提高激素性股骨头坏死模型成活率的方法

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.50.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：激素性股骨头坏死动物模型建立过程中动物的死亡成为影响实验结果的主要因素。
目的：观察以脂多糖和地塞米松建立股骨头坏死模型，提高模型成功率的方法。
方法：新西兰大白兔48只随机等分为模型组、庆大霉素组、庆大霉素+兰索拉唑组和对照组，前3组连续2 d经耳缘静脉注射脂多糖，再连续3 d，臀部肌肉注射地塞米松注射液建立股骨头坏死模型，庆大霉素组和庆大霉素+兰索拉唑组在建模成功后连续7 d以庆大霉素灌胃，同时庆大霉素+兰索拉唑组肌肉注射兰索拉唑注射液。对照组兔仅注射生理盐水。
结果与结论：模型组、庆大霉素组和庆大霉素+兰索拉唑组均造模成功；其中庆大霉素+兰索拉唑组存活状况最好，3组动物死亡率分别是33.3%，25%，8.3%，模型组、庆大霉素组、庆大霉素组+兰索拉组和对照组兔的死亡数量差异有显著性意义(P < 0.05)。提示在兔激素性股骨头坏死模型建立中，庆大霉素+兰索拉唑的使用，可以提高实验动物的生存率。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织构建实验造模, 内毒素, 脂多糖, 地塞米松, 股骨头坏死, 动物模型, 致死原因, 兰索拉唑, 药物干预

Abstract:

BACKGROUND: Animal death is a main influential factor for experimental results in establishment of animal models of steroid-induced necrosis of femoral head.
OBJECTIVE: To observe models of femoral head necrosis established using lipopolysaccharide and dexamethasone so as to elevate success rate of model induction.
METHODS: A total of 48 New Zealand white rabbits were equally and randomly divided into model group, gentamicin group, gentamicin + lansoprazole group and control group. The first three groups were injected with lipopolysaccharide for 2 consecutive days via the ear vein, and then they were injected with dexamethasone via intramuscular injection in the buttocks for 3 consecutive days to establish models of femoral head necrosis. The rabbits of gentamicin group, gentamicin + lansoprazole group were intragastrically administered gentamicin for 7 consecutive days after success model induction. Simultaneously, gentamicin + lansoprazole group received intramuscular injection with lansoprazole. Rabbits in the control group were only injected with saline.
RESULTS AND CONCLUSION: Models were successfully established in the model, gentamicin, gentamicin + lansoprazole groups. Their conditions were best in the gentamicin + lansoprazole group. Mortalities in above-mentioned groups were 33.3%, 25% and 8.3%, respectively. Significant differences in the number of dead rabbits were detected in the model, gentamicin, gentamicin + lansoprazole and control groups (P < 0.05). Results indicated that the combined use of gentamicin and lansoprazole can elevate survival rate of experimental animals during the establishment of rabbit models of steroid-induced necrosis of femoral head.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: femur head necrosis, endotoxins, lipopolysaccharides, dexamethasone, gentamicins, disease models, animal

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析因拒食、呕吐、咳嗽、发热、腹泻、消化道出血等各种原因，模型组、庆大霉素组和庆大霉素+兰索拉唑组动物死亡率分别是33.3%，25%和8.3%；对照组兔无死亡现象发生。各组兔死亡数量的差异有显著性意义(P < 0.05)，各组兔具体死亡时间及数量见表1。
2.2 激素性股骨头坏死模型及药物干预对实验兔大体情况的观察结果模型组、庆大霉素组和庆大霉素+兰索拉唑组兔从造模第2天开始出现精神萎靡、毛发混乱、脱毛、采食减少，模型组部分兔子出现腹泻；造模1周后采食渐增，精神状态渐恢复，但体质量和皮下脂肪显著减少，但总体庆大霉素+兰索拉唑组实验兔的状况好于模型组和庆大霉素组。至6周末模型组、庆大霉素组和庆大霉素+兰索拉唑组大部分兔可观察到出现站立困难、跛行等现象。
对照组兔未出现精神萎靡、毛发混乱、脱毛、采食减少、体质量减轻、腹泻等症状。模型组、庆大霉素组和庆大霉素+兰索拉唑组兔造模第8周时的标本股骨头外形略显椭圆，关节软骨呈轻度剥脱；对照组兔8周时的股骨头外形均圆、光滑。

2.3 激素性股骨头坏死模型及药物干预对实验兔组织病理的影响光学显微镜下，对照组兔股骨头组织经苏木精-伊红染色后，可见骨小梁完整，排列整齐规则，骨细胞清晰，细胞核较大且位于中央。成骨细胞沿骨小梁成串分布，空骨陷窝少量散在，其存在丰富的骨髓造血细胞，但是脂肪细胞数量较少，见图1。

造模第8周时模型组、庆大霉素组和庆大霉素+兰索拉唑组兔股骨头部分经苏木精-伊红染色后，可见软骨面剥脱、软骨层变薄，骨小梁稀疏、变细、部分骨小梁断裂、结构紊乱，陷窝内见骨细胞减少、脂肪细胞体积与数量增多、脂质沉积，微小血管内可见血栓形成，髓腔内造血细胞明显减少，且模型组、庆大霉素组和庆大霉素+兰索拉唑组兔股骨头病理变化为发现明显差异，见图2。

各组骨坏死率及空骨陷窝率比较见表2，结果发现激素性股骨头坏死后兔的骨坏死率及空骨陷窝率明显增加(P < 0.05)，且使用庆大霉素联合兰索拉唑未对激素性股骨头坏死兔的骨坏死率及空骨陷窝率造成明显影响(P > 0.05)。

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引言

股骨头坏死是由于多种原因导致的股骨头局部血运不良，从而引起骨细胞进一步缺血、坏死、骨小梁断裂、股骨头塌陷的一种病变。自1888年世界医学界首次认识股骨头坏死这一疾病至今，股骨头坏死已由少见病转变为多发病、常见病。尤其是激素的问世及其广泛应用以来，股骨头坏死的发病率逐渐上升。加之交通工具变革后变通事故的增多，人们生活方式的改变均使得该病患者数量剧增。股骨头坏死的发生无明显性别差异，任何年龄均可患病，而有过激素应用史、髋部外伤史、酗酒史、相关疾病史者发病的机率明显增多。股骨头坏死可发生于任何年龄，但以31-60岁最多，无性别差异，开始多表现为髋关节或其周围关节的隐痛、钝痛，活动后加重，进一步发展可导致髋关节的功能障碍，股骨头坏死严重影响患者的生活质量和劳动能力，若治疗不及时，还可导致终身残疾。股骨头坏死最先出现的自觉症状就是疼痛，疼痛的部位是髋关节周围、大腿内侧、前侧或膝部。早期疼痛开始为隐痛、钝痛、间歇痛，活动多了疼痛加重，休息可以缓解或减轻。但也有呈持续性疼痛的，不管是劳累还是休息，甚至躺在床上也痛。而且，疼痛逐渐加重。此时在X射线上虽然没有明显的形态异常改变，但是髋关节已有不同程度的功能受限。比如患者患侧髋关节外展、旋转受限，下蹲不到位等等。股骨头坏死到了晚期，股骨头塌陷、碎裂、变形，有的可造成髋关节半脱位，此时的疼痛与髋关节活动、负重有直接关系。活动时关节内因骨性磨擦而疼痛，静止时头臼之间不发生磨擦，疼痛也就不明显了。所以说，行走、活动疼痛加重，动则即痛，静则痛止或减轻。总之，早期是以疼痛为主，伴有功能受限；晚期以功能障碍为主，伴有疼痛^[1-9]。

随着临床上激素的广泛应用，激素性股骨头坏死的发病率在中国逐年上升^[10-12]。该病具有预后差、致残率高等临床特点，给患者和社会带来了巨大的经济和精神压力，严重影响患者的生活质量。为探索治疗方法，需建立一种激素性股骨头坏死动物模型。理想的动物模型应该具有较高的造模成功率及较低的动物死亡率。在以兔激素性股骨头坏死造模的研究中，常用的方法有3种：单纯激素诱导、异体血清加激素诱导、内毒素加激素诱导。单纯激素和异体血清加激素诱导激素性股骨头坏死发生率并不高，而且这种模型重复性差，造模时间较长^[13-19]。激素联合脂多糖诱导激素性股骨头坏死动物模型的方法因骨坏死率高、并发症少等优点而被广泛应用。有研究表明激素联合内毒素脂多糖共同促进脂肪代谢紊乱、血液高凝血低纤溶状态和成骨细胞凋亡^[20]，两者协同作用并共同促进骨坏死发生，并降低各自单独应用时出现的不良反应。

因此，实验旨在探讨内毒素脂多糖联合地塞米松注射液诱导建立兔股骨头坏死模型的实验效果。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年1月至2013年1月在河北医科大学第一医院动物实验室完成。

方法：

动物：选用24-36周龄的清洁级健康新西兰大白兔48只，雌雄不限，体质量(2.5±0.3) kg，由河北医科大学第一医院动物实验室提供，动物许可证号：SCXK(冀)2003-1-003。兔单笼饲养，喂养饲料为标准颗粒饲料，由河北医科大学第一医院动物实验室提供，自由饮水，饲养条件：温度(22±2) ℃，湿度50%-70%，通风良好，阳光充足。实验过程中对动物处置符合科学技术部2006年《关于善待实验动物的指导性意见》的要求^[21]。

药物：脂多糖购自美国Sigma公司，规格为10 mg。

地塞米松注射液购自郑州卓峰制药有限公司，主要成分为地塞米松磷酸钠，化学名为16α-甲基-11β，17α，21-三羟基-9α-氟孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮-21-磷酸酯二钠，药物批准文号为国药准字：H41020056，规格为1 mL∶2 mg。

庆大霉素注射液购自石药集团银湖制药有限公司，规格为2 mL，药物批准文号为国药准字H14020752。

兰索拉唑注射液购自江苏奥赛康药业股份有限公司，化学名称为2-[[[3-甲基-4-(2，2，2-三氟乙氧基) -2-吡啶基]甲基]亚磺酰基-1H-苯并咪唑]，分子式为C₁₆H₁₄F₃N₃O₂S，相对分子质量为369.36，规格为 30 mg，药物批准文号为国药准字H20080336。

方法：

实验动物分组：适应性饲养1周，确定健康无疾病，除去有咳嗽、腹泻及后肢有畸形的兔，精确称质量，随机分为模型组、庆大霉素组、庆大霉素+兰索拉唑组和对照组，每组各12只。

股骨头坏死模型的建立：模型组、庆大霉素组和庆大霉素+兰索拉唑组兔连续2 d每天经耳缘静脉注射内毒素脂多糖(10 μg/kg)，再连续3 d，每天臀部肌肉注射地塞米松注射液(25 mg/kg)建立动物模型^[22]。对照组兔注射同等剂量的生理盐水。

药物治疗方法：庆大霉素组和庆大霉素+兰索拉唑组兔在造模后连续7 d以8×10⁴ U/d庆大霉素注射液灌胃，庆大霉素+兰索拉唑组兔在造模后连续7 d臀部肌肉注射10 mg/d兰索拉唑注射液。

大体观察：造模后第2天开始观察动物的精神状态，毛发、采食、尿便、体质量及活动状况。

死亡现象观察：记录每只死亡时间，并进行解剖分析死因，统计各组的最终死亡数量。

取材：造模后第8周，取各组实验兔，经耳缘静脉注射空气处死，取股骨头颈区标本。

兔股骨头标本的大体观察：观察各组实验兔的股骨头的外形及关节软骨面的颜色、光滑度。

苏木精-伊红染色观察兔股骨头组织病理变化：取股骨头颈区标本，用体积分数10%甲醛缓冲液固定兔股骨头标本3 d，梯度乙醇脱水，标本浸蜡、包埋、冠状面切片(5 μm)，然后苏木精-伊红染色，光镜观察。应用自动图像信号采集与分析系统(日本Olympus公司)进行骨组织形态观察，记录空骨陷窝百分率、骨坏死发生率。

骨坏死定义为骨小梁内出现弥漫性空陷窝或核皱缩，伴随有周围骨髓细胞坏死^[23-27]。骨坏死发生率(%)=任何一侧股骨头出现骨坏死灶的动物数/组内动物总数×100%；随机取10个高倍镜视野(×400)，每个视野内计算空骨陷窝百分率=空骨陷窝数/总骨陷窝数×100%。

主要观察指标：激素性股骨头坏死兔股骨头的形态表现。

统计学分析：实验数据以x(_)±s表示，应用SPSS 13.0软件(美国SPSS公司)对数据结果进行χ²检验及t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

激素性股骨头坏死具有临床症状较重、治疗困难、致残率高等临床特点。联合内毒素和激素注射建立动物骨坏死模型的方法，股骨和肱骨坏死率很高(85%)，然而这种方法动物的病死率高(50%)^[28-36]。研究发现，给予新西兰大白兔单次小剂量注射脂多糖和3次大剂量注射甲基氢化泼尼松，6周后组织病理检查显示93%大白兔发生骨坏死，且在整个实验期间无动物死亡，表明激素联合脂多糖不仅能提高骨坏死率，还能降低动物死亡率^[37-40]。

脂多糖是革兰阴性菌细胞壁中的一种重要组成成分，它与蛋白质、磷脂等共同构成了革兰阴性菌的细胞外壁。脂多糖导致股骨头坏死的原因与血浆纤溶酶原激活剂抑制因子1增多、血小板增多及高脂血症有关，脂多糖能激活血小板、内皮细胞、单核巨噬细胞，导致微血管血栓形成^[41-49]。脂多糖是一种非常强烈的致炎因子，其作用于机体后会刺激机体产生多种触发炎症的细胞因子，如肿瘤坏死因子、白细胞介素1、白细胞介素6和干扰素等，这些细胞因子的大量释放可导致机体内环境的极度紊乱，从而发生脓毒症休克和多器官功能衰竭^[50-52]。糖皮质激素抑制免疫，诱发感染，水、电解质、糖、蛋白质、脂肪等物质代谢紊乱；诱发或加重感染：皮质激素有抗炎作用，但不具有抗菌作用，且能降低机体抗感染能力，使机体抗病能力下降，利于细菌生长、繁殖和扩散；诱发或加重消化性溃疡：糖皮质激素可使胃酸及胃蛋白酶分泌增多，又能减少胃黏液分泌，降低胃黏膜的抵抗力，可诱发或加重胃、十二指肠溃疡出血，甚至造成消化道穿孔^[53]。激素联合脂多糖共同促进骨坏死发生，同时是导致动物死亡的主要原因。

陈冠儒等^[54]用醋酸泼尼松龙、醋酸泼尼松龙+青霉素、醋酸泼尼松龙+青霉素+雷尼替丁肌肉注射都能成功诱导兔激素性股骨头坏死动物模型，死亡率分别为50%，30%，10%，醋酸泼尼松龙+青霉素+雷尼替丁注射兔加用H2受体阻滞剂雷尼替丁以预防消化道溃疡，显著减少了动物死亡率，并且不影响造模成功。本次实验给予脂多糖+地塞米松时未进行抗生素及H2受体阻滞剂辅助用药，结果在建模过程中33.3%动物相继死亡。据有关资料显示，在引起兔死亡的各种因素中，有70%以上是由腹泻造成，包括消化不良性腹泻、细菌性腹泻、病毒性腹泻等，激素联合脂多糖，导致动物免疫功能衰退，抗病能力下隆，外源性感染及多器官功能衰竭使动物死亡^[55]。因此，必须配合使用合适剂量的抗生素及H2受体阻滞剂，提高动物在建模过程中的存活率。兰索拉唑是一种新型的壁细胞质子泵抑制剂，具有很强的抑酸作用，主要是通过在胃壁细胞的细胞内小管的酸性环境下转换为具有生物活性的次磺酸和次磺酰胺形式的药物，短期内有效的抑制蛋白酶的活性，促进溃疡的愈合，且酸性环境利于血小板聚集，加速止血^[56]，此外，兰索拉唑还能间接促进胃窦部细胞释放胃泌素，使血清中胃泌素水平升高，增加胃黏膜血流量及对胃肠细胞起营养作用，与此同时还能有效抑制幽门螺杆菌活性，利于胃及十二指肠黏膜病变的修复，利于上消化道出血疾病的恢复^[57]。尽管如此，庆大霉素组中造模兔子的死亡率仍为25%，在临床中激素主要副作用之一是会引起消化道溃疡出血，影响消化进食。庆大霉素+兰索拉唑组加用H2受体阻滞剂兰索拉唑注射液以预防消化道溃疡，显著减少了动物死亡率，并且不影响造模成功。

综上所述，内毒素脂多糖联合地塞米松注射液能成功地建立兔股骨头坏死模型；庆大霉素等抗生素能预防在建模过程中兔的感染，胃酸抑制剂能预防消化道溃疡，减少动物死亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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