piR-7472影响电压调控钾离子通道促进小鼠成骨细胞分化的机制

doi:10.12307/2025.610

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (14): 2868-2874.doi: 10.12307/2025.610

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piR-7472影响电压调控钾离子通道促进小鼠成骨细胞分化的机制

隆宇斌1，王湘斌1，樊基耿2，杨厚志2，杨洋3，李勇1

邵阳市中心医院，1脊柱外科，3肿瘤内科，湖南省邵阳市 422000；2天津医科大学研究生院，天津市 300070

收稿日期:2024-04-30 接受日期:2024-07-06 出版日期:2025-05-18 发布日期:2024-09-27
通讯作者: 李勇，硕士，副主任医师，邵阳市中心医院脊柱外科，湖南省邵阳市 422000
作者简介:隆宇斌，男，1989年生，湖南省邵阳市人，汉族，天津医科大学在读博士，主治医师，主要从事骨质疏松的基因靶向治疗与椎间盘退变的分子机制研究。
基金资助:
湖南省自然科学基金(2022JJ50024)，项目负责人：李勇；湖南省自然科学基金(2024JJ7474)，项目负责人：隆宇斌

piR-7472 affects the mechanism by which voltage-regulated potassium channels promote osteogenic differentiation in mice

Long Yubin1, Wang Xiangbin1, Fan Jigeng2, Yang Houzhi2, Yang Yang3, Li Yong1

1Department of Spinal Surgery, 3Department of Oncology, The Central Hospital of Shaoyang, Shaoyang 422000, Hunan Province, China; 2Graduate School of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China

Received:2024-04-30 Accepted:2024-07-06 Online:2025-05-18 Published:2024-09-27
Contact: Li Yong, MS, Associate chief physician, Department of Spinal Surgery, The Central Hospital of Shaoyang, Shaoyang 422000, Hunan Province, China
About author:Long Yubin, MD candidate, Attending physician, Department of Spinal Surgery, The Central Hospital of Shaoyang, Shaoyang 422000, Hunan Province, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Hunan Province, Nos. 2022JJ50024 (to LY) and 2024JJ7474 (to LYB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨质疏松症：是一种由多种原因引发的全身性骨病，主要特征是骨密度和骨质量下降，骨微结构损害，使骨脆性增加，形成易发生骨折的状态。骨质疏松症主要分为原发性和继发性，原发性又分为绝经后骨质疏松、老年性骨质疏松症和特发性骨质疏松。
PIWI相互作用RNA：简称为piRNA，是一类长度为24-32个核苷酸的小分子非编码RNA分子，主要与PIWI蛋白相互作用，形成PIWI-piRNA复合物，参与调控基因表达和维持基因组的稳定性。

摘要
背景：现有研究在PIWI相互作用RNA(piRNA)抗骨质疏松方面取得了重大进展，但piRNA发挥功能的具体靶点和相关机制仍有待探索。
目的：探讨piR-7472 对小鼠成骨细胞(MC3T3-E1细胞)分化的影响及下游机制。
方法：①12只C57/BL6J小鼠随机分为假手术组和卵巢切除组，每组6只，术后8周通过Micro-CT检测小鼠的骨量，RT-qPCR检测piR-7472的表达；②将MC3T3-E1细胞分为NC mimics组、piR-7472 mimics组、NC inhibitor组与piR-7472 inhibitor组，转染后成骨诱导7 d采用RT-qPCR检测piR-7472、骨桥蛋白、胶原蛋白Ⅰ、Runt相关转录因子2、钾电压门控通道调节因子亚家族 F 成员 1 mRNA的表达；成骨诱导7 d采用Western blot 检测骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2、钾电压门控通道调节因子亚家族 F 成员 1(KCNF1)蛋白表达；成骨诱导14 d通过碱性磷酸酶染色检测碱性磷酸酶的表达；成骨诱导21 d通过茜素红染色检测矿化结节数量；③双荧光素酶报告基因实验观察piR-7472是否能与钾电压门控通道调节因子亚家族 F 成员1相结合。
结果与结论：①与假手术组相比，卵巢切除组小鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量明显下降，骨小梁分离度明显升高，并且骨组织中piR-7472 mRNA表达明显下调；②与NC组相比，piR-7472 mimics组骨桥蛋白、胶原蛋白Ⅰ、Runt相关转录因子2的mRNA表达明显升高，骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2的蛋白表达明显升高，矿化沉积与碱性磷酸酶表达增多；与NC inhibitor组相比，piR-7472 inhibitor组骨桥蛋白、胶原蛋白Ⅰ、Runt相关转录因子2的mRNA表达明显降低，骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2的蛋白表达明显降低，矿化沉积与碱性磷酸酶表达降低；③通过miRanda数据库预测发现piR-7472 能与KCNF1相互作用；双荧光素酶报告基因实验发现piR-7472 mimcis能与钾电压门控通道调节因子亚家族 F 成员 1结合并促进其表达。结果表明：piR-7472能够促进成骨前体细胞MC3T3-E1成骨分化，其发挥作用的机制可能是通过促进KCNF1表达实现的。

https://orcid.org/0009-0000-9380-5577(隆宇斌)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 成骨细胞MC3T3-E1, PIWI相互作用RNA, 成骨分化, 骨质疏松症, 电压调控的钾离子通道, KCNF1

Abstract: BACKGROUND: Existing studies have made significant progress in PIWI-interacting RNAs (piRNAs) against osteoporosis, but the specific targets and related mechanisms by which piRNAs exert their functions remain to be explored.
OBJECTIVE: To investigate the effects and downstream mechanisms of piR-7472 on the differentiation of mouse osteoblasts (MC3T3-E1 cells).
METHODS: (1) Twelve C57/BL6J mice were randomly divided into a sham-operated and an ovariectomized group, with six mice in each group. Changes in bone mass and the expression of piR-7472 were detected using Micro-CT and RT-qPCR, respectively, at 8 weeks after surgery. (2) MC3T3-E1 cells were divided into NC mimics group, piR-7472 mimics group, NC inhibitor group, and piR-7472 inhibitor group. The mRNA expression of piR-7472, osteopontin, type I collagen, Runt-related transcription factor 2, and potassium voltage-gated channel modifier subfamily F member 1 were detected by RT-qPCR after 7 days of osteogenic induction. The protein expression of osteopontin, Runt-related transcription factor 2, bone morphogenetic protein 2, and potassium voltage-gated channel modifier subfamily F member 1 (KCNF1) was detected using western blot assay. The expression of alkaline phosphatase was detected by alkaline phosphatase staining after 14 days of osteogenic induction, and the number of mineralized nodules was detected by alizarin red staining after 21 days of induction. Whether piR-7472 could bind to KCNF1 was observed by the dual luciferase reporter gene assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Bone mineral density, bone volume fraction, bone trabecular thickness, bone trabecular number were significantly decreased and bone trabecular separation was significantly increased in ovariectomized mice, and piR-7472 in bone tissue was significantly down-regulated in osteoporotic mice. (2) Compared with the NC group, the mRNA expression of osteopontin, type I collagen, and Runt-related transcription factor 2 were significantly increased, the protein expression of osteopontin, Runt-related transcription factor 2, and bone morphogenetic protein 2 were significantly elevated, and the levels of mineralized deposition and alkaline phosphatase were increased in the piR-7472 mimics group. Compared with the NC inhibitor group, the mRNA expression of osteopontin, type I collagen, and Runt-related transcription factor 2 was significantly downregulated, the protein expression of osteopontin, Runt-related transcription factor 2, and bone morphogenetic protein 2 were significantly decreased, and the levels of mineralized deposition and alkaline phosphatase were reduced in the piR-7472 inhibitor group. (3) piR-7472 was found to interact with the potassium voltage-gated channel modifier subfamily F member 1 as predicted by the miRanda database. The dual luciferase reporter gene assay revealed that piR-7472 mimics could bind to and promote the expression of KCNF1. To conclude, piR-7472 can promote osteogenic differentiation of osteogenic precursor cells MC3T3-E1, and its mechanism of action may be achieved by promoting the expression of KCNF1.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: MC3T3-E1 osteoblasts, PIWI-interacting RNA, osteogenic differentiation, osteoporosis, voltage-regulated potassium channel, KCNF1

中图分类号:

隆宇斌, 王湘斌, 樊基耿, 杨厚志, 杨洋, 李勇. piR-7472影响电压调控钾离子通道促进小鼠成骨细胞分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(14): 2868-2874.

Long Yubin, Wang Xiangbin, Fan Jigeng, Yang Houzhi, Yang Yang, Li Yong. piR-7472 affects the mechanism by which voltage-regulated potassium channels promote osteogenic differentiation in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(14): 2868-2874.

图/表（结果） 3

2.1 骨质疏松小鼠骨量下降及骨组织中piR-7472的表达下调 8周龄C57/BL6J小鼠实施卵巢切除后8周进行Micro-CT检测，与假手术组相比，卵巢切除组小鼠骨量明显下降(图 1A)，骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量明显下降，骨小梁分离度明显升高(图1B-F)，说明造模成功。RT-qPCR检测卵巢切除组小鼠骨组织中 piR-7472 的表达明显下降(图1G)。
2.2 piR-7472促进小鼠成骨细胞 MC3T3-E1成骨分化为了探究piR-7472对于成骨细胞成骨性分化的影响，对MC3T3-E1细胞进行转染，通过荧光素修饰piR-7472转染，发现100 pmol piR-7472转染48 h的转染效果最佳(图2A)。
转染后成骨诱导7 d检测成骨特异性基因表达，结果显示，与NC组相比，piR-7472 mimics能够促进骨桥蛋白、胶原蛋白Ⅰ、Runt相关转录因子2 mRNA表达(P < 0.05)；与NC inhibitor组相比，piR-7472 inhibitor 能够抑制骨桥蛋白、胶原蛋白Ⅰ、Runt相关转录因子2 mRNA表达(P < 0.05)(图2B-D)。
转染后成骨诱导7 d检测成骨分化特异性蛋白表达，结果显示，与 NC 组相比，转染piR-7472 mimics组骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2蛋白表达显著升高(P < 0.05)；与NC inhibitor组相比，piR-7472 inhibitor 组骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2 蛋白表达显著下降(P < 0.05)(图2E-H)，与mRNA表达表现出相同的趋势。
成骨诱导14 d碱性磷酸酶染色以及成骨诱导21 d茜素红染色结果显示，与 NC 组相比，piR-7472 mimics 组的橘红色沉积(矿化结节)与碱性磷酸酶(紫色)表达明显增多；与NC inhibitor组相比，piR-7472 inhibitor 组橘红色沉积(矿化结节)与碱性磷酸酶(紫色)表达明显减少(图2I-K)，说明piR-7472能够促进MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶的表达以及矿化结节形成从而促进成骨分化与矿化。
通过上述结果，发现piR-7472能够在成骨的早期和成熟阶段促进MC3T3-E1成骨分化和矿化。
2.3 piR-7472通过影响KCNF1促进成骨分化通过miRanda数据库分析显示，piR-7472与 KCNF1具有结合位点(图3A)。双荧光素酶报告基因实验提示piR-7472能够与KCNF1结合并促进KCNF1的表达(图3B)。piR-7472可能通过与KCNF1结合从而促进成骨细胞成骨分化。为了探究piR-7472是否能通过影响KCNF1的表达发挥其促进骨形成的功能。转染piR-7472后检测KCNF1的表达。与对照组相比，piR-7472能促进KCNF1的mRNA与蛋白表达(P < 0.05) (图3C-E)。上述结果表明，piR-7472可能是通过KCNF1发挥促进成骨细胞成骨分化的作用。

参考文献

[1] 《中国老年骨质疏松症诊疗指南(2023)》工作组,中国老年学和老年医学学会骨质疏松分会,中国医疗保健国际交流促进会骨质疏松病学分会,等.中国老年骨质疏松症诊疗指南(2023)[J].中华骨与关节外科杂志,2023,16(10):865-885.
[2] BAUTISTA LITARDO N, LÓPEZ GAVILANEZ E. First Ecuadorian consensus statement on the management of osteoporosis. Arch Osteoporos. 2023;18(1):106.
[3] LIU YY, DING YF, SUI HJ, et al. Pilose antler (Cervus elaphus Linnaeus) polysaccharide and polypeptide extract inhibits bone resorption in high turnover type osteoporosis by stimulating the MAKP and MMP-9 signaling pathways. J Ethnopharmacol. 2023;304:116052.
[4] HE X, WANG Y, LIU Z, et al. Osteoporosis treatment using stem cell-derived exosomes: a systematic review and meta-analysis of preclinical studies. Stem Cell Res Ther. 2023;14(1):72.
[5] LI N, CORNELISSEN D, SILVERMAN S, et al. An Updated Systematic Review of Cost-Effectiveness Analyses of Drugs for Osteoporosis. Pharmacoeconomics. 2021;39(2):181-209.
[6] GARCÍA-GARCÍA P, REYES R, ÉVORA C, et al. Osteoprotective effect of the marine alkaloid norzoanthamine on an osteoporosis model in ovariectomized rat. Biomed Pharmacother. 2022;147:112631.
[7] CHEN J, ZHONG K, QIN S, et al. Astragalin: a food-origin flavonoid with therapeutic effect for multiple diseases. Front Pharmacol. 2023; 14:1265960.
[8] HUANG X, WONG G. An old weapon with a new function: PIWI-interacting RNAs in neurodegenerative diseases. Transl Neurodegener. 2021;10(1):9.
[9] LEE EJ, BANERJEE S, ZHOU H, et al. Identification of piRNAs in the central nervous system. RNA. 2011;17(6):1090-1099.
[10] GALTON R, FEJES-TOTH K, BRONNER ME. Co-option of the piRNA pathway to regulate neural crest specification. Sci Adv. 2022;8(32): eabn1441.
[11] BRENNECKE J, ARAVIN AA, STARK A, et al. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. Cell. 2007;128(6):1089-1103.
[12] JONES BC, WOOD JG, CHANG C, et al. A somatic piRNA pathway in the Drosophila fat body ensures metabolic homeostasis and normal lifespan. Nat Commun. 2016;7:13856.
[13] KAMMINGA LM, LUTEIJN MJ, DEN BROEDER MJ, et al. Hen1 is required for oocyte development and piRNA stability in zebrafish. EMBO J. 2010;29(21):3688-3700.
[14] MOORE RS, KALETSKY R, MURPHY CT. Piwi/PRG-1 Argonaute and TGF-β Mediate Transgenerational Learned Pathogenic Avoidance. Cell. 2019;177(7):1827-1841.e12.
[15] GONG S, GACCIOLI F, DOPIERALA J, et al. The RNA landscape of the human placenta in health and disease. Nat Commun. 2021;12(1):2639.
[16] OZATA DM, GAINETDINOV I, ZOCH A, et al. PIWI-interacting RNAs: small RNAs with big functions. Nat Rev Genet. 2019;20(2):89-108.
[17] ISHIZU H, SIOMI H, SIOMI MC. Biology of PIWI-interacting RNAs: new insights into biogenesis and function inside and outside of germlines. Genes Dev. 2012;26(21):2361-2373.
[18] WANG X, RAMAT A, SIMONELIG M, et al. Emerging roles and functional mechanisms of PIWI-interacting RNAs. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023; 24(2):123-141.
[19] HAN H, FAN G, SONG S, et al. piRNA-30473 contributes to tumorigenesis and poor prognosis by regulating m6A RNA methylation in DLBCL. Blood. 2021;137(12):1603-1614.
[20] GAO XQ, ZHANG YH, LIU F, et al. The piRNA CHAPIR regulates cardiac hypertrophy by controlling METTL3-dependent N6-methyladenosine methylation of Parp10 mRNA. Nat Cell Biol. 2020;22(11):1319-1331.
[21] NILSSON KH, HENNING P, EL SHAHAWY M, et al. Osteocyte- and late osteoblast-derived NOTUM reduces cortical bone mass in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2021;320(5):E967-E975.
[22] LEE WC, GUNTUR AR, LONG F, et al. Energy Metabolism of the Osteoblast: Implications for Osteoporosis. Endocr Rev. 2017;38(3):255-266.
[23] MAI D, ZHENG Y, GUO H, et al. Serum piRNA-54265 is a New Biomarker for early detection and clinical surveillance of Human Colorectal Cancer. Theranostics. 2020;10(19):8468-8478.
[24] HAN YN, LI Y, XIA SQ, et al. PIWI Proteins and PIWI-Interacting RNA: Emerging Roles in Cancer. Cell Physiol Biochem. 2017;44(1):1-20.
[25] PLEŠTILOVÁ L, NEIDHART M, RUSSO G, et al. Expression and Regulation of PIWIL-Proteins and PIWI-Interacting RNAs in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 2016;11(11):e0166920.
[26] LIU Y, DOU M, SONG X, et al. The emerging role of the piRNA/piwi complex in cancer. Mol Cancer. 2019;18(1):123.
[27] FENG J, YANG M, WEI Q, et al. Novel evidence for oncogenic piRNA-823 as a promising prognostic biomarker and a potential therapeutic target in colorectal cancer. J Cell Mol Med. 2020;24(16):9028-9040.
[28] DELLA BELLA E, MENZEL U, BASOLI V, et al. Differential Regulation of circRNA, miRNA, and piRNA during Early Osteogenic and Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stromal Cells. Cells. 2020; 9(2):398.
[29] MANNING D, SANTANA LF. Regulating voltage-gated ion channels with nanobodies. Nat Commun. 2022;13(1):7557.
[30] YANG JE, SONG MS, SHEN Y, et al. The Role of KV7.3 in Regulating Osteoblast Maturation and Mineralization. Int J Mol Sci. 2016; 17(3):407.
[31] WU J, ZHONG D, FU X, et al. Silencing of Ether à go-go 1 by shRNA inhibits osteosarcoma growth and cell cycle progression. Int J Mol Sci. 2014;15(4):5570-5581.
[32] WU X, ZHONG D, GAO Q, et al. MicroRNA-34a inhibits human osteosarcoma proliferation by downregulating ether à go-go 1 expression. Int J Med Sci. 2013;10(6):676-682.

引言

骨质疏松症是一种进行性的全身性骨骼疾病，以低骨量和骨组织微细结构破坏为特征，导致骨的脆性增加，容易诱发骨折[1]。骨质疏松性骨折是骨质疏松症的主要并发症之一，发生后会严重影响患者的生活质量[2]。长期使用药物治疗骨质疏松症有胃肠道反应、静脉血栓和肾脏毒性等严重不良反应[3-4]，目前尚难以满足临床需要。同时，随着科技的发展，人们对于骨质疏松症发病过程中的分子机制有了更加清晰的认识，基于骨质疏松症发病机制的靶向基因层面的疗法越来越受到人们的关注[5]。小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞是研究成骨细胞增殖和分化最常用的细胞模型[6-7]。
PIWI相互作用RNA(PIWI-interacting RNA，piRNA)是一类长度为24-32 nt 的非编码小RNA，广泛存在于哺乳动物[8]、海兔[9]、果蝇[10-11]、斑马鱼[12]、线虫等生物体内[13]，调控转座子和基因表达[14]。piRNA与miRNA不同的是：piRNA是单链，其前体来源于piRNA簇；piRNA的长度与miRNA不同；piRNA通过特殊的乒乓循环放大信号；piRNA不仅可以直接剪切mRNA，而且可以通过招募甲基化酶诱导组蛋白修饰和DNA甲基化来沉默mRNA转录[15-17]。piRNA不仅存在于生殖细胞中，也存在其他体细胞中[18]。体细胞中的piRNA具有组织特异性并且在长度上比生殖细胞中的piRNA更短[9]。piRNA参与肿瘤的形成，例如piRNA-30473参与弥漫性大B细胞淋巴癌的形成[19]；piRNA调控心脏功能，例如piRNA CHAPIR通过影响Parp10基因的转录水平来调控心肌肥大[20]。
成骨细胞是促进骨形成和矿化的关键细胞，在骨重建中发挥重要作用[21]。骨质疏松症患者最基本的病理生理变化是成骨细胞的增殖和分化减少[22]，因此，促进成骨细胞的增殖和分化是预防和治疗骨质疏松症的关键。尽管现有研究在探索piRNA抗骨质疏松方面取得了重大进展，但piRNA发挥功能的具体靶点和相关机制在很大程度上仍然是未知的。该研究探讨piR-7472的抗骨质疏松功能，证明piR-7472可以促进成骨细胞的分化与矿化，通过miRanda数据库预测结合位点发现piR-7472能够与钾电压门控通道调节因子亚家族F成员1(potassium voltage-gated channel modifier subfamily F member 1，KCNF1)结合，推测piR-7472促进成骨细胞分化的机制可能与KCNF1相互作用有关。这项研究为piRNA的应用提供了新的方向，并发现了新的骨质疏松的潜在治疗靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验研究，组间比较采用t检验和单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年12月至2023年12月在南开大学医学国际协同创新中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 8周龄雌性C57/BL6J小鼠12只，体质量18-20 g，购买自斯倍福公司，机构许可证号： SCXK (京)2019-0010，饲养于中国医学科学院放射医学研究所(SPF级饲养环境)。
实验方案经中国医学科学院放射医学研究所动物实验伦理委员会批准，审批号为IRM-DWLL-2023248。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 主要材料与仪器 MC3T3-E1小鼠胚胎成骨细胞前体细胞系购自普诺赛公司；α-MEM培养基、青霉素-链霉素溶液购自HyClone公司；胎牛血清购自重庆博培生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、Western blot凝胶试剂盒均购自碧云天公司；抗体均购自武汉Proteintech科技有限公司，包括β-actin抗体、骨桥蛋白抗体、Runt相关转录因子2抗体、骨形态发生蛋白2抗体、KNCF1抗体；引物设计由上海生工公司完成，RT-qPCR与反转录试剂盒、双荧光素酶报告基因试剂盒均购自全式金公司；质粒与RNA购自汉恒生物公司。
1.4 实验方法
1.4.1 小鼠双侧卵巢切除模型 12只C57/BL6J小鼠随机分成2组：假手术组和卵巢切除组，每组6只。采用3%戊巴比妥(50 mg/kg)经腹腔注射进行麻醉，麻醉成功后，小鼠采用俯卧位体位，腰背部区域剔除毛发暴露皮肤，严格消毒后，铺无菌洞巾。卵巢切除组：在肋弓下离背部中线左右各1 cm处，分别作一纵行长约0.5 cm的皮肤切口，钝性分离皮下，剪开肌肉层，见一粉红色桑葚样卵巢被周围脂肪组织包绕，采用缝线结扎子宫角上部和下部的输卵管后，切除卵巢及其周围脂肪组织，缝合肌肉层，再次消毒皮肤后，缝合皮肤。假手术组：方法同卵巢切除组，但仅切除卵巢周围脂肪组织。术后连续3 d肌肉注射青霉素(1.5 mg/kg)以防止感染。术后8周通过Micro-CT及相应配套软件CTan检测骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁分离度；然后取小鼠双侧股骨，通过RT-qPCR检测骨组织中piR-7472的表达。
1.4.2 细胞培养和分组将购买的MC3T3-E1细胞在含体积分数10%胎牛血清和抗生素(1×102 U/L青霉素和100 mg/L链霉素)的α-MEM培养基中培养(T25培养瓶)。将培养至第4代的MC3T3-E1细胞随机分成4组，分别为NC组、NC inhibitor组、piR-7472 mimics组、piR-7472 inhibitor组。
1.4.3 细胞转染将MC3T3-E1细胞由培养瓶转移到6孔板中培养，每孔细胞数约为5×105个，当细胞融合度达到70%-80%时进行转染处理。首先将piR-7472添加荧光素修饰后(75 pmol和100 pmol)转染24 h与48 h运用荧光显微镜观察，选择转染效率更高的浓度进行后续功能实验。取1.5 mL离心管，每个离心管内均加入100 µL无血清α-MEM培养基，轻轻加入1 µL Lipofectamine 2000。另取新的1.5 mL离心管，每个离心管内均加入100 µL无血清α-MEM培养基，轻轻加入相应的1 µg质粒(piR-7472 mimics/piR-7472inhibitor)。室温静置5 min后，将2个离心管中的液体用移液枪吹匀混合，室温静置20 min，吸除培养基，PBS润洗3遍，每孔加入800 µL无血清α-MEM培养基，然后将上述转染试剂与质粒混合物逐滴加入6孔板中，轻摇混匀，置于37 ℃ CO2培养箱中培养6 h，弃去转染液，PBS润洗3次，加入新鲜配置的含体积分数10%胎牛血清和抗生素(1×102 U/L青霉素和100 mg/L链霉素)的α-MEM培养基继续培养48 h。
1.4.4 成骨诱导各组MC3T3-E1细胞融合度达到80%-90%时更换成骨诱导培养基(含10-8 mol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸盐的α-MEM培养基)，每3 d换液1次，在37 ℃、含体积分数5% CO2的饱和湿度培养箱中培养7 d后进行RT-qPCR与Western blot检测，培养14 d后进行碱性磷酸酶染色，培养21 d后进行茜素红染色。
1.4.5 碱性磷酸酶染色成骨诱导分化14 d，40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min，NCB/NBT试剂盒室温避光染色30 min，光学显微镜观察。
1.4.6 茜素红染色成骨诱导分化21 d，40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min，35 mmol/L茜素红S(pH4.7)室温染色10 min，光学显微镜观察。

1.4.7 实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR) 成骨诱导分化7 d，弃去培养液，用RNA提取试剂盒提取总RNA。每组取1 μg总RNA，分别加入反转录试剂盒的反应体系，在反转录仪中进行反转录生成cDNA，RT-qPCR测定骨桥蛋白、胶原蛋白Ⅰ、Runt相关转录因子2、KCNF1 mRNA相对表达量。PCR反应条件设置：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共进行45个循环。从PCR仪中导出Ct值，采用2-ΔΔCt法并以β-actin为内参计算上述指标的相对表达量。引物序列见表1。

1.4.8 Western blot 成骨诱导分化7 d，用裂解缓冲液(RIPA∶PMSF=1 000∶1)裂解细胞，然后置冰上振荡30 min，4 ℃、14 000×g离心30 min，取上清液进行蛋白质浓度测定。通过10% SDS凝胶分离等量的蛋白质，转移至PVDF膜，10%脱脂奶粉封闭2 h，分别用TBST稀释β-actin、骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2、KCNF1一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，然后与HRP标记对应的二抗(1∶5 000)孵育1 h，ECL化学发光系统显色，使用Image J软件分析，结果用目的蛋白表达量与内参蛋白表达量的比值表示。
1.4.9 双荧光素酶报告基因检测合成包含有结合位点上下游300个碱基的质粒，命名为KCNF1-WT/MUT并亚克隆到 psiCHECK-2(Hanbio 生物技术，上海，中国)载体中。将KCNF1-WT/MUT与NC/piR-7472共转染到HEK-293细胞中，培养1 d后裂解细胞：弃培养基，PBS洗3遍，每孔加入 500 µL 1xCell Lysis Buffer，室温静置 10 min，以细胞刮收集细胞，转移至 1.5 mL离心管中，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，吸取上层液体20 µL至不透光的96孔板中，做好标记。荧光检测：在光度计(GloMax multi detection system，Promega，USA)上测量荧光素酶活性。将每个样品的萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的荧光强度比率参照对照组进行归一化处理。NC转染的细胞设置为阴性对照。
1.5 主要观察指标 ①RT-qPCR检测卵巢切除小鼠骨组织中piR-7472的表达；②转染后成骨诱导14 d通过碱性磷酸酶染色检测MC3T3-E1细胞中碱性磷酸酶的表达，成骨诱导21 d通过茜素红染色检测MC3T3-E1细胞中矿化结节数量；成骨诱导7 d通过RT-qPCR检测MC3T3-E1细胞中piR-7472、骨桥蛋白、胶原蛋白Ⅰ、Runt相关转录因子2、KCNF1 mRNA的表达；成骨诱导7 d通过Western blot 检测MC3T3-E1细胞中骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2、KCNF1蛋白表达；③通过双荧光素酶报告基因实验观察piR-7472是否能与KCNF1相结合。
1.6 统计学分析采用SPSS 17.0软件完成统计分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验和单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过天津医科大学生物统计学专家审核。

讨论

piRNA是一类长度为26-31个核苷酸的非编码RNA，首先在哺乳动物生殖细胞中发现[23]。piRNA 可以与Argonaute家族成员PIWIL蛋白形成复合物，以影响转座子沉默、基因组重排、精子发生、蛋白质调节、表观遗传调节和生殖干细胞维持[24]。人体含有4种 PIWIL蛋白(PIWIL1-4)，它们结合了大约 23 439 种已知的piRNA[25]。尽管人们普遍认为piRNA在种系发育中具有重要功能，但最近研究表明piRNA也在许多人体组织中以组织特异性方式表达，并在转录或转录后水平调节关键信号通路[26]。越来越多的证据表明，piRNA参与多种癌症的发生发展，也与中枢神经系统疾病和心脏再生密切相关[27]。此外，多种piRNA在人骨髓间充质基质细胞成骨分化过程中失调[28]，展示了piRNA在骨科相关疾病中的巨大治疗潜力。该研究构建原发性骨质疏松小鼠模型后发现piR-7472 在骨质疏松小鼠骨组织中显著下调，细胞实验表明piR-7472 能促进MC3T3-E1的成骨分化与矿化。
电压门控 K+(KV)通道家族是最大的K+通道家族。KV通道是一个多样化的膜蛋白群，有12个不同的亚家族(KV1-KV12)。众所周知，KV通道可调节兴奋细胞(如神经元和肌细胞)的电生理过程，如动作电位的产生和兴奋-收缩耦合[29]。在可兴奋细胞中，超极化后的KV通道激活会通过电压门控Ca2+通道阻滞降低[Ca2+]i水平，从而抑制神经传递和肌肉收缩。相反，在非可兴奋细胞中，超极化后KV通道激活会通过电压无关、储存的Ca2+渗透通道促进Ca2+流入，从而增加[Ca2+]i水平，促进细胞增殖、迁移和分化[29]。KV通道还通过细胞体积调节影响细胞周期的进展。YANG等[30]研究表明，用四乙基铵(一种KV通道抑制剂)处理可促进人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的基质矿化；用利诺哌啶对KV7.3进行药理阻断，可通过释放谷氨酸促进成骨细胞样MG-63和Saos-2细胞成骨分化过程中的基质矿化。此外，一些研究表明，KV10.1能促进MG-63和Saos-2细胞的增殖[31-32]。该研究发现piR-7472与电压调控的钾离子通道KCNF1结合并促进MC3T3-E1细胞内KCNF1的表达，通过双荧光素酶报告基因证实。piR-7472促进成骨分化与矿化的机制可能通过影响KCNF1表达实现的。
该研究并未在体内层面探讨piR-7472对于动物骨量的影响以及piR-7472对于骨质疏松模型的治疗效果。KCNF1对于成骨细胞具体电流与相应离子的影响未深入研究。后续实验应深入研究piR-7472在体内层面的具体作用机制。
综上，piR-7472能够促进成骨前体细胞MC3T3-E1成骨分化，其发挥作用的机制可能是通过促进KCNF1表达实现的。下一步还需要完善动物实验与检测电流改变实验等来验证这一作用，并最终将其应用于骨质疏松症的临床治疗。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

piR-7472影响电压调控钾离子通道促进小鼠成骨细胞分化的机制

piR-7472 affects the mechanism by which voltage-regulated potassium channels promote osteogenic differentiation in mice

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[1]	赵济宇, 王少伟. 叉头框转录因子O1信号通路与骨代谢[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(9): 1923-1930.
[2]	艾克帕尔·艾尔肯, 陈晓涛, 吾凡别克·巴合提. 成骨诱导人牙周膜干细胞来源外泌体促进炎症微环境下人牙周膜干细胞成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1388-1394.
[3]	章镇宇, 梁秋健, 杨军, 韦相宇, 蒋捷, 黄林科, 谭桢. 新橙皮苷治疗骨质疏松症的靶点及对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1437-1447.
[4]	孙玉婷, 吴家媛, 张剑. 影响牙髓干细胞成骨及成牙本质分化的相关物理因素及作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1531-1540.
[5]	黄小彬, 葛继荣, 李生强, 谢丽华, 黄景文, 何艳艳, 薛立鹏. 不同滋阴补肾法干预去势大鼠破骨通路的机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(6): 1214-1219.
[6]	钱琨, 李子卿, 孙水. 内质网应激与常见退行性骨骼疾病的发生与发展[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(6): 1285-1295.
[7]	葛霄, 赵状状, 郭舒瑜, 徐荣耀. HOXA10基因修饰骨髓间充质干细胞促进骨再生[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(36): 7701-7708.
[8]	严靖, 覃湫珺, 李芬, 周骏, 丁媛媛, 金春林. 骨质疏松症特异性生命质量量表的系统综述[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7649-7655.
[9]	柳承源, 过倩萍. Kartogenin对大鼠和兔源骨髓间充质干细胞成软骨与成骨分化的差异性影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7490-7498.
[10]	王荣强, 杨柳, 吴向坤, 尚立林. 骨质疏松症患者髋关节置换预后相关因素分析及Nomogram预测模型的构建[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(33): 7137-7142.
[11]	唐昊旭, 梁英杰, 李策, 丁鹏霖, 钱闵龙, 袁伶俐. 去铁胺减轻糖皮质激素抑制成骨分化的作用途径[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(32): 6821-6827.
[12]	卢秀丽, 许华珍, 陈玉兴, 姚楠, 胡子旋, 黄丹娥. 健骨方对破骨细胞-成骨细胞的偶联效应及作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(32): 6828-6835.
[13]	药文鑫, 王毅, 蔡林, 冯晓波. 植物源外泌体样纳米囊泡刺激成骨细胞、抑制破骨细胞并促进成骨[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6765-6771.
[14]	刘洵, 欧阳厚淦, 潘荣斌, 王姿, 杨芬, 田佳玄. 物理方法干预骨髓间充质干细胞分化最理想的参数[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6727-6732.
[15]	潘玉, 赵刃峰, 李兴平, 张成栋, 匙峰, 蒲超, 罗栩伟, 肖东琴. 铁过载诱导成骨前体细胞铁死亡并抑制成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(30): 6381-6390.