人脐带间充质干细胞联合褪黑素治疗化疗致早发性卵巢功能不全的作用及机制

doi:10.12307/2025.518

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (25): 5281-5288.doi: 10.12307/2025.518

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人脐带间充质干细胞联合褪黑素治疗化疗致早发性卵巢功能不全的作用及机制

魏璐晓1，2，3，黄冰雪1，2，杜静1，2，3，石拴霞1，2，王纪田1，2，王玲1

中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院，1生殖医学中心，3甘肃省干细胞与基因药物重点实验室，甘肃省兰州市 730000；2甘肃中医药大学第一临床医学院，甘肃省兰州市 730000

收稿日期:2024-04-10 接受日期:2024-06-01 出版日期:2025-09-08 发布日期:2024-12-14
通讯作者: 王玲，主任医师，中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院生殖医学中心，甘肃省兰州市 730000
作者简介:魏璐晓，女，1996年生，河南省新乡市人，汉族，甘肃中医药大学在读硕士，主要从事生殖内分泌和女性生育力保护等研究。
基金资助:
军队后勤科研项目(2023HQZZ-04)，项目负责人：王玲；甘肃省自然科学基金项目(22JR11RA010)，项目负责人：王玲；兰州市科技计划项目(2023-ZD-182)，项目负责人：王玲

Therapeutic effects and mechanism of human umbilical cord mesenchymal stem cells combined with melatonin on premature ovarian insufficiency induced by chemotherapy

Wei Luxiao1, 2, 3, Huang Bingxue1, 2, Du Jing1, 2, 3, Shi Shuanxia1, 2, Wang Jitian1, 2, Wang Ling1

1Reproductive Medicine Center, 3Key Laboratory of Stem Cells and Gene Drugs of Gansu Province, 940 Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; 2First Clinical Medical College of Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, Gansu Province, China

Received:2024-04-10 Accepted:2024-06-01 Online:2025-09-08 Published:2024-12-14
Contact: Wang Ling, Chief physician, Reproductive Medicine Center, 940 Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
About author:Wei Luxiao, Master candidate, Reproductive Medicine Center, and Key Laboratory of Stem Cells and Gene Drugs of Gansu Province, 940 Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; First Clinical Medical College of Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
Supported by:
Military Logistics Research Project, No. 2023HQZZ-04 (to WL); Gansu Natural Science Foundation, No. 22JR11RA010 (to WL); Lanzhou Science and Technology Plan Project, No. 2023-ZD-182 (to WL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

早发性卵巢功能不全：是女性常见的内分泌疾病，指女性在40岁之前出现的卵巢功能减退，主要表现为月经稀发或闭经至少4个月，间隔4周以上随机2次检查卵泡刺激素≥25 IU/L，伴雌激素水平降低，严重影响女性生育健康。
人脐带间充质干细胞：从人脐带华通胶组织中分离培养的一种间充质干细胞，具有自我复制及多向分化潜能，在组织修复和再生方面发挥着重要的作用。

摘要
背景：目前研究证明，人脐带间充质干细胞和褪黑素均可改善卵巢功能，但人脐带间充质干细胞联合褪黑素对化疗所致早发性卵巢功能不全的保护作用及机制尚未有研究报道。
目的：探讨人脐带间充质干细胞联合褪黑素对化疗所致早发性卵巢功能不全的保护作用及机制。
方法：将动情周期正常的40只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、人脐带间充质干细胞组、褪黑素组和人脐带间充质干细胞+褪黑素组，每组8只。除对照组外，其他组腹腔注射顺铂溶液构建早发性卵巢功能不全大鼠模型，人脐带间充质干细胞组和人脐带间充质干细胞+褪黑素组于造模后第1，6，11天分别尾静脉注射1×106个人脐带间充质干细胞，褪黑素组和人脐带间充质干细胞+褪黑素组每日腹腔注射10 mg/kg褪黑素，治疗期间监测大鼠体质量和动情周期变化。治疗14 d后，ELISA法检测血清雌二醇、卵泡刺激素、促黄体生成素、抗缪勒管激素水平，计算卵巢指数，苏木精-伊红染色观察卵巢组织学形态，透射电镜观察卵巢颗粒细胞超微结构，Western blot检测PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白和LC3、P62等自噬蛋白在卵巢组织中的表达。

结果与结论：①与对照组相比，模型组大鼠体质量逐渐减轻、动情周期紊乱，卵巢指数显著下降(P < 0.01)；雌二醇、抗缪勒管激素水平降低(P < 0.01)，卵泡刺激素、促黄体生成素水平升高(P < 0.01)；卵巢组织学形态和卵巢颗粒细胞超微结构严重破坏；p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和P62蛋白表达显著降低(P < 0.01)，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著升高(P < 0.001)。②与模型组相比，各治疗组大鼠体质量逐渐恢复，部分大鼠动情周期恢复正常，卵巢指数显著升高(P < 0.01)；雌二醇、抗缪勒管激素水平升高(P < 0.05)，卵泡刺激素、促黄体生成素水平降低(P < 0.05)；卵巢组织学形态和卵巢颗粒细胞超微结构显著改善；p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和P62蛋白表达显著升高(P < 0.001)，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著降低(P < 0.01)。其中人脐带间充质干细胞+褪黑素组上述指标改善更为显著。结果表明，人脐带间充质干细胞联合褪黑素可能通过上调PI3K/AKT/mTOR信号通路，抑制卵巢颗粒细胞自噬来治疗早发性卵巢功能不全。

https://orcid.org/0009-0007-1131-7088 (魏璐晓)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 早发性卵巢功能不全, 人脐带间充质干细胞, 褪黑素, 雌激素, 自噬, PI3K, AKT, mTOR

Abstract: BACKGROUND: Current research has shown that human umbilical cord mesenchymal stem cells and melatonin can both improve ovarian function. However, the protective effect and mechanism of human umbilical cord mesenchymal stem cells combined with melatonin on chemotherapy-induced premature ovarian insufficiency have not been reported.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect and mechanism of human umbilical cord mesenchymal stem cells combined with melatonin on chemotherapy-induced premature ovarian insufficiency.
METHODS: Forty Wistar rats with normal estrous cycle were randomly divided into control group, model group, human umbilical cord mesenchymal stem cell group, melatonin group, and human umbilical cord mesenchymal stem cell+melatonin group, with 8 rats in each group. In addition to the control group, the rat model of premature ovarian insufficiency was constructed by intraperitoneal injection of cisplatin solution. The rats in the human umbilical cord mesenchymal stem cell group and the human umbilical cord mesenchymal stem cell+melatonin group were injected with 1×106 human umbilical cord mesenchymal stem cells in the tail vein at 1, 6, and 11 days after modeling, respectively. The rats in the melatonin group and human umbilical cord mesenchymal stem cell+melatonin group were injected intraperitoneally with 10 mg/kg melatonin daily. The changes in body mass and estrous cycle of rats were monitored during treatment. After 14 days of treatment, ELISA was used to detect serum levels of estradiol, follicle stimulating hormone, luteinizing hormone, and anti Mullerian hormone. Ovarian index was calculated. Hematoxylin-eosin staining was performed to observe ovarian histological morphology. Ultrastructure of ovarian granulosa cells was observed by transmission electron microscopy. Western blot assay was conducted to detect the expression of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway proteins and LC3 and P62 autophagy proteins in ovarian tissues.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, the body mass of rats in the model group decreased gradually, the estrous cycle was disturbed, and the ovarian index decreased significantly (P < 0.01). The levels of estradiol and anti-Mullerian hormone were decreased (P < 0.01), while the levels of follicle stimulating hormone and luteinizing hormone were increased (P < 0.01). The histological morphology and granulosa cell ultrastructure of ovary were seriously damaged. The protein expressions of p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and P62 were significantly decreased (P < 0.01), while the protein expressions of LC3II/I were significantly increased (P < 0.001). (2) Compared with the model group, the body mass of rats in all treatment groups recovered gradually, the estrous cycle of some rats returned to normal, and the ovarian index was significantly increased (P < 0.01); the levels of estradiol and anti-Mullerian hormone were increased (P < 0.05), while the levels of follicle stimulating hormone and luteinizing hormone were decreased (P < 0.05). The histological morphology and ultrastructure of ovary were significantly improved. The protein expressions of p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and P62 were significantly increased (P < 0.001), while the protein expression of LC3II/I was significantly decreased (P < 0.01). Human umbilical cord mesenchymal stem cell+melatonin group showed more significant improvement in the above indexes. The results suggest that human umbilical cord mesenchymal stem cells combined with melatonin may inhibit ovarian granulosa cell autophagy by upregulating PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to treat premature ovarian insufficiency.

Key words: premature ovarian insufficiency, human umbilical cord mesenchymal stem cell, melatonin, estrogen, autophagy, PI3K, AKT, mTOR

中图分类号:

魏璐晓, 黄冰雪, 杜静, 石拴霞, 王纪田, 王玲. 人脐带间充质干细胞联合褪黑素治疗化疗致早发性卵巢功能不全的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(25): 5281-5288.

Wei Luxiao, Huang Bingxue, Du Jing, Shi Shuanxia, Wang Jitian, Wang Ling. Therapeutic effects and mechanism of human umbilical cord mesenchymal stem cells combined with melatonin on premature ovarian insufficiency induced by chemotherapy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(25): 5281-5288.

图/表（结果） 6

2.1 人脐带间充质干细胞的分离培养、鉴定和诱导分化结果 组织贴壁法分离培养至第7天可见贴壁梭形细胞从组织周围爬出，生长状态良好，见图1A，约15 d时组织周围细胞生长达80%以上，见图1B。第3代人脐带间充质干细胞表面抗原CD44、CD73、CD90阳性表达，CD34、CD45、HLA-DR阴性表达，符合国际细胞治疗协会提出的间充质干细胞鉴定标准[13]，说明实验分离培养所得细胞为人脐带间充质干细胞，见图2。成脂诱导分化2周后，显微镜下观察可见脂滴形成，油红O染色后脂滴呈红色，见图3A；成骨诱导分化3周后，显微镜下观察可见钙结节形成，茜素红染色后钙结节呈红色，见图3B；成软骨诱导分化3周后，可见直径约1 mm的软骨球形成，石蜡切片阿利新蓝染色呈蓝色，见图3C。
2.2 大鼠一般情况及动情周期变化 对照组大鼠随饲养时间的延长，体质量逐渐增加，精神、饮食、活动状态均无异常。其余组大鼠经过顺铂造模后，出现精神萎靡、进食水减少、活动减少、喜抱团、毛色发黄等情况，部分出现不同程度的腹泻，体质量逐渐下降，于造模第14天体质量达最低水平。经过治疗后，各治疗组大鼠精神好转，进食水及活动增加，毛色变白，体质量逐渐恢复，见图4。
性成熟大鼠动情周期为四五天，分为动情前期、动情期、动情后期和动情间期[14]。动情前期主要特征是大量圆形或椭圆形的有核细胞；动情期主要特征是大量不规则片状无核角化细胞；动情后期是动情期向动情间期的过渡，主要特征是有核细胞、无核角化细胞和白细胞同时存在；动情间期主要特征是大量白细胞和少量无核角化细胞[15]，见图5。与对照组比较，模型组大鼠动情周期紊乱，表现为动情周期延长，停滞在动情间期或动情后期，部分大鼠阴道涂片时偶见血性分泌物。经过14 d治疗后，人脐带间充质干细胞组和褪黑素组动情周期正常大鼠占37.5%，人脐带间充质干细胞+褪黑素组动情周期正常大鼠占50%，而模型组无动情周期正常大鼠，表明人脐带间充质干细胞联合褪黑素治疗可使早发性卵巢功能不全大鼠动情周期恢复正常。
2.3 大鼠卵巢指数的变化 与对照组比较，模型组卵巢指数显著下降(P < 0.01)；与模型组比较，各治疗组卵巢指数均显著增加(P < 0.01)，其中人脐带间充质干细胞+褪黑素组差异更为显著(P < 0.001)；与褪黑素组比较，人脐带间充质干细胞+褪黑素组卵巢指数增加更为明显(P < 0.05)，表明人脐带间充质干细胞联合褪黑素治疗可明显改善卵巢萎缩，增加卵巢指数，见图6。
2.4 大鼠血清性激素水平的变化 与对照组比较，模型组雌二醇、抗缪勒管激素水平降低(P < 0.01)，卵泡刺激素、促黄体生成素水平升高(P < 0.01)；与模型组比较，各治疗组雌二醇、抗缪勒管激素水平均升高(P < 0.05)，卵泡刺激素、促黄体生成素水平均降低(P < 0.05)；与人脐带间充质干细胞组和褪黑素组比较，人脐带间充质干细胞+褪黑素组雌二醇、抗缪勒管激素水平升高更为明显(P < 0.05)，卵泡刺激素、促黄体生成素水平降低更为明显(P < 0.05)，表明人脐带间充质干细胞联合褪黑素治疗可明显改善大鼠卵巢的内分泌功能，见图7。

2.5 大鼠卵巢组织形态学变化及卵泡计数结果 与对照组比较，模型组卵母细胞溶解，透明袋塌陷，呈不规则状，闭锁卵泡显著增加(P < 0.01)，原始卵泡、成熟卵泡和生长卵泡减少，但差异无显著性意义(P > 0.05)，髓质中可见较多血管扩张充血，表明顺铂可破坏卵巢组织形态，改变各级卵泡的数量。与模型组比较，人脐带间充质干细胞+褪黑素组卵泡结构正常，闭锁卵泡显著减少(P < 0.001)，成熟卵泡增加(P < 0.05)，原始卵泡和生长卵泡增加，但差异无显著性意义(P > 0.05)，髓质中血管未见明显异常；人脐带间充质干细胞+褪黑素组与人脐带间充质干细胞组比较，各级卵泡差异均无显著性意义(P > 0.05)，髓质血管扩张充血明显减轻；与褪黑素组比较，人脐带间充质干细胞+褪黑素组闭锁卵泡减少更为明显(P < 0.05)，表明人脐带间充质干细胞联合褪黑素治疗可改善卵巢组织学形态，减少闭锁卵泡，增加成熟卵泡，改善卵巢储备功能，见图8，9和表1。

2.6 大鼠卵巢颗粒细胞超微结构的变化 与对照组比较，模型组损伤程度较高，颗粒细胞的细胞膜呈锯齿样，细胞核呈不规则形，线粒体严重肿胀、空泡变，粗面内质网呈碎片样，高尔基体轻微肥大，囊膜轻微扩张，偶见自噬溶酶体，表明顺铂可严重损伤卵巢细胞超微结构。与模型组比较，人脐带间充质干细胞+褪黑素组细胞核膜逐渐恢复，粗面内质网及高尔基体改善，自噬溶酶体减少，但线粒体仍存在肿胀；与人脐带间充质干细胞组和褪黑素组比较，人脐带间充质干细胞+褪黑素组卵巢颗粒细胞的细胞器改善较为明显，表明人脐带间充质干细胞联合褪黑素治疗可改善早发性卵巢功能不全大鼠卵巢颗粒细胞损伤，见表2，图10。

2.7 大鼠卵巢组织相关蛋白表达量的变化 与对照组比较，模型组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和P62蛋白表达量显著降低(P < 0.01)，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达量显著升高(P < 0.001)；与模型组比较，各治疗组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和P62蛋白表达量均显著升高(P < 0.001)，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达量均显著降低(P < 0.01)，其中人脐带间充质干细胞+褪黑素组差异更为显著(P < 0.001)；与人脐带间充质干细胞组和褪黑素组比较，人脐带间充质干细胞+褪黑素组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-TOR/mTOR和P62蛋白表达量升高更为明显(P < 0.05)，表明人脐带间充质干细胞联合褪黑素治疗早发性卵巢功能不全可能是通过上调PI3K/AKT/mTOR信号通路，抑制卵巢颗粒细胞自噬来改善化疗引起的卵巢功能损伤，见图11。

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引言

早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是指女性在40岁之前出现的卵巢功能减退，主要表现为月经稀发或闭经至少4个月，卵泡刺激素随机2次检查(间隔> 4周)≥25 IU/L，伴有雌激素水平降低为特征的疾病[1]。近年来，女性早发性卵巢功能不全的总发病率约为1%[2]，是中国女性不孕的常见病因之一。早发性卵巢功能不全病因复杂，目前已知的病因包括遗传因素(染色体异常和基因突变)、自身免疫因素、医源性因素(手术和放化疗)、代谢异常(激素异常、酶缺乏以及线粒体缺陷)、环境和感染因素等[3]。早发性卵巢功能不全的治疗方法包括激素替代治疗、免疫治疗、卵泡体外激活、卵母细胞冻存、胚胎冻存及卵巢组织冻存移植等。临床常用激素替代治疗来缓解早发性卵巢功能不全患者失眠、潮热盗汗、情绪改变、阴道干涩等雌激素缺乏症状，但激素替代治疗增加了患乳腺癌、子宫内膜癌和脑卒中的风险[4]。因此，迫切需要能够有效改善早发性卵巢功能不全患者卵巢功能的治疗方法。
随着再生医学的进步，间充质干细胞已被广泛运用于治疗多种临床疾病，在促进组织修复和再生方面发挥着重要的作用。其中，人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)具有来源广泛、取材方便、易体外分离培养、生物学特性稳定、无致瘤性、免疫原性低等优点，成为近年来的研究热点。已有多项研究表明，人脐带间充质干细胞对化疗药物诱导的小鼠或大鼠卵巢损伤均具有保护作用，可以向卵巢组织定向迁移并存活，抑制卵泡闭锁，维持卵泡发育，修复卵巢结构，改善卵巢功能和生殖预后[5-7]，有望成为保护和修复化疗所致卵巢损伤的新方法，为保留生育功能的年轻女性癌症幸存者带来希望。褪黑素是由松果体分泌的一种内分泌激素，分布于人体许多组织中，包括女性的生殖系统，可促进卵母细胞、颗粒细胞的生长发育和成熟，促进卵巢激素的合成，改善卵泡发育[8]。近年来研究发现，褪黑素对顺铂引起的卵巢功能损伤具有保护作用[9-10]。根据目前研究表明，人脐带间充质干细胞或褪黑素单一治疗均可有效改善卵巢功能，但人脐带间充质干细胞联合褪黑素对早发性卵巢功能不全的治疗是否有协同作用尚不明确。因此，该研究将通过腹腔注射顺铂溶液构建早发性卵巢功能不全大鼠模型，探讨人脐带间充质干细胞联合褪黑素对早发性卵巢功能不全的治疗作用及机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。
1.2 时间及地点 实验于2023年3月至2024年1月在中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院甘肃省干细胞与基因药物重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 40只SPF级8周龄Wistar雌性大鼠，体质量(200±20) g，购自山东济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物许可证号：SCXK(鲁)20220006，饲养于中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院动物实验科，环境安静、干燥、温度适宜、通风良好。动物实验方案经中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院科研管理伦理委员会批准，审批号为2023KYLL177。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 脐带样本 取足月新生儿脐带，经产妇及家属知情同意，并经中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院科研管理伦理委员会批准，伦理审批编号：2023KYLL177。
1.3.3 主要试剂与仪器 顺铂(上海阿拉丁，C295225)；褪黑素(上海翌圣生物，60815ES08)；大鼠促黄体生成素ELISA试剂盒(上海江莱生物，JL11706)；大鼠雌二醇ELISA检测试剂盒(上海江莱生物，JL11525)；大鼠卵泡刺激素ELISA试剂盒(上海江莱生物，JL13251)；大鼠抗缪勒管激素ELISA试剂盒(上海江莱生物，JL12462)；DMEM培养基(武汉赛维尔生物，G4520)；胎牛血清(天津灏洋生物，TBD15HT)；0.25%EDTA胰蛋白酶(北京索莱宝，T1320)；青-链霉素混合液(北京索莱宝，P1400)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝，PC0020)；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(北京索莱宝，P1200)；PI3K抗体(美国CST，4257T)；AKT抗体(美国CST，4691T)；p-AKT抗体(美国CST，4060T)；LC3抗体(美国CST，12741T)；p-PI3K抗体(Affinity，AF3241)；mTOR抗体(Affinity，AF6308)；p-mTOR抗体(Affinity，AF3308)；P62抗体(Affinity，AF5384)；山羊抗兔二抗(博士德生物，BM3894)；CD44抗体(武汉伊莱瑞特生物，E-AB-F1038D)；CD73抗体(武汉伊莱瑞特生物，E-AB-F1242D)；CD90抗体(武汉伊莱瑞特生物，E-AB-F1167D)；CD34抗体(武汉伊莱瑞特生物，E-AB-F1143D)；CD45抗体(武汉伊莱瑞特生物，E-AB-F1137D)；HLA-DR抗体(武汉伊莱瑞特生物，E-AB-F1111D)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；全波长多功能微孔板分析系统(瑞士Tecan公司)；化学发光成像仪(森西赛智科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 人脐带间充质干细胞的分离培养及鉴定 取足月新生儿脐带，在生物安全柜内用PBS充分冲洗脐带表面，用眼科镊和组织剪去除脐带血管，分离出华通胶组织，用PBS反复冲洗后剪成大小为1.0-2.0 mm3的组织块，均匀铺在100 mm培养皿中，加入适量含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中，第5天首次换液，以后每3 d换液1次。当细胞长满皿底时，弃培养基和组织块，0.25%EDTA-胰蛋白酶消化2 min，按1∶2接种培养至75 cm2培养瓶中，每2 d换液1次，长满后进行下次传代。收集第3代人脐带间充质干细胞，按照抗体使用说明书分别加入适量CD34、CD44、CD45、CD73、CD90和HLA-DR单抗，室温避光孵育30 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗2遍，加入PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达。
收集第3代人脐带间充质干细胞，以2×104/cm2的细胞密度接种于6孔板中进行成脂和成骨诱导分化，以4×105/cm2的细胞密度接种于15 mL离心管中进行成软骨诱导分化，分别加入成脂、成骨和成软骨诱导分化培养基，定期更换培养基，直至出现足量、大小适宜的脂滴、钙结节和软骨球时，40 g/L多聚甲醛固定，成脂、成骨诱导分化后分别进行油红O、茜素红染色，成软骨诱导分化形成的软骨球石蜡包埋切片进行阿利新蓝染色，显微镜下观察拍照。
1.4.2 构建早发性卵巢功能不全大鼠模型及分组处理 所有大鼠适应性饲养1周，每日阴道涂片观察其动情周期，筛选动情周期正常的大鼠40只纳入实验，随机分为对照组、模型组、人脐带间充质干细胞组、褪黑素组和人脐带间充质干细胞+褪黑素组，每组8只。造模方案参照文献[11]，于第1，8天腹腔注射6 mg/kg顺铂溶液构建早发性卵巢功能不全大鼠模型。通过观察动情周期、卵巢形态和检测性激素水平明确是否成功造模。主要包括以下3个方面[12]：①动情周期紊乱；②卵巢萎缩，成熟卵泡较少，闭锁卵泡增加，卵巢间质增生明显；③血清卵泡刺激素水平升高，雌二醇水平降低。
人脐带间充质干细胞组和人脐带间充质干细胞+褪黑素组于造模后第1，6，11天分别尾静脉注射第3代1×106个人脐带间充质干细胞。褪黑素组和人脐带间充质干细胞+褪黑素组每日腹腔注射10 mg/kg褪黑素，连续治疗14 d。治疗14 d后，2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射进行麻醉，注射剂量为2 mL/kg，采集动脉血和卵巢组织，取材前48 h腹腔注射孕马血清促性腺激素，取材时使大鼠处于同一动情周期。腹主动脉采血，3 000 r/min离心15 min，收集上层血清，取出的卵巢组织称质量，计算卵巢指数=双侧卵巢湿质量/体质量×100%。左侧卵巢于40 g/L多聚甲醛室温固定用于苏木精-伊红染色，右侧卵巢组织一部分放入2.5%戊二醛溶液中4 ℃保存，另一部分-80 ℃保存用于后续Western blot实验。
1.5 主要观察指标
1.5.1 大鼠一般情况和动情周期的监测 从造模第1天开始至治疗结束，每日观察大鼠精神、饮食、活动和毛色等一般状态，并称量体质量，阴道涂片观察大鼠的动情周期变化，使用移液枪吸取40 μL生理盐水打入大鼠阴道内，反复吹打3次，吸出阴道冲洗液均匀地涂在载玻片上，自然晾干后在显微镜下观察阴道脱落细胞形态。
1.5.2 苏木精-伊红染色观察大鼠卵巢组织学形态和各级卵泡 卵巢组织于40 g/L多聚甲醛室温固定过夜，经石蜡包埋、切片和苏木精-伊红染色后，在显微镜下观察卵巢组织学形态并拍照，计数原始卵泡、生长卵泡、成熟卵泡和闭锁卵泡的数量，生长卵泡包括初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡。
1.5.3 ELISA检测血清性激素水平 采用ELISA检测大鼠血清雌二醇、卵泡刺激素、促黄体生成素和抗缪勒管激素水平，具体实验步骤参考上海江莱生物ELISA试剂盒说明书。
1.5.4 透射电镜观察卵巢颗粒细胞超微结构 取体积约为2 mm3的卵巢组织进行固定、脱水、包埋、聚合和超薄切片铀铅双染色等步骤，透射电子显微镜下观察卵巢颗粒细胞的细胞膜、细胞核、线粒体、高尔基体、粗面内质网和自噬溶酶体等超微结构并拍照分析。
1.5.5 Western blot检测卵巢组织相关蛋白表达 将卵巢组织从-80 ℃冰箱取出，称质量并加入RIPA裂解液进行匀浆，匀浆结束后冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，提取上清液得到组织蛋白溶液，根据BCA试剂盒检测蛋白浓度，计算上样量，根据组织蛋白溶液总体积加入4×蛋白上样缓冲液(组织蛋白溶液总体积/3)，100 ℃煮沸15 min，-80 ℃冰箱保存备用。经过制胶、电泳、转膜、封闭、一抗孵育(PI3K抗体：1∶500，p-PI3K抗体：1∶500，AKT抗体：1∶1 000，p-AKT抗体：1∶1 000，mTOR抗体：1∶500，p-mTOR抗体：1∶500)、二抗孵育(HRP标记山羊抗兔，1∶10 000)和显影等一系列步骤，采用Image J软件分析目的条带，以β-actin为内参蛋白，计算目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学分析 采用 SPSS 25.0 软件对数据进行统计分析，计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。统计图采用Graph Pad Prism 8.0软件绘制。文章统计学方法已经通过甘肃中医药大学统计学专家审核。

讨论

早发性卵巢功能不全是一种病因复杂的疾病，其中化疗是导致医源性早发性卵巢功能不全发生的重要因素之一。2020年，全球有920万女性被诊断为癌症患者[16]，由于癌症诊断和治疗的进步，年轻女性癌症患者的生存率已经显著提高，但化疗引起的性腺毒性仍是主要并发症之一。化疗药物可直接诱导DNA损伤，激活凋亡和/或自噬相关通路，最终导致早发性卵巢功能不全的发生[17-21]。因此，迫切需要更有效的治疗方法来改善化疗引起的卵巢功能损伤。人脐带间充质干细胞来源于脐带华通胶，具有取材方便、无伦理限制等优点，成为近年来再生医学的研究热点。多项研究发现，人脐带间充质干细胞可改善化疗导致的早发性卵巢功能不全[7，22-23]。因此，人脐带间充质干细胞势必会成为治疗早发性卵巢功能不全的理想种子细胞。有研究指出，多次移植人脐带间充质干细胞治疗效果优于单次移植[24]，移植方式包括原位注射和静脉注射，由于化疗药物导致动物机体耐受能力变差，且原位注射损伤较大，增加动物死亡率，因此实验选择多次尾静脉注射进行治疗。近年来研究发现，褪黑素发挥促进卵泡发育、改善原始卵泡池耗竭、抗氧化应激、抗炎、提高妊娠率和优质囊胚率等作用，改善卵巢功能[25]。已有研究表明，褪黑素预处理的人脐带间充质干细胞有利于2型糖尿病和宫腔粘连的恢复[26-27]。该研究显示人脐带间充质干细胞联合褪黑素可通过增加大鼠血清雌二醇、抗缪勒管激素水平，降低血清卵泡刺激素、黄体生成素水平，恢复动情周期，增加卵巢指数，改善卵巢组织形态学，从而发挥对早发性卵巢功能不全大鼠卵巢功能的保护作用，为早发性卵巢功能不全患者提供了新的治疗思路和方法。
目前的研究发现，卵泡中存在完整的PI3K/AKT/mTOR信号通路，调控卵泡的闭锁和凋亡，该通路不仅决定卵泡的静止和激活，还参与卵巢颗粒细胞的增殖和分化，进而调节卵泡的发育[28]。颗粒细胞起源于卵泡，近年来人们发现颗粒细胞自噬与卵泡闭锁有关[29]。CHOI等[30]证实卵泡发育和闭锁是通过PI3K/AKT/mTOR信号通路来调控颗粒细胞自噬，表明PI3K/AKT/mTOR信号通路与卵巢颗粒细胞自噬密切相关。自噬是一种细胞和能量稳态反应，有助于维持健康的原始卵泡数量、生殖细胞存活和黄体的清除，但过度的自噬导致细胞死亡，改变卵母细胞的质量和数量，最终影响女性生殖健康[31]。为了进一步研究人脐带间充质干细胞联合褪黑素对早发性卵巢功能不全发挥保护作用的具体机制，检测了PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白和自噬蛋白LC3、P62在卵巢组织中的表达，结果显示，模型组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和P62蛋白表达降低，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达升高，说明顺铂可能通过下调PI3K/AKT/mTOR信号通路，激活颗粒细胞自噬，进而导致早发性卵巢功能不全的发生。人脐带间充质干细胞联合褪黑素治疗后卵巢组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和P62蛋白表达显著升高，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著降低，与单一治疗组比较差异有显著性意义。由此可见，人脐带间充质干细胞联合褪黑素治疗可能是通过上调PI3K/AKT/mTOR信号通路，抑制卵巢颗粒细胞自噬来改善化疗药物引起的卵巢功能损伤。
综上，人脐带间充质干细胞联合褪黑素对早发性卵巢功能不全大鼠卵巢功能具有修复作用，其机制可能是通过上调PI3K/AKT/mTOR信号通路，抑制卵巢颗粒细胞自噬来改善化疗药物引起的卵巢功能损伤。由于早发性卵巢功能不全病因复杂多样，今后仍需开展更多的基础研究，以进一步验证人脐带间充质干细胞联合褪黑素治疗早发性卵巢功能不全的作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人脐带间充质干细胞联合褪黑素治疗化疗致早发性卵巢功能不全的作用及机制

Therapeutic effects and mechanism of human umbilical cord mesenchymal stem cells combined with melatonin on premature ovarian insufficiency induced by chemotherapy

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