设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2009年12月至2010年10月在宜昌市中心人民医院及三峡大学分子学生物研究所完成。
材料：健康3周龄清洁级雌性SD大鼠，体质量150-200 g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
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大鼠软骨细胞体外培养的试剂及仪器：
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试剂及仪器
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来源
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DMEM培养基
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Sigma公司
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小牛血清，Ⅱ型胶原酶
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Gibco公司
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胰蛋白酶(1∶250)
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AMREsCo公司
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京尼平苷
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浙江天鸿公司
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RT-PCR试剂盒
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Fermentas公司
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兔抗鼠COL2α1多克隆抗体
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Santa Cruz公司
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羊抗兔IgG-HRP抗体
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北京中杉金桥公司
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37 ℃恒温摇床
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New Brunswick scientific公司
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二氧化碳培养箱
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THERMO FORMA公司
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IX70倒置相差显微镜
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Olympus公司
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Gel Logic-200凝胶分析系统
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KODAK公司
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梯度PCR仪
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Whatman Biometra公司
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Mini型垂直板电泳系统，硝酸纤维素膜电转系统
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Bio-Rad公司
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方法：
大鼠膝关节软骨细胞的分离培养：将SD大鼠脱臼处死，浸泡于体积分数75%的乙醇中5 min，放置手术台上，仰位固定，常规无菌操作手术野。沿膝关节正中纵行切开皮肤直至暴露出以膝关节为中心约3 cm×3 cm的区域，打开膝关节腔，无菌条件下取膝关节股骨髁软骨组织，将获得关节软骨组织置入盛有含青霉素钠/链霉素双抗液的D-hank’s液的无菌平皿中，带入超净工作台。用含双抗液的D-hank’s液10 mL漂洗3次，用眼科剪将软骨组织剪成 1 mm3小块。酶两步消化法分离原代大鼠关节软骨细胞：体积分数0.25%胰蛋白酶先消化30-35 min，D-hank’s液浸洗2遍；后置于15 mL离心管，加体积分数0.2%Ⅱ型胶原酶(DMEM配制)，置37 ℃恒温水浴锅消化六七小时，每小时振荡5 min，直到软骨块大部分呈肉眼可见的絮状物。加入含体积分数20%小牛血清的DMEM中止消化，用200目不锈钢筛网过滤后800 r/min离心5 min弃上清。以锥虫蓝染色计算细胞活力。
将细胞以1×105 L-1浓度接种于6孔板内，置于37 ℃恒温，体积分数5%CO2，饱和湿度培养箱内培养。培养2 d后更换培养液1次，以后隔天换液，倒置显微镜观察、照相记录细胞形态及贴壁生长情况，待贴壁细胞浓度达到85%-90%后传代。
分组及干预：实验随机分4组：正常对照组(软骨细胞正常培养)、不同浓度京尼平苷干预组(京尼平苷25，50，100 μmol/L组，软骨细胞加入京尼平苷25，50，100 μmol/L培养)。
RT-PCR法检测京尼平苷对软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达的影响：
引物设计合成：根据GenebankⅡ型胶原序列用DNAMAN软件设计引物如下：上游：5’-GAA GCA CAT CTG GTT TGG AG-3’；下游：5’-TTG GGG TTG AGG GTT TTA CA-3’；扩增片段产物长度480 bp。
总RNA的抽提及其质量鉴定：取状态良好的第3代软骨细胞，常规消化离心接种于培养瓶后，分别加入25，50，100 μmol/L终浓度的京尼平苷养养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养3 d后，加入TRIzol试剂800 µL，充分吹打混匀。加入氯仿300 µL，盖紧离心管盖，用力震荡混匀室温放置10 min，待管内液体分层后于4 ℃， 12 000 r/min，离心15 min，小心吸取上清液转入新的 1.5 mL EP管，加入异丙醇800 µL，颠倒混匀、冰上放置15 min。4 ℃，12 000 r/min，离心15 min。小心弃去上清液，加入体积分数75%乙醇1 mL，颠倒混匀、4 ℃， 12 000 r/min。小心弃上清液，短暂离心，用移液枪吸去所有上清，在超净工作台中干燥沉淀5 min。加入RNase-free的重蒸馏水完全溶解RNA沉淀后，紫外法检测总RNA浓度和1%琼脂糖凝胶电泳观察，其余置于-80 ℃保存。
RT-PCR反应：按照Fermentas公司一步法RT-PCR试剂盒说明操作，反应条件为：94 ℃变性5 min；以94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s为一个PCR循环，反应进行35个循环；最后，72 ℃延伸5 min。PCR以GAPDH作为内参照，反应条件为：94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR扩增产物在含有1%琼脂糖的0.5×TBE缓冲液中电泳，电压控制在100 V，时间控制在30-40 min。Gel Logic-200 凝胶分析系统观察拍照分析，应用凝胶图像处理软件计算条带吸光度值，以目的片段与内参照(GAPDH)扩增条带的吸光度值的比值来表示目的片段的表达水平。
Western blot法检测京尼平苷对软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白合成影响：取状态良好的第3代软骨细胞，常规消化离心接种于培养瓶后，分别加入25，50，100 μmol/L终浓度的京尼平苷培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养3 d，收集细胞后用细胞裂解液裂解，总蛋白进行定量后加入4×Sample Buffer，煮沸5 min后离心取上清液跑SDS-PAGE电泳。电泳完毕后用蛋白转印系统转膜， 200 mA，2 h。转膜完毕后将PVDF膜放入体积分数5%脱脂牛奶中室温封闭 1 h。TBST漂洗1次后，加入一抗兔抗鼠COL2α1多克隆抗体(1∶200)，室温孵育4 h。TBST漂洗3次，10 min/次，加入二抗(HRP标记山羊抗兔IgG抗体， 1∶3 000 或HRP标记山羊抗鼠IgG抗体，1∶4 000)，室温孵育1 h，用β-actin抗体作内参。TBST漂洗3次，10 min/次，进行ECL显色。
主要观察指标：京尼平苷干预体外培养大鼠软骨细胞Ⅱ胶原蛋白及mRNA的表达。
统计学分析：计量资料用x±s表示，用SPSS 18.0统计学软件对计量结果进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。
