经颅磁刺激帕金森病模型小鼠体内神经干细胞的增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.018

中国组织工程研究

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

经颅磁刺激帕金森病模型小鼠体内神经干细胞的增殖

顾平^1，2，张忠霞^1，2，马芹颖^1，2，耿媛¹，王彦永^1，2，张丽娜^1，2，王铭维^1，2

1河北省脑老化与认知神经科学实验室，河北省石家庄市 050031；2河北医科大学第一医院神经内科，河北省石家庄市 050031

修回日期:2013-09-01 出版日期:2013-11-05 发布日期:2013-11-05
通讯作者: 王铭维，博士，主任医师，教授，博士生导师，河北省脑老化与认知神经科学实验室，河北省石家庄市 050031；河北医科大学第一医院神经内科，河北省石家庄市 050031 wmw@jyyy.com.cn
作者简介:顾平☆，女，1970年生，江苏省无锡市人，汉族，1993年河北医科大学毕业，博士，主任医师，教授，硕士生导师，主要从事神经病学方面的研究。 gpwh2000@yahoo.com.cn
基金资助:
国家科技部973计划前期研究专项课题(2010CB535005)*；2009科技厅指令课题(09276103D-12)*

Transcranial magnetic stimulation promotes proliferation of endogenous neural stem cells of Parkinson’s disease model mice

Gu Ping^{1, 2}, Zhang Zhong-xia^{1, 2}, Ma Qin-ying^{1, 2}, Geng Yuan¹, Wang Yan-yong^{1, 2}, Zhang Li-na^{1, 2},Wang Ming-wei^{1, 2}

1Brain Aging and Cognitive Neuroscience Laboratory of Hebei Province, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China; 2Department of Neurology, First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China

Revised:2013-09-01 Online:2013-11-05 Published:2013-11-05
Contact: Wang Ming-wei, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Brain Aging and Cognitive Neuroscience Laboratory of Hebei Province, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China; Department of Neurology, First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China wmw@jyyy.com.cn
About author:Gu Ping☆, M.D., Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Brain Aging and Cognitive Neuroscience Laboratory of Hebei Province, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China; Department of Neurology, First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China gpwh2000@yahoo.com.cn
Supported by:
the Preliminary Special Issue of the National “973” Plan of China, No. 2010CB535005*; the Command Topic of Science and Technology Department in 2009, No. 09276103D-12*

摘要/Abstract

摘要：

背景：神经毒素1-甲基-4-苯基-1、2、3、6-四氢吡啶能够诱导类似于在原发性帕金森病所观察到的临床、生化和病理的特征。
目的：观察重复经颅磁刺激对帕金森病模型小鼠侧脑室室管膜下区内源性神经干细胞增殖的影响及对情绪障碍的影响。
方法：选用雄性C57BL/6J小鼠72只，随机分为 4 组。帕金森病模型组和磁刺激组采用背部皮下注射1-甲基-4-苯基-1、2、3、6-四氢吡啶注射4次制备急性帕金森病模型，末次注射24 h后，对磁刺激组小鼠进行重复经颅磁刺激干预，刺激频率为1 Hz，刺激强度为阈上20%，刺激5个序列，每个序列刺激25次，分别治疗1，3，7 d；假磁刺激组不暴露于磁场下；帕金森病模型组不给予任何处理；盐水对照组皮下注射与帕金森病模型组等量的生理盐水。对重复经颅磁刺激干预前后进行高架十字迷宫实验，以评价其情绪障碍。利用免疫组织化学染色的方法检测室管膜下区巢蛋白阳性细胞数。
结果与结论：①高架十字迷宫试验：各组内及各组间在不同时间点，小鼠的开放臂停留时间比例(OT%)差异无显著性意义，但重复经颅磁刺激干预后的小鼠OT%有较明显的下降。②巢蛋白免疫组织化学染色结果：帕金森病模型组较盐水对照组巢蛋白的阳性细胞数于第3天和第7天时明显增高，较假磁刺激组无统计学意义。②磁刺激组较假磁刺激组及帕金森病模型组巢蛋白的阳性细胞数明显增高。③巢蛋白的阳性细胞数随时间的延长而增加，内源性神经干细胞沿一定的路径逐渐往外迁移，第3天时有一部分迁移到胼胝体，到第7天时有一部分能迁移到大脑皮质。说明重复经颅磁刺激能促进内源性神经干细胞增殖，内源性神经干细胞增殖具有时间依赖性。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 内源性神经干细胞, 侧脑室下区, 重复经颅磁刺激, 帕金森病, 973项目, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine can induce the clinical, biochemical and pathological characteristics similar to those observed in primary Parkinson’s disease.
OBJECTIVE: To observe the effects of repetitive transcranial magnetic stimulation on the proliferation of endogenous neural stem cells of Parkinson’s disease model mice and the mood change.
METHODS: A total of 72 male C57BL/6J mice were randomly divided into four groups: normal saline group, Parkinson’s disease model group (model group), sham-repetitive transcranial magnetic stimulation group (sham group) and repetitive transcranial magnetic stimulation group. The mice received 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine injection×4 to establish acute Parkinson’s disease models. The mice in the normal saline group were injected the same volume saline. And 24 hours after the last injection of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine, the mice in the repetitive transcranial magnetic stimulation group received five trains of repetitive transcranial magnetic stimulation, 1 Hz for 25 seconds, at an intensity of 1 Tesla daily for 1, 3, 7 consecutive days. Sham group mice were not exposed to the magnetic field. No treatment was performed in the mice of model group. The mood change was evaluated using the elevated-plus maze testing before and after repetitive transcranial magnetic stimulation treatment. The change in expression of nestin in the subventricular zone was observed by using immunohistochemical technique.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Elevated-plus maze testing: There was no statistical significance about percentage of opening arm time accounting for total time among groups and at different time points in each group, but after stimulation, the percentage of opening arm time accounting for total time showed a declined tendency. (2) The results of nestin immunohistochemical staining: Compared to the normal saline group, the number of nestin-positive cells of the model group was increased at days 3 and 7, and there was no statistical significance in the number of nestin-positive cells between model group and sham group; Compared to the sham group and model group, the number of nestin-positive cells of repetitive transcranial magnetic stimulation group were evidently increased; The proliferation of endogenous neural stem cells was time-dependent, endogenous neural stem cells exhibited outward migration gradually along the certain way, and some cells were able to migrate to the corpus callosum at day 3, and even to the cerebral cortex at day 7. Repetitive transcranial magnetic stimulation can promote the endogenous neural stem cells in a time-depended manner.

Key words: stem cells, neural stem cells, cerebral ventricles, transcranial magnetic stimulation, Parkinson disease

中图分类号:

R394.2

顾平，张忠霞，马芹颖，耿媛，王彦永，张丽娜，王铭维 . 经颅磁刺激帕金森病模型小鼠体内神经干细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.018.

Gu Ping, Zhang Zhong-xia, Ma Qin-ying, Geng Yuan, Wang Yan-yong, Zhang Li-na. Transcranial magnetic stimulation promotes proliferation of endogenous neural stem cells of Parkinson’s disease model mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.018.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析实验选用小鼠72只，分为4组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。
2.2 帕金森病小鼠行为学改变
一般行为学检测结果：小鼠在每次注射MPTP后很快出现震颤、竖尾、竖毛、后肢张开、步态不稳，随着给药次数的增加，其运动减少、肢体僵硬、步态不稳、反应迟缓的表现越来越明显。而盐水对照组无异常行为表现。且在磁刺激过程中及刺激后均未出现惊厥、强直、阵挛发作等异常情况，亦无饮食异常、体质量下降等。
高架十字迷宫实验结果：①各组组内各时间点间开放臂停留时间比例比较差异均无显著性意义(P > 0.05)。②干预前后各时间点各组组间开放臂停留时间比例比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图1。③虽然组内比较统计学上未见明显差异，但干预后的小鼠开放臂停留时间比例有较明显的下降。
2.3 小鼠室管膜下区免疫组织化学染色结果对室管膜下区的石蜡切片进行巢蛋白的免疫组织化学染色显示：与盐水对照组相比：帕金森病模型组巢蛋白的阳性细胞数第1天相近，差异无显著性意义(P > 0.05)，在第3天和第7天明显增多，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2-4。

磁刺激组与假磁刺激组相比：巢蛋白的阳性细胞数明显增多(P < 0.01)，见图6。磁刺激组与帕金森病模型组相比：巢蛋白的阳性细胞数增多，尤以第1天和第7天显著(P < 0.01)，见图7-10。巢蛋白细胞的迁移：假磁刺激组与磁刺激组的巢蛋白阳性细胞在第3天时出现迁移，开始时沿侧脑室壁往外迁移，在假磁刺激组第7天时能迁移到胼胝体，少部分迁移到皮质，而在磁刺激组，迁移到皮质的细胞较多。帕金森病模型组、假磁刺激组与磁刺激组巢蛋白的阳性细胞数组内各时间点比较差异有显著性意义(P < 0.05)，细胞数量随时间的延长而增加，见表1。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2008年6月至2009年6月在河北医科大学第一医院脑老化与认知神经科学实验室完成。

材料：

实验动物：8-12周清洁级健康成年雄性C57BL/6J小鼠72只，体质量18-20 g，由河北医科大学动物中心提供。安静环境饲养，自由取食饮水，通风良好，室温在20- 22 ℃，人工昼夜节律(光照与黑暗时间为12 h∶12 h)。动物于实验前适应实验室环境3 d。

重复经颅磁刺激对帕金森病模型小鼠体内神经干细胞增殖实验用试剂与仪器：

实验方法：

帕金森病动物模型的制作及分组：72只雄性C57BL/6J小鼠随机分为盐水对照组，帕金森病模型组，假磁刺激组，磁刺激组，每组18只。小鼠皮下注射神经毒素MPTP 15 mg/kg，2 h/次，注射4次来制备急性帕金森病模型。末次注射24 h后对磁刺激组小鼠进行重复经颅磁刺激干预，刺激频率为1 Hz，每次刺激25 s，刺激5个序列，刺激1次/d，分别刺激1，3，7 d，假磁刺激组置于相同环境，但不接受磁刺激；盐水对照组和帕金森病模型组不予以任何处理。最后一次刺激24 h后，各组将小鼠处死，脱水包埋进行免疫组织化学分析。

小鼠行为学检测：每次MPTP注射后20 min进行一般情况观察，包括自主活动、动作、后肢僵硬、竖尾、竖毛、蜷卧以及对外界刺激的反应等。并分别在干预前后2 d进行高架十字迷宫检测，计算开放臂占总时间的百分比，即开放臂停留时间比例(OT%)。

各组具体实验方法为：

磁刺激组	小鼠皮下注射神经毒素MPTP 15 mg/kg， 2 h/次，注射4次制备急性帕金森病模型	末次注射24 h后进行重复经颅磁刺激干预，刺激频率为1 Hz，每次刺激25 s，刺激5个序列，刺激1次/d，分别刺激1，3，7 d	分别在MPTP注射和磁刺激治疗前后的第1天与第2天进行高架十字迷宫实验，并计算开放臂停留时间比例(OT%)
假磁刺激组	小鼠皮下注射神经毒素MPTP 15 mg/kg， 2 h/次，注射4次制备急性帕金森病模型	置于相同环境，但不接受磁刺激	分别在MPTP注射和假刺激治疗前后的第1天与第2天进行高架十字迷宫实验，并计算开放臂停留时间比例(OT%)
帕金森病模型组	小鼠皮下注射神经毒素MPTP 15 mg/kg， 2 h/次，注射4次制备急性帕金森病模型	不予以任何处理	分别在MPTP注射前及末次注射后第1天与第2天进行高架十字迷宫实验，并计算开放臂停留时间比例(OT%)。
盐水对照组	皮下注射等量生理盐水	不予以任何处理	分别在生理盐水注射前及末次注射后第1天与第2天进行高架十字迷宫实验，并计算开放臂停留时间比例(OT%)。

①盐水对照组和帕金森病模型组：分别在生理盐水或MPTP注射前及末次注射后第1天与第2天进行高架十字迷宫实验，并计算开放臂停留时间比例(OT%)。②磁刺激组和假磁刺激组：分别在MPTP注射和真、假刺激治疗前后的第1天与第2天进行高架十字迷宫实验，并计算开放臂停留时间比例(OT%)。

免疫组织化学染色：将各组小鼠用40 g/L的多聚甲醛灌注固定，取脑做连续冠状石蜡切片，片厚7.5 μm，依据实验目的对侧脑室区脑切片行免疫组织化学染色检测巢蛋白阳性细胞。方法如下：侧脑室区滴加一抗为巢蛋白，工作浓度为1∶100。每只小鼠侧脑室区共取30张脑片，然后隔10取1，即每只鼠有三脑片进行免疫组织化学染色。显微镜下观察侧脑室巢蛋白阳性细胞表达，盲法由第3人于200倍视野下计数脑片上同一侧整个侧脑室巢蛋白阳性细胞表达，取均值，每组计数6只小鼠，再取均值后作为最终数据。

主要观察指标：①帕金森病小鼠一般行为学改变。②帕金森病小鼠高架十字迷宫实验结果。③小鼠侧脑室下区巢蛋白的免疫组织化学表达。

统计学分析：用SPSS13.0 for Windows软件包进行统计学处理。所有数据均以x(_)±s表示，各组小鼠的高架十字迷宫实验数据比较行单因素方差分析，两两比较使用LSD检验，统计结果以P < 0.05为差异有显著性意义的标准。

讨论

帕金森病是一种多发于中老年人的慢性神经系统退行性疾病，主要病理特点是中脑黑质多巴胺能神经元变性坏死和纹状体区多巴胺水平减少。神经毒素MPTP能够诱导类似于在原发性帕金森病所观察到的临床、生化和病理的特征，尤其C57BL/6J小鼠品系对该神经毒素有高度敏感性。

实验中采用MPTP 4×15 mg/kg的建模方式^[5-6]，对C57BL/6J小鼠成功制备急性帕金森病模型^[7]。而盐水对照组小鼠无异常行为表现。

目前帕金森病的发病机制仍不清楚，治疗机制亦不完善。无论是药物治疗还是外科手术只能部分改善症状，长期疗效并不乐观。因此探寻无创、避免不良反应的新疗法是当前神经科学研究的热点。而促进内源性神经干细胞增殖使得机体功能恢复已成为研究的热点。内源性神经干细胞通常处于静息状态，脑损伤等刺激后，神经干细胞有一短暂增殖过程(内源性修复时间窗)，在该时间窗内调控神经干细胞的增殖、迁移、分化等过程，可能为增强大脑的可塑性提供有效途径^[8]。神经干细胞因具有高度自我更新能力、多潜能分化、低免疫原和迁移功能等特性^[9]，神经干细胞移植在治疗急、慢性神经系统损伤以及多种神经系统疾病如多发性硬化症、阿尔茨默氏病、帕金森病、亨廷顿病和缺血性脑损伤方面具有广阔的临床应用前景^[10-12]。但内源性神经干细胞的数量本身是有限的，而外源性神经干细胞的获得，又涉及到诸多问题，例如取材问题，伦理道德问题等，所以需寻求一种能促进内源性神经干细胞增殖的方法，以促进疾病的恢复。

帕金森病大鼠模型神经干细胞增殖的研究鲜有报道。曾水林等^[13]实验表明：帕金森病模型大鼠可以激活自身的神经干细胞，神经干细胞参与了帕金森病的损伤修复过程。但是激活的细胞数量相对较少(特别是在黑质区)，其最终转化为多巴胺能神经元的细胞数量更是有限。故原位激活的神经干细胞对帕金森病的治疗作用很不明显。所以，寻求有效的激活急性帕金森病小鼠自身的内源性神经干细胞的方法非常有意义，由于实验的其他相关研究，作者选择了安全无创的重复经颅磁刺激的方法。

重复经颅磁刺激在神经元不应期也进行刺激，兴奋更多水平走向的联接神经元，产生兴奋性突触后电位总和，使皮层之间的兴奋抑制联系失去平衡。另外，不同频率的重复经颅磁刺激刺激可能对皮质代谢及脑血流有不同影响，可以对皮质及大脑内部很多部位产生功能性的影响^[14]。Pascual等^[15]于1994年首次将重复经颅磁刺激用于帕金森病的治疗，发现它对运动功能产生了有益的效果，其后更多学者用它进行了临床研究^[16-19]，以探求重复经颅磁刺激治疗帕金森病的疗效、机制等，其中多数研究认为低频重复经颅磁刺激可以缓解帕金森病患者的运动症状并促使帕金森病患者的功能恢复^[17-19]。多数实验表明，低频电磁场会促进体内和体外的多种细胞增殖^[17-19]。其机制可能是，仅受的电磁场作用于胞膜受体，引起胞内水平改变，继而触发一系列磷酸化生物信号放大反应，而调控细胞增殖。

实验中，MPTP最后一次注射24 h后，免疫组织化学结果显示经重复经颅磁刺激后，室管膜下区内源性神经干细胞明显多于假刺激组和未刺激组，说明重复经颅磁刺激能促进内源性神经干细胞的增殖。

高架十字迷宫实验，为抗焦虑研究中公认的非条件反射实验，通过小鼠在中心地带活动的相对时间和路程来评估小鼠相应的焦虑程度^[18]。实验指标以在开放臂停留时间的百分数(OT% )反映动物的焦虑状态，焦虑动物的OT%明显降低。已有的研究发现，脑中抑制性神经递质γ-氨基丁酸的不足尤其是其离子型受体γ-氨基丁酸A上苯二氮卓类结合位点的减少，单胺类递质如5-羟色胺、去甲肾上腺素等平衡状态的打破等都可导致焦虑的发生^[21-22]。叶青等^[23]实验表明低频重复经颅磁刺激治疗抑郁症与其降低海马β1和β2肾上腺素受体有关。但是低频重复经颅磁刺激如何通过降低海马β1和β2肾上腺素受体而起到抗抑郁作用，其机制不是很清楚。

实验分别在干预前后2 d进行高架十字迷宫实验，分别检测2 d然后取平均值，计算开放臂停留时间比例，结果显示：虽然干预后开放臂停留时间比例值是低于干预前的值，但干预前后比较差异无显著性意义。推测原因可能为：①Weissman等^[24]认为在MPTP最后一次注射后第3天或第4天(多巴胺神经元损伤较完全)，进行行为学测试能较客观地反映小鼠帕金森病模型的行为学变化。而作者这次实验是在造模后第1天与第2天进行的观察，并与造模前第1，2天进行比较。时间上并不能形成行为的变化。②Sugama等^[25]研究发现，应用MPTP急性注射方案(同本实验)制备C57BL/6J小鼠模型后第7天至第14天神经元丧失基本处于稳定状态。行为异常是黑质致密层多巴胺细胞的丧失而引起的多巴胺能神经递质缺乏所致^[5]。根据MPTP急性注射后神经元缺失的变化特点，实验的观察时间只选择干预1 d后进行观察，故实验所采用的时间点也可能正好并不能出现情绪行为的变化。这是实验的缺陷所在。③实验小鼠虽经过筛选但由于个体差异和样本数量不够，所以在统计学上没有意义。

正常成年哺乳动物脑内巢蛋白阳性神经前体/干细胞仅存在于侧脑室的室管膜下区和海马齿状回颗粒下层^[26]。巢蛋白做为一种中间丝蛋白主要在胚胎神经前体细胞和成年神经干细胞呈一过性表达，随着神经干细胞完成迁移和分化，巢蛋白表达逐渐减少甚至消失^[27]。即巢蛋白阳性细胞的增殖具有时间依赖性，1 d在室管膜下区和齿状回颗粒下层出现增殖，1 周后巢蛋白阳性细胞数达到高峰，之后巢蛋白阳性细胞数逐渐下降，2周时明显低于1周，但高于正常水平。由于巢蛋白的这种多出现于早期原始未分化细胞的特性，目前已被广泛应用于神经干细胞的鉴定^[28-29]。

刘惠玲等^[30]的实验结果表明，C57小鼠侧脑室外侧壁的室管膜中含有较多量的巢蛋白免疫阳性的胞体，这些胞体发出大量纤细的突起伸入甚或超越室管膜下层而深入周围的脑实质中。而室管膜下层中仅含有较少量的巢蛋白免疫阳性的胞体。这些现象提示至少在C57小鼠脑内，侧脑室外侧壁的室管膜细胞中可能含有较多量的神经干细胞^[27]。所以作者这次实验的取材位置定在了侧脑室的室下区，并且内源性神经干细胞确实集中于侧脑室的外侧壁。

实验用巢蛋白标记内源性神经干细胞，发现帕金森病模型组内源性神经干细胞明显多于盐水对照组，并且内源性神经干细胞的增殖具有时间依赖性，在1 d的时候开始出现增殖，3 d时增殖比较明显，7 d时增殖达到高峰。这与尹清等^[31]的实验结果相似。

综上所述，实验表明C57BL/6J皮下注射MPTP能成功复制急性帕金森病小鼠模型，造模后一般的行为障碍出现，但在早期并没有焦虑抑郁的行为变化。急性帕金森病小鼠本身能刺激内源性神经干细胞的增殖，急性帕金森病小鼠给予重复经颅磁刺激后增殖的细胞明显增多，改善神经功能，这可能与调节多巴胺的合成和释放有关^[32]，并且具有时间依赖性。实验室的前期研究也证实，经颅磁刺激能够增加MPTP诱导的帕金森病小鼠纹状体GAP-43和SYN表达^[33]；提示经颅磁刺激有促进神经再生和突触重塑作用。并利用低频MS对对数生长期的PC12细胞进行干预，发现多巴胺含量增加^[34]。因此，证明了重复经颅磁刺激能促进内源性神经干细胞的增殖，并为重复经颅磁刺激调节和促进帕金森病的神经保护提供了一定的理论依据。

经颅磁刺激帕金森病模型小鼠体内神经干细胞的增殖

Transcranial magnetic stimulation promotes proliferation of endogenous neural stem cells of Parkinson’s disease model mice

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