年龄对猕猴骨髓间充质干细胞体外分化和细胞因子水平的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.006

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (25): 3971-3976.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.006

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年龄对猕猴骨髓间充质干细胞体外分化和细胞因子水平的影响

陈裕浩^1，2，朱向情²，郭德镔³，林庆铿²，何志旭¹，潘兴华²

¹贵州医科大学，贵州省贵阳市 550025；²解放军成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心，细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室，云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省昆明市 650032；³解放军第三军医大学研究生管理大队，重庆市 400038

修回日期:2017-07-17 出版日期:2017-09-08 发布日期:2017-10-09
通讯作者: 潘兴华，博士后，主任医师，解放军成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心，细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室，云南省干细胞工程实验室，昆明市干细胞与再生医学重点实验室，云南省昆明市 650032
作者简介:陈裕浩，男，1991年生，福建省福州市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事骨髓间充质干细胞研究。
基金资助:
云南省创新团队(2015HC020)；昆明市重点项目(2015-1-S-00973)；全军实验动物专项(SYDW[2014]003)

Age effects on in vitro differentiation and cytokine levels of macaque bone marrow mesenchymal stem cells

Chen Yu-hao^{1, 2}, Zhu Xiang-qing², Guo De-bin³, Lin Qing-keng², He Zhi-xu¹, Pan Xing-hua²

¹Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China; ²Cell Biological Therapy Center of Kunming Genera Hospital of Chengdu Military Area of Chinese PLA, Cell Biological Medicine Integrated Engineering Laboratory of State and Regions in Yunnan Province, the Stem Cell Therapy Key Laboratory of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China; ³Brigade of Postgraduate Management, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

Revised:2017-07-17 Online:2017-09-08 Published:2017-10-09
Contact: Pan Xing-hua, M.D., Chief physician, Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Area of Chinese PLA, Cell Biological Medicine Integrated Engineering Laboratory of State and Regions in Yunnan Province, the Stem Cell Therapy Key Laboratory of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Chen Yu-hao, Studying for master’s degree, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China; Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Area of Chinese PLA, Cell Biological Medicine Integrated Engineering Laboratory of State and Regions in Yunnan Province, the Stem Cell Therapy Key Laboratory of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
the Innovation Team of Yunnan Province, No. 2015HC020; the Major Project of Kunming City, No. 2015-1-S-00973; the PLA Special Fund for Experimental Animals, No. SYDW[2014]003

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
蛋白芯片：是一种高通量的蛋白功能分析技术，其原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子固定在上面，利用这些生物分子的特性，捕获与之特异性结合的待测蛋白，经过洗涤纯化后，进行生化分析。蛋白芯片包括蛋白质微阵列、微孔板蛋白质芯片、三维凝胶块芯片等，实验采用的是蛋白质微阵列。
衰老相关β-半乳糖苷酶：是只能在衰老细胞中催化β-半乳糖苷水解为单糖的水解酶，β-半乳糖苷酶染色法就是通过在pH 6.0的条件下以半乳糖苷为底物，在衰老特异的β-半乳糖苷酶催化下会生成蓝绿色产物，观察衰老细胞的一种细胞化学分析方法。β-半乳糖苷酶的表达虽不是衰老所必需的，但因其检测方便，结果可靠，仍是最广泛使用的衰老细胞的生物标志物之一。

摘要
背景：间充质干细胞因其良好的生物学特性和广泛的应用前景而受到关注，但随着个体衰老和体外培养时间的增加，细胞逐渐呈现衰老的特征。非人灵长类动物与人具有相似的生物学特性，在动物模型和疾病治疗研究方面具有独特的优势。
目的：分析不同年龄段猕猴骨髓间充质干细胞的增殖和分化情况，探讨年龄对骨髓间充质干细胞的影响及可能机制。
方法：通过骨髓穿刺术采集3岁以内和20岁以上雄性猕猴的骨髓，分为幼年组和老年组，每组3只，分离骨髓间充质干细胞进行体外培养，观察其形态变化、增殖能力和分化能力，进行衰老相关的β-半乳糖苷酶染色，ELISA法和蛋白芯片检测细胞因子水平。
结果与结论：随着年龄的增长，老年猕猴骨髓间充质干细胞的增殖、分化能力显著降低，衰老细胞显著增加，细胞因子白细胞介素1b、白细胞介素4、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和血管内皮生长因子水平显著降低，肝素结合碱性成纤维细胞生长因子和胎盘生长因子水平显著升高，说明骨髓间充质干细胞的增殖、分化、旁分泌等功能会因衰老而逐渐受到损害。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2874-6053(陈裕浩)

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells attract extensive attention because of good biological characteristics and broad prospects, but the cells gradually show the characteristics of the aging with the increase of individual age or incubation time in vitro. Nonhuman primates have similar biological characteristics with human being, and have unique advantage in the animal model and disease treatment research.
OBJECTIVE: To analyze the difference in proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from macaques at different ages and to explore the effect of age on bone marrow mesenchymal stem cells and the possible mechanism.
METHODS: Bone marrow samples from male macaques aged < 3 years and over 20 years were collected through bone marrow puncture, and divided into young group and elder group, with three macaques in each group. Then, bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured in vitro, and the morphological changes, proliferation and differentiation ability were observed. Age-related beta-galactosidase staining was performed, and protein microarray and ELISA were used to detect cytokine levels.
RESULTS AND CONCLUSION: With age, the proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from the elder macaques were reduced significantly, and the number of senescent cells increased significantly; the levels of interleukin-1b, interleukin-4, interleukin-6, tumor necrosis factor α and vascular endothelial growth factor were elevated obviously, the levels of heparin-binding basic fibroblast growth factor and placental growth factor were reduced. These findings indicate that the body's aging lead to the reduction in the proliferation, differentiation and cytokine secretion of bone marrow mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Aging, Macaca, Cytokines, Tissue Engineering

陈裕浩，朱向情，郭德镔，林庆铿，何志旭，潘兴华. 年龄对猕猴骨髓间充质干细胞体外分化和细胞因子水平的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(25): 3971-3976.

Chen Yu-hao, Zhu Xiang-qing, Guo De-bin, Lin Qing-keng, He Zhi-xu, Pan Xing-hua. Age effects on in vitro differentiation and cytokine levels of macaque bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(25): 3971-3976.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞的培养及鉴定结果 采用贴壁培养法分离培养猕猴骨髓间充质干细胞，幼年组于三四天，老年组于5-7 d开始出现细胞贴壁生长，培养基中仍混有其他细胞，随着继续传代培养，贴壁细胞增多且形态均一，呈漩涡状生长(图1)。

流式细胞术检测幼年组和老年组猕猴骨髓间充质干细胞的表面抗原，幼年组骨髓间充质干细胞阳性标记物CD90、CD105、CD73的表达率分别为98.4%、97.6%、99.8%，阴性标记物CD45，HLA-DR的标记率为4.19%、0.225%(图2)，符合骨髓间充质干细胞的表型特征，幼年和老年猕猴骨髓间充质干细胞的表面抗原无显著差异。

2.2 骨髓间充质干细胞的增殖能力 将幼年和老年猕猴骨髓间充质干细胞接种于96孔板，连续培养7 d，绘制生长曲线，可观察到老年组猕猴骨髓间充质干细胞从第2天开始增殖能力明显低于幼年组(P < 0.05)，见图3。

2.3 骨髓间充质干细胞的诱导分化 用第3代骨髓间充质干细胞进行体外诱导分化实验(图4)，成骨诱导后经茜素红染色，出现红染的钙结节，幼年组诱导形成的钙结节较老年组更多而且致密。成软骨诱导后细胞缩聚，形态不规则，经阿利新蓝染色，出现蓝染的软骨细胞合成的蛋白多糖，幼年组诱导形成的软骨细胞聚集更加紧密，老年组较为松散。成脂诱导后经油红O染色，出现红染的脂滴，幼年组形成成片密集的脂滴，老年组分化形成的脂滴较少。

2.4 β-半乳糖苷酶的染色和计数 β-半乳糖苷酶染色阳性细胞的体积增大，核质比减少，胞浆呈蓝绿色，而阴性细胞不着色。幼年组骨髓间充质干细胞的染色阳性率为(1.33± 1.51)%，明显低于老年组(35.33±3.88)%，提示老年组骨髓间充质干细胞出现衰老的形态学改变，见图5。

2.5 细胞因子水平 幼年与老年猕猴骨髓上清中的白细胞介素1b、白细胞介素4、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α表达水平差异有显著性意义(P < 0.05)，幼年组细胞因子的表达水平高于老年组(表1)。幼年与老年猕猴骨髓上清中血管生成相关因子有3个存在显著差异，其中幼年组肝素结合碱性成纤维细胞生长因子和胎盘生长因子水平低于老年组，而幼年组血管内皮生长因子水平高于老年组(表2)。

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引言

材料方法

1.1 设计 平行对照细胞实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年2至4月在中国科学院昆明动物研究所和昆明总医院细胞生物治疗中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 由中国科学院昆明动物研究所提供健康雄性猕猴6只，其中幼年猕猴3只，平均年龄3岁，老年猕猴3只，平均年龄21岁，所有动物研究经依托单位实验动物伦理委员会批准，许可证号SYXK(军)2012-0039。

1.3.2 主要试剂及仪器 恒河猴骨髓间充质干细胞完全培养基(广州Cyagen公司)；间充质干细胞成脂、成骨和成软骨诱导分化培养基(广州Cyagen公司)；β-半乳糖苷酶染色试剂盒(上海碧云天公司)；抗体CD45、CD73(美国BD公司)；抗体CD90、CD105和HLA-DR(美国eBioscience公司)；CCK-8检测试剂盒(日本DOJINDO公司)；SW-CL-2F型百万层级层流超净工作台(苏州佳宝公司)；二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；酶标仪(美国Rayto公司)；FACScabilur流式细胞仪(美国BD公司)；倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)；ELISA试剂盒(广州RayBiotech公司)；人血管生成因子抗体芯片(英国Abcam公司)。

1.4 方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定 无菌条件下穿刺猕猴髂骨，抽取骨髓液约5 mL，注入等量抗凝剂中，再加入新鲜配制的红细胞裂解液，充分混匀。以 1 200 r/min离心5 min，倒掉上清，再用PBS洗涤，倒掉PBS，如还有较多红细胞，再重复上述操作步骤，然后加入间充质干细胞完全培养基小心吹吸，重悬细胞，将此时的细胞悬液接种至175 cm²的细胞培养瓶，放置在37 ℃，体积分数为5% CO₂的培养箱中进行培养。于接种5 d后换液，除去未贴壁的细胞，以后每3 d换液1次。在倒置相差显微镜下观察细胞的形态和生长状况。待贴壁细胞融合达80%-90%时，倒掉培养液，用含0.25%EDTA的胰酶在室温下消化，以1︰2的比例进行传代。

取原代培养的骨髓间充质干细胞，用含0.25%EDTA的胰酶消化2 min，加培养基中和胰酶，1 200 r/min离心5 min，倒掉上清，加入40 g/L多聚甲醛重悬固定，细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，加入荧光素(FITC)直标的抗人CD90、HLA-DR的单抗，荧光素(FITC)直标的抗非人灵长类CD45的单抗，荧光素(PE)直标的抗人CD105、CD73的单抗于4 ℃避光孵育45 min，通过流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。

1.4.2 骨髓间充质干细胞的增殖 取第3代骨髓间充质干细胞，以3×10³/孔的密度接种于96孔板，每个时间点设6个复孔，每孔加入100 μL间充质干细胞完全培养基，每3 d换液1次，检测当天更换新的培养基，每孔按总体积的10%加入CCK-8溶液，继续培养4 h，然后通过酶标仪读取吸光度值，连续检测7 d，观察细胞的增殖情况。

1.4.3 骨髓间充质干细胞的分化能力 取第3代骨髓间充质干细胞，通过恒河猴骨髓间充质干细胞诱导分化培养基进行成脂、成骨和成软骨诱导分化，观察分化能力的差异。

成脂诱导：恒河猴间充质干细胞基础培养基按说明书加入胎牛血清、青链霉素、谷氨酰胺、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、罗格列酮、地塞米松，制成恒河猴间充质干细胞诱导培养基。恒河猴骨髓间充质干细胞基础培养基按说明书加入胎牛血清、青链霉素、谷氨酰胺、胰岛素，制成恒河猴骨髓间充质干细胞维持培养基。

将骨髓间充质干细胞按2×10⁴/cm²的细胞密度接种在6孔板中，每孔加入2 mL完全培养基。将细胞置于37 ℃，体积分数为5%CO₂的培养箱中进行培养，每隔3 d换液，直至细胞完全融合。向6孔板中加入2 mL诱导培养基，诱导3 d后，吸走6孔板中的诱导培养基加入2 mL维持培养基，24 h后吸走维持培养基，换回诱导培养基，如此交替4次后继续用维持培养基培养5 d直到脂滴变得足够大、圆，期间每隔3 d换用新鲜的维持培养基。诱导分化结束后，用1×PBS冲洗2次，每孔加入2 mL体积分数4%的中性甲醛溶液，固定30 min，用1×PBS冲洗2次，每孔加入1 mL油红O染料工作液染色30 min，再用1×PBS冲洗3次。显微镜下观察细胞的分化情况。

成骨诱导：恒河猴间充质干细胞基础培养基按说明书加入胎牛血清、青链霉素、谷氨酰胺、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松，制成恒河猴间充质干细胞诱导培养基。

将骨髓间充质干细胞按2×10⁴/cm²的细胞密度接种在事先包被0.1%明胶的6孔板中，每孔加入2 mL完全培养基。将细胞置于37 ℃，体积分数为5%CO₂的培养箱中进行培养，每隔3 d换液，当细胞融合度达到约70%时，加入2 mL诱导培养基，每隔3 d换液，出现大量钙结节后，改为每隔2 d半量换液，诱导2周后，吸走6孔板中的分化培养基，用1×PBS冲洗2次，每孔加入2 mL体积分数4%的中性甲醛溶液，固定30 min，用1×PBS冲洗2次，每孔加入1 mL茜素红染液染色3-5 min，再用1×PBS冲洗3次。显微镜下观察细胞的分化情况。

成软骨诱导：恒河猴间充质干细胞基础培养基按说明书加入地塞米松、抗坏血酸、ITS细胞培养添加剂、丙酮酸钠、脯氨酸、转化生长因子β3，制成恒河猴间充质干细胞诱导培养基。

将骨髓间充质干细胞按2×10⁴/cm²的细胞密度接种6孔板中，每孔加入2 mL完全培养基，每3 d换1次液。当细胞融合度达到约70%时，更换诱导培养基，每隔2 d换液，诱导2周后，蒸馏水洗涤，阿利新蓝染色30 min，再用蒸馏水冲洗。显微镜下观察细胞的分化情况。

1.4.4 衰老相关β-半乳糖苷酶染色和细胞计数 取第3代幼年和老年猕猴的骨髓间充质干细胞接种到6孔板进行培养，当细胞融合70%-80%时，吸除细胞培养基，用PBS清洗1次，加入1 mL染色固定液固定15 min，吸除固定液，PBS清洗3次，然后加入1 mL染色工作液，在37 ℃，无CO₂的条件下孵育过夜。在倒置相差显微镜下观察，随机计数200个细胞，计算两组阳性细胞的百分率。

1.4.5 细胞因子检测 无菌条件下抽取猕猴的髂骨骨髓液，室温放置1 h后3 000 r/min离心15 min，分离上清，按照ELISA试剂盒说明书的各步骤进行操作，在450 nm波长下检测白细胞介素1b、白细胞介素4、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的吸光度值。

用血管生成蛋白抗体芯片，对血管生成素、血管生成素2、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝素结合碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、瘦素、血小板衍生生长因子、胎盘生长因子和血管内皮生长因子等10种目的蛋白进行定量分析，按照试剂盒说明书的各步骤进行操作，用生物芯片扫描仪GenePix 4000B进行检测，通过微阵列分析软件GenePix进行结果分析。

1.5 主要观察指标 骨髓间充质干细胞的形态、表面抗原、增殖能力、分化能力、衰老程度和分泌细胞因子的水平。

1.6 统计学分析 通过SPSS 21.0统计学软件进行分析，均数比较采用t 检验，数据以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

间充质干细胞越来越广泛地应用于实验研究和临床应用，深入了解间充质干细胞衰老的机制，探索延缓甚至逆转衰老的方法都是亟待解决的问题。非人灵长类动物与人类在解剖和生理学上极其相似，现已在神经系统疾病、心血管疾病、结核病等多种疾病动物模型得到了很好的应用^[6-8]，也在转基因等生命科学领域发挥重要作用^[9]。实验用猕猴的骨髓间充质干细胞作为研究对象，观察年龄给骨髓间充质干细胞的增殖能力、分化能力及细胞因子分泌水平所带来的影响。

通过对3岁以内和20岁以上猕猴骨髓间充质干细胞的实验研究发现，细胞的表面抗原没有出现明显改变，而细胞的形态会随着衰老变化，从生长紧密的长梭形变成宽松、扁平的细胞形态，其增殖速度也明显减缓，成骨、成软骨及成脂分化能力均出现明显减弱。在细胞因子的分泌能力上，幼年组猕猴骨髓上清中的白细胞介素1b、白细胞介素4、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和血管内皮生长因子水平显著高于老年组，老年组肝素结合碱性成纤维细胞生长因子和胎盘生长因子的分泌水平显著高于幼年组。肝素结合碱性成纤维细胞生长因子是表皮生长因子家族的一员，还是多种细胞的有丝分裂原，包括血管平滑肌细胞、成纤维细胞、角质细胞、乳腺和卵巢肿瘤细胞等^[10]，参与胚泡着床、伤口愈合、平滑肌增生、动脉粥样硬化和肿瘤生长等生理病理过程^[11]。胎盘生长因子是血管内皮生长因子家族的一员，能够在调节滋养细胞功能、血管生长、缺血性疾病的进程以及肿瘤的发生发展过程中发挥作用^[12]。有研究发现，胎盘生长因子在多种肿瘤组织中呈现高表达，促进肿瘤生长^[13-14]。Wei等^[15]发现，胎盘生长因子在癌组织中的含量与肿瘤的分化程度和预后呈负相关，与淋巴结的转移呈正相关。提示骨髓间充质干细胞的衰老可能增加患心血管疾病和肿瘤的风险。

细胞衰老是一个极其复杂的过程，有体内生化和细胞形态的改变，也涉及大量信号通路和效应机制的改变。衰老的间充质干细胞甚至能够通过分泌多种生长因子改变组织微环境，促进肿瘤的生长、转移和血管生成^[16]。目前的研究可通过多种途径延缓甚至逆转间充质干细胞的衰老。生殖细胞和胚胎干细胞可持续表达TERT基因，因而能够保持较高的端粒酶活性和无限增殖能力^[17-18]，有研究通过转染或过表达TERT来提高端粒酶的活性，从而延长间充质干细胞的寿命^[19-20]。通过激活微环境中的P13K/Akt信号通路来抑制活性氧的产生，防止氧化应激引起细胞衰老^[21]。也有研究认为氧化应激主要通过调控p53和p21基因来引起细胞衰老，细胞内产生的活性氧作用于p53，使得下游靶点p21抑制CDK/cyclin复合体的活性并下调pRb/E2F，从而使间充质干细胞的自我更新能力下降，引起衰老^[22-23]，因此干预p53和p21基因也能够达到延缓衰老的目的。Zhang等^[24]用老年大鼠血清处理间充质干细胞，引起衰老相关Wnt/β-catenin信号通路激活，且能够被Wnt/β-catenin信号通路抑制剂DKK1或β-catenin的小干扰RNA逆转衰老进程。衰老是许多人类疾病的主要风险因素，有研究者尝试利用细胞重编程来逆转衰老，通过表观遗传修饰使衰老相关的表型得到改善。Ocampo等^[25]在活体动物中首次实现了逆转衰老和延长寿命，构建一个体内的平台来调控与年龄相关的表观遗传学标记，有助于更加深入地了解衰老的机制。目前对于逆转衰老尚有诸多问题亟待解决，但随着科学进展和研究深入，人类会向这一美好愿望更进一步。

实验结果提示骨髓间充质干细胞的增殖、分化、旁分泌和免疫调节等功能会因衰老而逐渐受到损害，因此衰老的间充质干细胞可能不再适用于细胞治疗。为使骨髓间充质干细胞更加安全有效地应用于临床，就必须对其衰老的过程及其机制进行更深入的研究。

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Age effects on in vitro differentiation and cytokine levels of macaque bone marrow mesenchymal stem cells

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