-8实验 消化人皮肤成纤维细胞为单细胞悬液，调整细胞浓度为2×107 L-1，接种于96孔板，每孔100 μL，在恒温培养箱中孵育24 h。弃原有培养基，分别在0，24，48 h每孔加入含10 μL CCK8试剂的100 μL培养基，设置空白孔对照。培养箱中继续避光孵育2 h，提前打开酶标仪，设置波长为450 nm，测定每孔吸光度，检测成纤维细胞增殖活力。
1.4.9 细胞免疫荧光染色(Ki67) 将原代人脐静脉内皮细胞分对照组和外源性补充血管生成素样蛋白4组。细胞处理方法同1.4.7。将细胞爬片固定于40 g/L多聚甲醛。PBS冲洗3次。0.3% Triton溶液打孔，山羊血清封闭液按照适合的比例稀释Ki67一抗(浓度为1∶1 000)。在一抗孵育结束后，室温复温30 min。PBS冲洗3次。使用山羊血清封闭液按照适合的比例稀释荧光二抗，避光，室温下孵育2 h。二抗孵育结束后，PBS冲洗3次。使用含DAPI防荧光淬灭封片剂进行封固。避免产生气泡，4 ℃冰箱中避光保存。共聚焦显微镜观察和拍照，检测内皮细胞的增殖能力。
1.5 主要观察指标 ①皮肤组织病理变化，观察皮肤中血管生成素样蛋白4表达；②检测皮肤组织血管生成素样蛋白4的mRNA表达；③CCK-8、Ki67检测人皮肤成纤维细胞的增殖活力；④划痕实验检测人皮肤成纤维细胞的迁移能力。
1.6 统计学分析 研究数据的统计采用GraphPad Prism 9。每例患者标本均经免疫组化染色、苏木精-伊红染色和qRT-PCR检测(n=3)；基于人永生化皮肤成纤维细胞系和原代人脐静脉内皮细胞的所有数据均经过3次独立重复实验进行验证，表示方法为x±s。使用t检验或单因素方差分析方法进行分析。P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经天津大学生物统计学专家审核。

讨论

此次研究通过生物信息学方法和实验验证揭示了血管生成素样蛋白4在糖尿病足形成中的关键作用，尤其是在调节成纤维细胞和内皮细胞功能、促进血管因素改善方面的潜力[23]，其结果不仅为糖尿病足的发病机制提供了新的见解，也为未来的治疗策略开辟了新的方向。
既往研究表明，血管生成素样蛋白4在多种生理和病理条件下具有重要作用，包括调节脂质代谢[24]、炎症反应[25]、血管生成及细胞增殖等[26-27]。在糖尿病相关研究领域，血管生成素样蛋白4被发现能够影响糖尿病并发症的发展，尤其是在糖尿病性视网膜病变和肾病变中[28]。这些研究揭示了血管生成素样蛋白4在糖尿病相关疾病的病理生理过程中可能发挥的多面向作用[29]。
此次研究表明血管生成素样蛋白4在糖尿病足患者中的低表达可能是导致血管功能障碍和修复能力下降的重要因素。血管功能的正常调节对于维持组织氧合和促进伤口愈合至关重要。血管生成素样蛋白4在调节血管新生、血管稳定性及内皮细胞功能等方面的作用表明，其下调可能直接影响了糖尿病足中的血管修复和再生过程，从而加剧了组织损伤和延缓了伤口的愈合[30]。外源性补充血管生成素样蛋白4能够增强高糖环境下成纤维细胞和内皮细胞的迁移及增殖能力，这一发现为糖尿病足的治疗提供了新的策略。成纤维细胞和内皮细胞在伤口愈合过程中扮演着重要角色[31]，通过促进这两种细胞类型的功能，可能加速糖尿病足患者的伤口愈合过程[32]。该机制的发现为血管生成素样蛋白4成为糖尿病足治疗的潜在靶点提供了科学依据。
此外，此次研究中血管生成素样蛋白4对成纤维细胞和内皮细胞功能的正向调节效果，进一步强调了糖尿病足治疗中血管因素的重要性。糖尿病足的治疗策略应当更多地考虑到血管因素的改善，以促进更有效的伤口愈合[33]。然而，尽管研究取得了一系列重要发现，但仍存在一些限制。例如，研究中主要侧重于血管生成素样蛋白4的作用及其对成纤维细胞和内皮细胞的影响，而对于血管生成素样蛋白4与其他糖尿病足相关分子之间的相互作用以及这些相互作用如何影响糖尿病足的整体病理过程仍然缺乏深入了解。因此，未来的研究需要采用更为全面的方法来探索血管生成素样蛋白4在糖尿病足发病机制中的作用，以及如何更有效地将血管生成素样蛋白4及其调节机制应用于糖尿病足的临床治疗中。
总之，此次研究揭示了血管生成素样蛋白4在糖尿病足形成中的重要作用，特别是调节成纤维细胞和内皮细胞的增殖、迁移等生物学功能。研究不仅为糖尿病足的发病机制提供了新的见解，也为糖尿病足的治疗策略提供了新的方向。基于此结果，未来的研究可以进一步探索血管生成素样蛋白4及其相关信号通路在糖尿病足中的作用机制，以及如何通过调控血管生成素样蛋白4来优化糖尿病足的治疗效果，验证其作为糖尿病足治疗靶点的潜力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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血管生成素样蛋白4通过调节成纤维细胞和内皮细胞功能影响糖尿病足进程

Angiopoietin-like protein 4 affects progression of diabetic foot by regulating fibroblast and endothelial cell functions

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[1]	韩海慧, 冉磊, 孟晓辉, 辛鹏飞, 向峥, 边艳琴, 施杞, 肖涟波. 靶向成纤维细胞生长因子受体1信号改善类风湿关节炎的骨破坏[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(9): 1905-1912.
[2]	李俊, 巩晶晶, 孙国斌, 郭睿, 丁杨, 强立娟, 张晓莉, 方占海. miR-27a-3p激活MAPK信号通路促进人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1609-1617.
[3]	陈玉宁, 蒋颖, 廖翔宇, 陈琼君, 熊亮, 刘悦, 刘通. 补气活血合剂干预脑缺血再灌注模型大鼠相关因子及自噬蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(6): 1152-1158.
[4]	张德宝, 王鹏, 李琨, 张少杰, 李志军, 李树文, 吴一民. 自体黄韧带干预下兔硬膜外纤维瘢痕的形成[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(6): 1168-1175.
[5]	韩海慧, 孟晓辉, 徐博, 冉磊, 施杞, 肖涟波. 成纤维细胞生长因子受体1抑制剂对胶原诱导关节炎模型大鼠骨破坏的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(5): 968-977.
[6]	董美林, 都海宇, 刘源. 负载槲皮素的羧甲基壳聚糖水凝胶促进糖尿病大鼠创面愈合[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 692-699.
[7]	王琛, 张伟男, 沈冀宁, 刘璠, 袁即山, 刘雅克. 铁死亡抑制剂通过活性氧途径对钴纳米颗粒毒性的抑制作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(34): 7310-7317.
[8]	赵建伟, 李勋胜, 吕金朋, 周珏, 蒋一頔, 岳志刚, 孙红梅. 鹿茸干细胞外泌体复合水凝胶促进烫伤皮肤的修复[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(34): 7344-7352.
[9]	赵艺涵, 孙旭杭, 赵琳, 蒋士卿. 外泌体miRNA治疗多发性骨髓瘤的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6743-6752.
[10]	柳剑, 刘庆, 黄野, 曹光磊, 刘源, 宋卿鹏. 生长因子促进膝软骨再生：研究热点的文献计量学分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(29): 6351-6359.
[11]	纪雅琼, 宁忠平. 芍药苷对血管紧张素Ⅱ诱导心肌成纤维细胞纤维化的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(25): 5382-5389.
[12]	周丽君, 张克远, 徐飞虎, 王茜, 俞丽, 董士铭, 徐俊宇, 郭宇沨, 马海蓉, 丁红. 环状RNA SEC24A对骨关节炎滑膜成纤维细胞增殖和凋亡的影响及机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(24): 5086-5092.
[13]	岳进茹, 张育敏, 刘静淑, 步亚男, 吴婧若, 陈佳, 王建茹. 独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(23): 4915-4926.
[14]	张彦峰, 张慧敏, 何翔, 郑屿萍. 长链非编码RNA核富集转录本1对瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡和迁移的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(2): 347-354.
[15]	刘福水, 钱嘉铭, 方婷, 哈留娜, 赵小兰, 朱金超, 王小乐. 针刀干预后颈椎病大鼠头夹肌成纤维细胞生长因子家族及其受体的表达[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(18): 3775-3783.