2.1   确定鹿角多肽和地塞米松干预 MC3T3-E1 14细胞的浓度   通过 CCK-8 实验探究鹿角多肽和地塞米松干预 MC3T3-E1 14细胞的适宜浓度：①鹿角多肽浓度筛选结果显示：大于 5 mg/mL的鹿角多肽干预 MC3T3-E1 14细胞，24 h后细胞形态及密度与对照组(0 mg/mL鹿角多肽)相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1A。②地塞米松浓度筛选结果显示：大于800 μmol/L的地塞米松干预MC3T3-E1 14细胞后，可以明显看出细胞增殖被抑制，与对照组(0 μmol/L地塞米松)相比差异有显著性意义(P < 0.01)，见图1B。因此，后续实验选择以 800 μmol/L浓度的地塞米松干预MC3T3-E1 14细胞并处理 24 h。
2.2   不同浓度梯度鹿角多肽对地塞米松(800 μmol/L)干预后 MC3T3-E1 14细胞的影响   与空白对照组相比，经地塞米松单独处理的地塞米松组细胞活性显著被抑制，随着加入鹿角多肽的质量浓度增加，细胞存活率随之上升，10 mg/mL的鹿角多肽增殖率最为明显，且与空白对照组相比差异有显著性意义(P < 0.01)；20 mg/mL的鹿角多肽较10 mg/mL的鹿角多肽相比增殖率有所下降。经此筛选，确定后续实验选择以鹿角多肽(10 mg/mL)和地塞米松
(800 μmol/L)干预MC3T3-E1 14细胞处理24 h。见图2。
2.3   鹿角多肽和地塞米松干预 MC3T3-E1 14细胞后对铁死亡相关指标的影响   为探究鹿角多肽对地塞米松处理过的细胞相关铁死亡的影响，对铁死亡相关指标进行了验证。与空白对照组相比，地塞米松组的谷胱甘肽含量及超氧化物歧化酶活性显著降低，地塞米松+鹿角多肽组的谷胱甘肽含量及超氧化物歧化酶活性相比地塞米松组有所升高；与空白对照组相比，地塞米松组的丙二醛、细胞铁、脂质过氧化物含量显著增加，地塞米松+鹿角多肽组的丙二醛、细胞铁、脂质过氧化物含量相比地塞米松组明显降低。见图3。
2.4   鹿角多肽和地塞米松干预 MC3T3-E1 14细胞后对活性氧的影响   倒置荧光显微镜结果显示，与空白对照组相比，地塞米松组细胞内的活性氧增加，促进了细胞铁死亡；地塞米松+鹿角多肽组细胞内的活性氧有所降低，细胞铁死亡有所减少，见图4。
2.5   Western blot 结果   鹿角多肽可以增加细胞内铁死亡标记物GPX4的表达水平，Western blot结果显示，鹿角多肽可以逆转GPX4和SLC7A11的下降，提示鹿角多肽可能通过SLC7A11/GPX4通路发挥对激素性股骨头坏死的治疗作用，见图5。

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激素性股骨头坏死的特征为骨微结构恶化[1-2]、骨总体积减少、骨小梁稀疏、骨脆性增加、骨细胞大量坏死。近年来，随着激素类药物的广泛使用，患有激素性股骨头坏死人群的数量逐渐增加[3-4] ，终末期股骨头坏死的患者通常采用全髋关节置换进行治疗[5]。然而，由于假体寿命有限，一些患者需要进行多次翻修手术[6]，给个人和社会带来了巨大的经济负担，因此，亟需有效的治疗策略改善患者的生活质量。
糖皮质激素是激素性股骨头坏死最常见的诱因[7]，可损伤股骨头血管、抑制成骨活性[8]。骨形成和骨吸收之间的动态平衡共同维持了骨骼的健康稳态[9]，正常的骨形成依赖于成骨细胞的活性，但高剂量的糖皮质激素可以严重抑制这一过程[10-11]。此外，糖皮质激素还能抑制成骨基因表达[12-13]，含有糖皮质激素类的药物通过调控 P53/溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)通路诱导成骨细胞的铁死亡[14]。铁死亡是一种脂质过氧化引起的铁依赖性氧化性细胞死亡[15]。GPX4、谷胱甘肽和胱氨酸/谷氨酸逆向转运系统，包括SLC7A11，在细胞中发挥着重要的抗氧化作用，可以挽救细胞免于铁死亡[16-17]。因此研发靶向激活 SLC7A11/GPX4 轴的相关药物是治疗激素性股骨头坏死的有效策略。
鹿角是鹿每年周期性生长和脱落的独特器官，鹿角再生的生物学特性为股骨头坏死的治疗提供了新思路 [18-20]。鹿角中丰富的氨基酸、多肽、胶原蛋白和微量元素不仅为骨细胞提供营养物质，还可通过优化其微环境，促进骨细胞的生存和功能[21-22]。鹿角多肽是鹿角的重要活性成分[23]，具有抗肿瘤、抗疲劳、抑菌、降血糖、抗氧化等多种生物活性[24-25]。课题组前期研究发现鹿角多肽既可以明显增加骨髓间充质干细胞生长周期中的增殖指数[26]，又对成骨细胞具有良好的促增殖、促分化作用[27]。
然而，鹿角多肽对成骨细胞铁死亡的调控机制尚未明确，此次研究旨在评估鹿角多肽对地塞米松(一种糖皮质激素)诱导的成骨细胞铁死亡的影响，并探索鹿角多肽是否通过 SLC7A11/GPX4 途径抑制地塞米松诱导的铁死亡，发挥保护成骨细胞的作用，为抗股骨头坏死药物的研发提供科学依据和参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   细胞学体外实验，组间比较使用单因素方差分析，两两比较使用 LSD-t 检验。
1.2   时间及地点   实验于2023年8月至2024年4月在山东省中医药研究院完成。
1.3   材料
1.3.1   细胞与试剂   小鼠颅顶前成骨细胞 MC3T3-E1 Subclone(Pricella，中国)、胎牛血清 (ExCell Bio，中国)、α-MEM基础培养基(Gibco，美国)、PBS(Solarbio，中国)、胰蛋白酶(Solarbio，中国)、青-链霉素(Solarbio，中国)、RIPA 裂解液(Solarbio，中国)、PMSF(Solarbio，中国)、磷酸酶抑制剂(Solarbio，中国)、5×蛋白上样缓冲液(NCM Biotech，中国)、通用型抗体稀释液(NCM Biotech，中国)、BCA试剂盒(雅酶，中国)、CCK-8 试剂盒(Beyotime，中国)、地塞米松(Solarbio，中国) ECL发光液(Merck，中国)；PVDF膜(Millipore，美国)；SLC7A11一抗(Abcam，美国)、GPX4一抗(Proteintech，美国)；β-Tubulin 一抗(Affinity，中国)；山羊抗兔 lgG 二抗(中杉金桥，中国)、山羊抗鼠 lgG 二抗(中杉金桥，中国)、谷胱甘肽试剂盒(Solarbio，中国)、超氧化物歧化酶试剂盒(Solarbio，中国)、铁含量试剂盒(Solarbio，中国)、丙二醛 试剂盒(Solarbio，中国)、脂质过氧化物试剂盒(Solarbio，中国)、细胞活性氧检测试剂盒(Beyotime，中国)。
1.3.2   主要仪器   倒置生物显微镜(Nikon Corporation，日本)；全自动化学发光图像分析仪(Tanon，中国)；高速冷冻离心机(Beckman Coulter，美国)；多功能酶标仪(Bio-Rad Laboratories，美国)；自动细胞记数仪(Countstar，中国)、生物安全柜(西班泰克净化设备苏州有限公司，中国)、二氧化碳培养箱(上海力申利学仪器有限公司，中国)、数显恒温水浴锅(上海力辰邦西仪器科技有限公司，中国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   鹿角多肽的提取   鹿角片购于山东建联盛嘉中药有限公司，按2020版《中国药典》方法制备成鹿角胶[28]：称取鹿角片 500 g 碾碎后置于圆底烧瓶中，加入5倍量蒸馏水浸泡1 h，每 3 h取煎煮液1次，补充水量再煎，共煎煮2次，合并2次煎煮液，使用旋转蒸发仪浓缩至浓稠状后停止浓缩，冷却至室温即得鹿角胶。鹿角胶预冷后置于冷冻干燥机中 48 h，得鹿角胶冻干粉，脱水成粉末状，过120目筛，称质量，-20 ℃保存备用。
称取适量的鹿角胶粉末，根据课题组前期研究的方法[29]，酶用量1.8%，底物浓度 0.08 mg/mL，温度 40 ℃，pH 4.5酶解7 h，得酶解上清液，-20 ℃过夜，后置于冷冻干燥机中48 h，得鹿角胶酶解后的冻干粉，过120目筛，称质量，-20 ℃保存备用。
1.4.2   细胞培养   成骨细胞(MC3T3-E1 Subclone)是体外研究骨细胞的良好模型。将成骨细胞MC3T3-E1 14置于含体积分数10%胎牛血清、1%双抗的α-MEM培养基中，放入37 ℃、体积分数5%的CO2细胞培养箱内培养，每 3 d 更换1次细胞培养基。待细胞融合至80%左右时传代，取对数生长期细胞用于后续实验。



1.4.3   鹿角多肽干预 MC3T3-E1 14细胞最佳浓度的筛选  取第3代细胞消化后，调整细胞浓度为5×107 L-1，于 96 孔培养板中每孔加入100 μL细胞悬液，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。细胞贴壁后，弃去上清液，设置对照组、地塞米松组、鹿角多肽组；地塞米松的浓度梯度为0，100，200，400，800，1 000 μmol/L；鹿角多肽组的浓度梯度为0，1.25，2.5，5，10，20 mg/mL。24 h后，更换无血清培养基，每孔加入 10 μL CCK-8 试剂，于孵箱 37 ℃反应 55 min。于酶标仪波长 450 nm下检测，计算不同浓度鹿角多肽及地塞米松对MC3T3-E1 14细胞增殖的影响。
1.4.4   不同浓度梯度鹿角多肽对地塞米松(800 μmol/L)干预 MC3T3-E1 14细胞后的影响   取处于对数生长期的MC3T3-E1 14细胞，弃去完全培养基，PBS清洗2次，胰蛋白酶消化，调整细胞浓度为5×107 L-1，于96孔培养板中每孔加入100 μL细胞悬液，细胞贴壁后弃去上清液，并分组：空白对照组、地塞米松组(800 μmol/L)、地塞米松+鹿角多肽组；地塞米松+鹿角多肽组中鹿角多肽的浓度梯度为0，1.25，2.5，5，10，20 mg/mL。24 h后，更换无血清培养基，每孔加入10 μL CCK8 试剂，于孵箱 37 ℃反应 55 min。于酶标仪波长 450 nm下检测，计算不同浓度鹿角多肽对地塞米松(800 μmol/L)干预对MC3T3-E1 14细胞增殖的影响。
1.4.5   还原型谷胱甘肽含量检测   按照实验设计进行分组，待细胞生长至对数期时，以每孔1.5×105个细胞接种于6孔板中，分为3组，每组2个复孔，分为空白对照组、地塞米松组(800 μmol/L)、地塞米松组(800 μmol/L)+鹿角多肽(10 mg/mL)组，培养 24 h后，胰蛋白酶消化后离心，用PBS洗3遍，依次加入谷胱甘肽不同测量液处理，混匀后常温静置 2 min 后，于412 nm处测吸光度值。
1.4.6   丙二醛含量检测   按照实验设计进行分组，操作同1.4.5，收集细胞到离心管内，离心后弃上清；加入 200 μL提取液，超声波破碎细胞(功率 200 W，超声3 s，间隔 10 s，重复 30 次)；8 000×g 4 ℃条件下离心 10 min，取上清，置冰上待测。取1.5 mL螺旋盖聚丙烯微量离心管依次加入丙二醛配置好的测量液，取标准品、样品分别与其充分混匀，混合液在 100 ℃金属浴中保温 60 min后，置于冰浴中冷却，10 000×g，常温，离心 10 min。吸取200 μL上清液于96 孔板中，测定各样本在532 nm和600 nm处的吸光度值。
1.4.7   超氧化物歧化酶活性检测   按照实验设计进行分组，操作同1.4.5，收集细胞到离心管内，离心后弃上清；加入 200 μL 提取液，超声波破碎细胞(功率 200 W，超声 3 s，间隔 10 s，重复 30 次)；8 000×g 4 ℃离心 10 min，取上清，置冰上待测。取1.5 mL EP管，依次加入样本20 μL、超氧化物歧化酶混合测量液110 μL、蒸馏水 70 μL、充分混匀，37 ℃反应 30 min 后，560 nm 处测定各管吸光值。
1.4.8   细胞铁含量检测   按照实验设计进行分组，操作同1.4.5，收集细胞到离心管内，离心后弃上清；加入200 μL提取液，冰浴超声波破碎细胞(功率200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次)，于4 ℃，8 000×g离心10 min，取上清待测。在1.5 mL EP管中，依次加样本 20 μL、混合好的铁含量测量液180 μL并充分混匀，25 ℃ 静置显色10 min，于96孔板中测定510 nm处吸光值。
1.4.9   脂质过氧化物含量检测   按照实验设计进行分组，操作同1.4.5，收集细胞到离心管内，离心后弃上清；加入200 μL提取液，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，总时间 3 min)，8 000×g 4 ℃离心 10 min，取上清置冰上待测。取 1.5 mL EP管，依次加入样本 120 μL以及脂质过氧化物混合测量液180 μL；将混合液在 100 ℃水浴 60 min后，置于冰浴中冷却，8 000×g，常温，离心 10 min。吸取 200 μL上清液于 96 孔板中，测定各样本在 532 nm和 600 nm处的吸光度。
1.4.10   活性氧检测方法   按照实验设计进行分组，操作同1.4.5，按照 1∶1 000 用无血清培养液稀释 DCFH-DA，使终浓度为10 μmol/L。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的 DCFH-DA。37 ℃细胞培养箱内孵育 20 min。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，后用倒置荧光显微镜直接观察。
1.4.11   Western blot检测方法   按照实验设计进行分组，操作同1.4.5，每孔加入200 μL RIPA 细胞裂解液(RIPA细胞裂解液∶PMSF=100∶1)，置于冰上裂解 20 min，使用细胞刮刀轻刮板壁收集裂解液，12 000 r/min离心10 min后取上清，使用 BCA 试剂盒测量总蛋白浓度。剩余上清中加入1/4体积的5×蛋白上样缓冲液，煮沸 10 min后备用。蛋白在10% SDS-PAGE 凝胶中以120 V电泳，随后以 350 mA转膜 2 h，脱脂奶粉封闭 1.5 h后孵育GPX4、SLC7A11、β-tubulin一抗(1∶1 000)4 ℃过夜。然后 TBST洗膜 3次，每次 5 min，接下来将转印膜放入相应的二抗(1∶5 000)中室温条件下孵育2 h。擦干转印膜后滴加 ECL 发光液进行曝光，对蛋白条带用Image J软件进行灰度值分析。
1.5   主要观察指标   待细胞用地塞米松和鹿角多肽处理24 h后，收集细胞通过CCK-8法和生化检测试剂盒检测成骨细胞增殖活性，以及谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、丙二醛、脂质过氧化物、细胞铁含量和活性氧等指标的变化，采用Western blot检测GPX4、SLC7A11蛋白的表达。
1.6   统计学分析   采用 GraphPad prism 统计分析软件进行数据统计分析，结果用x±s 表示。组间比较使用单因素方差分析，两两比较使用 LSD-t 检验，检验标准P < 0.05认为差异有显著性意义。使用 Image J软件进行 Western blot 图像分析，统计图由 GraphPad prism 软件制作。文章统计学方法已经经过山东中医药大学统计学专家审核。

类固醇诱导的股骨头坏死是一种由过度使用糖皮质激素引起的严重疾病，可损害股骨头血管、抑制成骨活性[30]，成骨细胞在成骨过程和预防骨坏死中起着关键作用[31]。此次研究使用800 μmol/L地塞米松来模拟体外股骨头坏死环境下的成骨细胞，发现糖皮质激素环境下极大地降低了MC3T3-E1细胞的活性和成骨潜力[32]。此外，铁死亡是一种新的细胞死亡模式，多篇研究文献指出，SLC7A11/GPX4 轴的抑制参与了铁死亡的过程[33-34]。梁学振等[35]通过数据库分析得到了234例激素性股骨头坏死中的铁死亡基因，并从中筛选得到了30个激素性股骨头坏死中铁死亡差异基因，证实铁死亡存在于激素性股骨头坏死发生发展的过程中。此次研究发现鹿角多肽通过上调 SLC7A11/GPX4 通路有效地减少地塞米松诱导的成骨细胞铁死亡，从而减轻股骨头坏死。 
鹿角多肽是从中药鹿角中提取的一种活性多肽，体外抗氧化活性良好[24-25]。由于高剂量糖皮质激素直接导致活性氧的产生以及脂质过氧化，GPX4和 SLC7A11降低会打破氧化还原系统的平衡，最终导致铁死亡[36]。然而，鹿角多肽在股骨头坏死的作用及机制尚不清楚。因而，此次研究利用体外细胞模型研究了鹿角多肽对糖皮质激素环境下成骨细胞的保护作用及机制。CCK-8结果表明鹿角多肽提高了糖皮质激素环境下 MC3T3-E1 细胞生存率，鹿角多肽对糖皮质激素环境下成骨细胞的保护作用是剂量依赖性的，在质量浓度为10 mg/mL时观察到的保护作用最大(P < 0.05)。之前的研究发现地塞米松对成骨细胞凋亡以及股骨头坏死铁死亡有着重要的作用[14，36]。此次研究结果表明，鹿角多肽促进了成骨细胞的增殖，此外，用糖皮质激素处理24 h可显著抑制成骨铁死亡相关蛋白的表达，而鹿角多肽以剂量依赖的方式上调SLC7A11/GPX4的表达(P < 0.05)。YE等[37]使用地塞米松处理了血管平滑肌细胞，发现地塞米松可显著增加细胞内的铁含量，导致活性氧水平升高，丙二醛和脂质过氧化物的积累也显著增加，以上变化均指向铁死亡的发生，该研究结论与此次研究一致；同时，地塞米松还降低了谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的水平。总之，这些结果表明，地塞米松可诱导成骨细胞铁死亡；鹿角多肽显著减少了细胞活性氧、丙二醛、细胞内铁含量水平和脂质过氧化生成，并恢复谷胱甘肽水平以及超氧化物歧化酶活性(P < 0.05)。
LIU等[33]已经证明了SLC7A11/GPX4 的失活、脂质过氧化和亚铁的积累，以及细胞内 谷胱甘肽的消耗促进了雷公藤甲素引起的铁死亡。为了验证鹿角多肽通过 SLC7A11/GPX4 通路调控地塞米松诱导的铁死亡，作者检测了体外细胞空白对照组、地塞米松组以及地塞米松+鹿角多肽组中SLC7A11和GPX4 蛋白的表达水平。另外的研究也证实Fer-1减轻了索拉非尼诱导的铁中毒事件，包括 SLC7A11和GPX4水平降低、丙二醛水平增加[38-39]。此次研究发现，地塞米松处理显著降低了 SLC7A11和GPX4 蛋白的表达，而鹿角多肽则显著提高了这两种蛋白的表达水平(P < 0.05)。然而，此次研究主要通过体外实验探讨地塞米松和鹿角多肽对成骨细胞的影响，无法全面反映体内情况，因此需要进一步进行体内实验以验证这些结果。此外，此次研究重点关注了SLC7A11/GPX4通路，而成骨细胞的铁死亡可能涉及多种信号通路和调控机制。下一步课题组将在动物模型中验证鹿角多肽对地塞米松诱导的成骨细胞铁死亡的抑制作用，评估其在体内的有效性和安全性，并且探索除SLC7A11/GPX4通路外，其他可能参与成骨细胞铁死亡的信号通路和分子机制，全面解析鹿角多肽的作用机制，推动其向临床应用转化。
综上所述，此次研究证明鹿角多肽可能通过上调 SLC7A11/GPX4 通路抑制地塞米松诱导成骨细胞铁死亡，为股骨头坏死的治疗提供了新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

这篇文章揭示了鹿角多肽在保护成骨细胞免受地塞米松诱导铁死亡中的新机制，为骨质疾病的治疗策略带来了新思路。通过实验研究，系统展示了鹿角多肽通过调控SLC7A11/GPX4轴抑制地塞米松诱导的成骨细胞铁死亡，这是对鹿角多肽生物活性的创新性探索，也是对SLC7A11/GPX4轴在铁死亡调控中作用的深入研究。#br# 鹿角多肽作为一种天然产物，来源于鹿角，鹿角是自然界中唯一一种能够再生的骨化组织，因其显著的骨保护作用广受关注。研究发现，鹿角多肽能对抗地塞米松造成的副作用，如骨质疏松和骨坏死，为临床中地塞米松的更安全应用提供了辅助治疗路径，也为基于SLC7A11和GPX4靶点的新型抗铁死亡疗法开发奠定了实验基础。#br# 其次，这项工作探索从天然动物药材中寻找治疗骨质疾病，采用鹿角中的多肽成分恢复和增强成骨细胞的功能，为未来减少激素治疗相关骨性疾病提供了新思路，应用前景广阔。该研究可为解决实际医疗问题提供思路，对骨性疾病研究提供了新方案。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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