成人骨髓间充质干细胞体外培养、鉴定与成骨诱导

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.019

中国组织工程研究

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成人骨髓间充质干细胞体外培养、鉴定与成骨诱导

张铭杰¹，张庆文²，何伟²，陈镇秋²，欧志学³，贾晓军³

1青岛市海慈医疗集团骨伤科，山东省青岛市 266033；2广州中医药大学第一附属医院关节一科，广东省广州市 510405；3广州中医药大学，广东省广州市 510405

修回日期:2013-10-02 出版日期:2013-11-05 发布日期:2013-11-05
通讯作者: 张庆文，副教授，硕士生导师，广州中医药大学第一附属医院关节一科，广东省广州市 510405 zh-qwen@163.com
作者简介:张铭杰☆，男，1980年生，山东省青岛市人，汉族，2012年广州中医药大学毕业，博士，主要从事股骨头坏死的基础与临床研究。 zmj105@sina.com
基金资助:
广东省自然科学基金课题(10151040701000025)*，课题名称“激素性骨坏死骨髓间充质干细胞成骨分化能力改变及补肾活血法干预研究”

In vitro cultivation, identification and osteoinduction of adult bone marrow
mesenchymal stem cells

Zhang Ming-jie¹, Zhang Qing-wen², He Wei², Chen Zhen-qiu², Ou Zhi-xue³, Jia Xiao-jun³

1Department of Orthopaedics, Qingdao Hospital, Qingdao 266033, Shandong Province, China; 2First Department of Joint Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 3Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China

Revised:2013-10-02 Online:2013-11-05 Published:2013-11-05
Contact: Zhang Qing-wen, Associate professor, Master’s supervisor, First Department of Joint Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China zh-qwen@163.com
About author:Zhang Ming-jie☆, M.D., Department of Orthopaedics, Qingdao Hospital, Qingdao 266033, Shandong Province, China zmj105@sina.com
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 10151040701000025*

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞具有自我增殖和多向分化潜能，然而间充质干细胞在骨髓中含量极少，体外纯化、扩增与成骨诱导是进行骨组织工程研究的关键。
目的：拟建立一套简便可靠的成人骨髓间充质干细胞体外培养及鉴定体系，并定向诱导其向成骨细胞分化。
方法：抽取髂前上棘处骨髓，采用密度梯度离心法与贴壁筛选法相结合，对骨髓间充质干细胞分离、纯化、培养并扩增。将地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素Ｃ配制成骨诱导液，将细胞分为成骨诱导组和空白对照组进行观察。
结果与结论：成人骨髓间充质干细胞呈典型的长梭形、纺锤状。8-11 d细胞进入快速增殖期，生长曲线呈S型，CD44、CD90均呈阳性表达，而CD34、CD45呈阴性表达。碱性磷酸酶活性随培养时间而增高，并在第12天达到高峰，成骨诱导组各时间点碱性磷酸酶活性均高于空白对照组。说明实验建立的成人骨髓间充质干细胞体外培养、鉴定及诱导成骨细胞分化体系可以获得纯度较高、成骨分化能力较好的间充质干细胞。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 培养, 鉴定, 成骨细胞, 分化, 股骨头坏死, 组织工程, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells have the potential of self-proliferation and multi-directional differentiation, while mesenchymal stem cells are few in adult bone marrow. In vitro purification, amplification and osteoinduction are very important for the research of bone tissue engineering.
OBJECTIVE: To establish a simple and reliable in vitro cultivation and identification system of adult bone marrow mesenchymal stem cells, and to induce the mesenchymal stem cells to differentiate into osteoblasts.
METHODS: Bone marrow were extracted from adult anterior superior iliac, the density gradient centrifugation and adhesion method were used to isolate, purify, culture and amplify the bone marrow mesenchymal stem cells. Osteogenic medium was prepared by mixing appropriate amount of dexamethasone, β-glycerophosphate and ascorbic acid C. The cells were divided into osteoinduction group and blank control group for observation.
RESULTS AND CONCLUSION: Adult bone marrow mesenchymal stem cells were in typical long spindle-shape. The cells grew into rapid proliferation phase at 8-11 days and the growth curve was S-shape. CD44 and CD90 were in positive expression, while CD34 and CD45 were negative. The alkaline phosphatase activity was increased with culturing time prolonging, and reached the summit at the 12th day. The alkaline phosphatase activities of osteoinduction group were higher than those in the blank control group at different time points. These results suggested that in vitro cultivation, identification and osteoinduction system could obtain mesenchymal stem cells with high purity and good osteogenic differentiation capacity.

Key words: stem cells, cell differentiation, osteoblasts, tissue engineering

中图分类号:

R394.2

张铭杰，张庆文，何伟，陈镇秋，欧志学，贾晓军. 成人骨髓间充质干细胞体外培养、鉴定与成骨诱导[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.019.

Zhang Ming-jie, Zhang Qing-wen, He Wei, Chen Zhen-qiu, Ou Zhi-xue, Jia Xiao-jun. In vitro cultivation, identification and osteoinduction of adult bone marrow
mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.019.

图/表（结果） 11

2.1 骨髓间充质干细胞的分离骨髓血经1.077 g/mL的Ficoll分离液分离后，可以看到离心管内液体分为明显的4层，见图1。最上层约占液柱的1/2，为淡红色的血浆与培养液层；第3层约占液柱的2/5，为澄清的Ficol1分离液层；在两层的交界处为高约5 mm的乳白色云雾状层，为单个核细胞层(此层为所要提取的细胞层)；最底层紧附试管壁，呈深红色，主要为密度较大的红细胞与粒细胞层。

2.2 成人骨髓间充质干细胞原代及传代细胞形态学倒置相差显微镜观察显示，细胞提取的最初培养液中，悬浮的血细胞成分居多，因其不贴壁可随换液逐渐被清除。骨髓间充质干细胞为贴壁生长细胞，接种后48 h开始有散在单个核细胞贴壁，贴壁细胞开始分裂增殖、由最初的圆形逐渐伸展开，细胞两极朝向不规律，形态不规则，呈“发芽现象”，周围有混杂细胞，见图2。

4-7 d后细胞逐渐呈现长梭形、纺锤状，贴壁细胞逐渐增多，形成集落样生长。8-11 d细胞进入快速增殖期，梭形突起变长，细胞密度及形成集落的数目明显增加，逐渐融合成片，排列有一定的方向性，呈网状、旋涡状、纤维样，见图3。

由于混杂的悬浮细胞随着换液被清除，骨髓间充质干细胞逐渐纯化，一般两三周骨髓间充质干细胞融合达80%-100%，可以进行传代，见图4。传代细胞为圆形，折光性好，接种后2-4 h多数细胞迅速贴壁，伸展，重新恢复梭形、三角形等。24 h左右活细胞基本完成贴壁，细胞呈均匀生长，不再形成集落样生长，6-8 d即长满培养瓶底。

细胞传至五六代以后，形态变得不规则，细胞变得平坦、宽大、分叉，胞质疏松，折光度减弱，胞质内开始出现小的颗粒，从整体上讲细胞增殖速度减慢，提示细胞开始老化，可通过降低血清浓度至8%左右以延缓细胞老化。
2.3 成人骨髓间充质干细胞的增殖活性及生长曲线对第1，2，4，6代细胞进行生长曲线的绘制。细胞传代接种后0-2 d为生长潜伏期，此期主要为细胞适应体外环境，贴壁增长阶段，此期细胞增长并不活跃；3-7 d细胞增长极为活跃，呈指数级递增，为对数增长期；此后细胞由于接触抑制，增长逐渐停止，于第八九天进入平台期，生长曲线呈S型。同时随着传代次数增加，细胞的生长状况有衰减的趋势，见表1，图5。

2.4 成骨细胞形态观察成骨诱导后细胞形态较不规则，高密度区的细胞形态由原来的梭形逐渐向多角形、鳞形或不规则形转化。7 d左右出现聚集生长，细胞之间连接致密，局部可出现交叉重叠、聚集成团。团块呈葵花状，并可逐渐增大，团块周边区域细胞密集程度高，细胞轮廓模糊，透光性差，见图6。

14-20 d后逐渐有砂粒样物质出现，并逐渐沉积于细胞周围形成钙化结节。空白对照组细胞未出现聚集和结节形成。
2.5 流式细胞仪检测结果流式细胞仪检测第3代成人骨髓间充质干细胞表面抗原，见图7。

2.6 碱性磷酸酶活性检测骨髓间充质干细胞在进行成骨诱导时，培养4 d后碱性磷酸酶活性即有所提高，碱性磷酸酶活性随培养时间而增高，并在第12天时达到高峰，各时间点成骨诱导组碱性磷酸酶活性均明显高于空白对照组，差异有显著性意义(P < 0.01)，见表2，图9。

2.7 碱性磷酸酶染色膜结合性碱性磷酸酶作用于底物甘油磷酸钠生成磷酸，再经一系列反应生成黑色硫化钴沉淀物，因此，碱性磷酸酶表达阳性的细胞为黑染的细胞。本实验成骨诱导组在2周后可见细胞的胞浆中出见黑色的细小颗粒，主要出现在细胞密集区，见图10，11，而空白对照组碱性磷酸酶染色为阴性。

2.8 茜素红染色茜素红属一种蒽醌类衍生物，它能与碳酸钙或磷酸钙结合成橘红色的复合物。诱导培养第3周，成骨细胞茜素红染色显示，钙化结节呈深红染色，结节散在分布，形态大小各异，见图12，13。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察。

时间及地点：于2010年11月至2011年2月在广州中医药大学第一附属医院中心实验室完成。

材料：骨髓来源为一名创伤性股骨颈骨折需要手术者，男性，年龄28岁。住院之前身体健康，无合并心脑血管和血液系统等严重原发性疾病。采集标本前经医院伦理委员会批准并征得患者知情同意。实验过程符合医学伦理学标准。

成人骨髓间充质干细胞成骨诱导实验用主要试剂与仪器：

成骨诱导液配制：按照所需要的浓度计算并称取适量的地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C做为成骨诱导剂，加入到含体积分数10%FBS的DMEM低糖培养液中，使其最终浓度分别为地塞米松10^-⁸ mol/L、β-甘油磷酸钠10^-² mol/L、维生素C 50 mg/L。抽滤除菌，4 ℃避光保存。

方法：

骨髓取材：患者经过腰麻后，在手术正式开始前取材。术者用16号骨穿针从髂前上棘处穿刺，连接经过抗凝的注射器(内含250 U/mL的肝素水1 mL)，抽取5.0-6.0 mL骨髓血，轻轻上下摇晃混匀，分别注入2支15 mL无菌离心管中，每支约3 mL，带入细胞培养室。

骨髓间充质干细胞的分离纯化及扩增：采用密度梯度离心法与贴壁筛选法相结合分离骨髓间充质干细胞，操作步骤如下：将骨髓血与等量PBS混匀，室温1 000 r/min离心5 min，弃上清及脂肪层，等量LG-DMEM重悬细胞。将细胞悬液紧贴管壁缓慢加入到预先装有等体积密度为1.077 g/mL的人淋巴细胞分离液(Ficoll)的离心管中，避免晃动，使细胞悬液缓慢叠加于Ficoll液面上。2 000 r/min离心25 min，小心取出离心管，共分4层，可见中间层为乳白色云雾状的单个核细胞层。吸取单个核细胞层于另一离心管中，加入PBS混匀。1 000 r/min离心3 min，弃上清，以细胞完全培养液(含体积分数10%FBS的LG-DMEM)悬浮细胞，吹打均匀。按5×10⁵/cm²密度接种于25 cm²细胞培养瓶，置37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。72 h后首次换液，弃取悬浮的非贴壁细胞，以后每两三天换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞生长状态，约80%贴壁细胞爬满培养瓶底时，可以传代，以0.25%胰蛋白酶消化，按照1∶3比例传代扩增。

MTT法检测不同代细胞的增殖活性：检测第1，2，4，6代骨髓间充质干细胞的增殖活性，以时间(d)为横轴，吸光度为纵轴绘制各代细胞生长曲线。具体步骤如下：取原代和第1，3，5代细胞，0.25%胰蛋白酶消化，制备细胞悬液。调整细胞密度为1×10⁴/cm²，接种于96孔培养板，培养板内每代细胞接种6孔，同时设6孔空白对照(只含培养液，无细胞)，每孔200 µL，总共接种9块培养板，放入CO₂培养箱中培养。从接种后24 h起，每天固定时间取出1块培养板，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 µL，放入培养箱孵育4 h后终止培养，小心吸弃孔内上清液。每孔加入150 µL 二甲基亚砜(DMSO)，振荡仪振荡10 min裂解细胞，使沉淀物充分溶解。选择492 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度(A值)，计算当日各代细胞的平均吸光度值，以x(_)±s表示。连续测定9 d，第3，6天时剩余培养板内细胞换液。

骨髓间充质干细胞的表面抗原鉴定：取生长旺盛的第3代骨髓间充质干细胞，达到80%-90%融合后进行鉴定。用0.25%胰蛋白酶消化细胞，1 000 r/min离心 3 min，弃上清，加PBS并轻轻吹打数次制成单细胞悬液，倒置显微镜下计数，并调整每个检测样本的细胞数为1×10⁶，分装至EP管中，1 000 r/min离心7 min，弃上清，于待检测的样本中各加入90 µL PBS，轻轻吹打成细胞悬液，分别加入以PE标记鼠抗人CD34、CD45、FITC标记鼠抗人CD90、CD44一抗及其同型对照各10 µL，充分吹打混匀，37 ℃避光孵育30 min后，测试前再加400 µL PBS至总体积500 µL，充分混匀，上流式细胞仪检测细胞CD34、CD90、CD44、CD45表面抗原表达。

骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的诱导方法：取生长旺盛的第2代的骨髓间充质干细胞，当细胞长满瓶底80%后，用0.25%胰蛋白酶消化，制备细胞悬液，以细胞密度1×10⁵/cm²左右接种于6孔培养板中，继续用细胞完全培养液(含体积分数10%FBS的LG-DMEM)培养。待细胞长满至孔底80%后，实验分为2组，分别为成骨诱导组和空白对照组，每块培养板各3孔。成骨诱导组更换成骨诱导液，空白对照组继续用完全培养液培养，每3 d换液1次。

成骨细胞碱性磷酸酶活性检测：按照碱性磷酸酶测定试剂盒说明进行操作，取成骨诱导组和空白对照组的骨髓间充质干细胞进行测定。分别于诱导后的第4，8，12，16天，取出培养板，消化离心，收集细胞，PBS洗涤2次。调整细胞密度至1×10⁵/cm²，在细胞中加入2% TritonX-100，4 ℃冰箱过夜。采用超声破碎细胞使其完全裂解，2 000 r/min离心，取50 µL上清液加于测定管内。按试剂盒操作说明依次加入试剂，用紫外分光光度计在520 nm波长处测定其吸光度值，计算碱性磷酸酶活性。

碱性磷酸酶染色：成骨诱导培养2周后取出1块6孔板，吸弃培养基，PBS清洗2遍，参照碱性磷酸酶染液说明书进行操作。用1 mL固定液固定3 min左右。吸弃固定液，滴加新鲜配制的底物应用液盖满孔底，37 ℃孵育15 min，水洗。趁湿用复染液(苏木精-伊红)染3 min左右，水洗，晾干，镜下观察。

茜素红染色：成骨诱导培养3周后取出1块6孔板，吸弃培养基，PBS清洗2遍。加入体积分数95%乙醇固定10 min，吸弃乙醇，蒸馏水清洗3遍。加入0.1%茜素红- Tris-HCl(pH 8.3)1 mL，37 ℃孵育30 min。吸弃茜素红溶液，PBS清洗2遍，镜下观察。

主要观察指标：倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞的形态学，MTT法检测不同代细胞的增殖活性，绘制生长曲线，流式细胞仪进行细胞表面抗原鉴定。检测成骨诱导后不同时间点碱性磷酸酶活性，碱性磷酸酶染色与茜素红染色结果。

统计学分析：由第一作者将全部有效数据用Excel 2007工作表建立数据库，应用SPSS 13.0软件进行统计学处理，所得数据以x(_)±s表示，计量资料采用t 检验， P < 0.05将被认为所检验的差异有显著性意义。

讨论

骨髓中除了存在造血干细胞外，还存在一种间充质干细胞(骨髓间充质干细胞)。它是来源于胚胎发育早期中胚层的一类多能干细胞。成人骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极少，约占细胞总数的十万分之一，因此必需通过体外分离和扩增来获得足够数量的骨髓间充质干细胞。这次实验中作者把密度梯度离心法与贴壁培养法相结合，根据不同细胞密度差别，用密度为1.077 g/mL的人淋巴细胞分离液(Ficoll)分离骨髓间充质干细胞，经梯度离心后，能有效地将绝大部分红细胞、粒细胞、脂肪细胞和血小板除去，获得纯度较高的单个核细胞。然后根据骨髓间充质干细胞与血系细胞贴壁性能差异，随换液弃除悬浮生长的血细胞。贴壁细胞主要是骨髓间充质干细胞，也可能混有单核细胞、淋巴细胞，每次传代用0.25%胰蛋白酶消化1 min左右，严格掌握消化酶的量和消化时间，保证骨髓间充质干细胞在短暂的作用时间内与培养瓶底分开，从而使骨髓间充质干细胞得到进一步纯化、形态更为均一。目前尚未发现成人骨髓间充质干细胞特异性标志物，骨髓间充质干细胞是通过一系列的表面抗原表型、形态结构和功能特性来综合鉴定的^[9]。实验对第3代骨髓间充质干细胞进行表型鉴定，选取CD34、CD45、CD90、CD44几种代表性的细胞表面抗原标记物，流式细胞仪分析显示，成人骨髓间充质干细胞相对特异性抗原CD44的阳性表达为94.81%，CD90的阳性表达为93.15%，而几乎不表达造血细胞表面抗原标志CD34、CD45，说明本实验分离培养的骨髓间充质干细胞纯度较高。

实验结果表明，体外培养的骨髓间充质干细胞在适当浓度的维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠作用下可分化为典型的成骨细胞。经过对第3代骨髓间充质干细胞进行成骨诱导后，随着时间延长，细胞由梭形逐渐变为多角形、菱形，出现聚集生长，细胞间连接紧密，并形成钙化结节，碱性磷酸酶染色、茜红素染色均呈阳性，并维持了较高的碱性磷酸酶活性。既往研究表明，在间充质干细胞向成骨细胞分化过程中，维生素C是体外培养细胞合成胶原的必备物质，并具有调控碱性磷酸酶活性和蛋白质合成的作用^[10-12]。β-甘油磷酸钠则可为骨组织在体外培养体系中产生沉淀提供所需的磷离子，促进生理性钙盐沉积和钙化。而地塞米松对骨细胞具有刺激和抑制的双重效应，通过影响细胞对血清中其他调控因子的敏感性而发挥作用，增强其受体与基因组靶序列的亲和性而调控分化细胞的基因表达，提高碱性磷酸酶的活性，促进向成骨细胞转化，是体外骨髓间充质干细胞向成骨分化的必需成分。但是地塞米松还能激活成人骨髓间充质干细胞表面的糖皮质激素受体，使其向脂肪细胞分化，从而减少了向成骨细胞分化的相对比例^[13-14]，这可能与激素性股骨头坏死的发病机制相关。

碱性磷酸酶活性的提高是骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的重要标志，常用细胞中该酶的活性高低来检测成骨细胞的存在和成骨细胞的分化成熟程度^[15]。本实验分别在诱导后的第4，8，12，16天，对成骨诱导组和空白对照组的细胞进行碱性磷酸酶活性测定。发现成骨诱导组碱性磷酸酶活性随时间而增加，在诱导后的第12天达到最高值，并且各时间点碱性磷酸酶活性均明显高于对照组。碱性磷酸酶染色阳性被认为是成骨细胞的特异征象，是骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的标志之一^[16-18]。本实验通过碱性磷酸酶染色亦观察到，在细胞群连接紧密、聚集成团的区域最早出现阳性表达，染色也较深，此处细胞密集，细胞分裂受

到接触抑制，细胞最早开始向成骨细胞分化。本实验细胞形态学观察与碱性磷酸酶活性测定的生化结果相一致。

总之，课题建立了一套稳定的成人骨髓间充质干细胞体外培养、鉴定及诱导成骨细胞分化体系，可以获得纯度较高、成骨分化能力较好的骨髓间充质干细胞，对骨髓间充质干细胞生物学特性等有了较为详尽的了解。课题做为骨组织工程的初期研发阶段，为下一步运用骨髓间充质干细胞与高分子多孔支架联合培养、构建组织工程人工骨修复股骨头坏死奠定了基础。

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成人骨髓间充质干细胞体外培养、鉴定与成骨诱导

In vitro cultivation, identification and osteoinduction of adult bone marrow mesenchymal stem cells

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