甘草黄酮对运动大鼠股四头肌病理学变化及FAT/CD36表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0085

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (4): 529-534.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0085

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甘草黄酮对运动大鼠股四头肌病理学变化及FAT/CD36表达的影响

王兆锋1，宫明明2，陈家群2，莫伟彬3

1钦州学院体育教学部，广西壮族自治区钦州市 535011；2贺州学院体育学院, 广西壮族自治区贺州市 542899；3广西师范大学体育学院，广西壮族自治区桂林市 541004

收稿日期:2017-10-26 出版日期:2018-02-08 发布日期:2018-02-08
通讯作者: 宫明明，贺州学院体育学院, 广西壮族自治区贺州市 542899
作者简介:王兆锋，男，1984年生，山东省临沂市人, 汉族，2010年广西师范大学毕业，讲师，从事运动生理学与训练研究。
基金资助:
广西自然科学资金面上项目(2015GXNSFAA139186)；广西高校科研项目(YB2014377)；“省部共建药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室”开放课题 (CMEMR2012-B04)

Effects of Glycyrrhiza Flavone on the pathological changes of quadriceps and expression of fatty acid translocase/CD36 in training rats

Wang Zhao-feng1, Gong Ming-ming2, Chen Jia-qun2, Mo Wei-bin3

1Department of Physical Education, Qinzhou University, Qinzhou 535011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Sport College of Hezhou University,Hezhou 542899, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3Sport School of Guangxi Normal University, Guilin 541004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2017-10-26 Online:2018-02-08 Published:2018-02-08
Contact: Gong Ming-ming, Sport College of Hezhou University, Hezhou 542899, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Wang Zhao-feng, Lecturer, Department of Physical Education, Qinzhou University, Qinzhou 535011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2015GXNSFAA139186; the Research Project of Guangxi Universities, No. YB2014377; the Open Project of the State Key Laboratory of Ministry-Province Medicinal Resources Chemistry and Drug Molecular Engineering, No. CMEMR2012-B04

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
甘草黄酮：是从特定品种甘草中提取的天然美白剂，它能抑制酪氨酸酶的活性，又能抑制多巴色素互变和DHICA氧化酶的活性，是一种快速、高效、绿色的美白祛斑化妆品添加剂。
FAT/CD36：属于B类清道夫受体家族，是一个Mr 88 000的膜糖蛋白和含有471个氨基酸残基单链跨膜蛋白。作为一个膜转运蛋白，在长链脂肪酸(long-chain fatty acid，LCFA)的转运和氧化代谢过程中发挥重要作用。

摘要
背景：研究发现，骨骼肌中的FAT/CD36通常是在运动的刺激作用下诱导骨骼肌收缩向细胞膜外转运，通过转运增加了细胞膜的FAT/CD36含量，从而增加了脂肪酸进入骨骼肌细胞的数量。
目的：观察运动前补充甘草黄酮大鼠股四头肌病理改变和脂肪酸转移酶FAT/CD36的影响。
方法：SD雄性大鼠30只，随机分为安静对照组、运动对照组、运动+甘草黄酮组。运动+甘草黄酮组按 10.0 mL/(kg • d)进行灌服给药，对照组给等量生理盐水；并且运动2组均进行为期6周的训练，速度为 19.3 m/min, 跑台坡度为5°。苏木精-伊红染色观察股四头肌的病理学变化；免疫组织化学法和Western Blot 法测定FAT/CD36的表达。
结果与结论：①光镜下观察运动对照组大鼠股四头肌纤维有肿胀、破裂和坏死的现象，运动+甘草黄酮组股四头肌纤维细胞排列较紧密，肌纤维边缘完整，与安静对照组比较无明显的差异；②免疫组织化学反应显示，运动对照组大鼠股四头肌FAT/CD36表达高于安静对照组(P < 0.05)，运动+甘草黄酮组大鼠股四头肌FAT/CD36表达略高于安静对照组，但低于运动对照组(P < 0.05)；③Western Blot检测结果与免疫组织化学具有相同的趋势；④结果说明，运动诱导增加了脂肪酸转运能量，出现积累的效应；FAT/CD36通过甘草黄酮协同作用下增加了脂肪酸的运转效率，从而维持骨骼肌脂质中的能量代谢稳态在一定的水平上，防止脂质代谢紊乱。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-2470-5534(王兆锋)

关键词: 甘草黄酮, 耐力训练, FAT/CD36

Abstract:

BACKGROUND: Fatty acid translocase/CD36 (FAT/CD36) in skeletal muscle has been proved to induce skeletal muscle contraction transport to the outer membrane stimulated by movement, which increases FAT/CD36 content in cellular membrane, further leading to more fatty acids into skeletal muscle cells.
OBJECTIVE: To observe the effects of Glycyrrhiza Flavone administration before exercise on the pathological changes of quadriceps and FAT/CD36 in rats.
METHODS: Thirty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into quiet, exercise and combination groups. The rats in the combination group were administrated with 10 mL/(kg•d) Glycyrrhiza Flavone, while the other two groups were given the same volume of normal saline. The rats in the exercise and combination groups were subjected to 6-week training, 19.3 m/minute at the treadmill slope of 5°. The pathological changes of quadriceps were observed by hematoxylin-eosin staining, and the expression level of FAT/CD36 was detected by immunohistochemistry and Western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Under light microscope, swollen, ruptured and necrotic muscle fibers in the quadriceps were found in the excise group. In the combination group, muscle fibers tightly arranged in the quadriceps with complete edge, which had no significant difference compared with the quiet group. Immunohistochemistry showed that the expression level of FAT/CD36 in the exercise group was significantly higher than that in the quiet group (P < 0.05); the expression level of FAT/CD36 in the combination group was slightly higher than that in the quiet group, but significnatly lower than that in the exercise group (P < 0.05), all above findings were consistent with the western blot assay. Our results indicate that exercise can induce fatty acid transport and accumulation. Due to the synergistic action of Glycyrrhiza Flavonoids, FAT/CD36 increases the efficiency of fatty acid transport, thereby maintaining lipid metabolism balance in the skeletal muscle, which avoids lipid metabolic disorders.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Drugs, Chinese Herbal, Sports Medicine, Resistance Training, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王兆锋，宫明明，陈家群，莫伟彬. 甘草黄酮对运动大鼠股四头肌病理学变化及FAT/CD36表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(4): 529-534.

Wang Zhao-feng1, Gong Ming-ming2, Chen Jia-qun2, Mo Wei-bin3. Effects of Glycyrrhiza Flavone on the pathological changes of quadriceps and expression of fatty acid translocase/CD36 in training rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(4): 529-534.

图/表（结果） 1

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引言

在运动训练中，骨骼肌是人体运动的动力，骨骼肌的收缩和舒张直接影响着运动员的成绩，而股四头肌则是骨骼肌的重要组成部分，在进行不同强度的负荷运动时，常常会产生运动性骨骼肌微损伤和延迟性肌肉酸痛，引起骨骼肌微结构的变化、肌肉组织的能量代谢信号通路和转录因子等方面的改变^[1-2]。而骨骼肌中的FAT/CD36通常是在运动的刺激作用下诱导骨骼肌收缩向细胞膜外转运，通过转运增加了细胞膜的FAT/CD36含量，从而增加了脂肪酸进入骨骼肌细胞的数量。此外，骨骼肌内水解的三酰甘油也能产生一定的脂肪酸，在此过程中脂肪酸转移酶(fatty acids translocase/CD36，FAT/CD36)是否存在于细胞膜线粒体上的结果尚未有结论^[3]。Smith等^[4]研究发现，在安静状态时，小鼠脂肪酸转移酶在线粒体中氧化量减少，但还有65%的脂肪酸被氧化，在些过程中是与肉碱脂酰转移酶1(CPT-I)共同完成脂肪酸的线粒体转运，也认为是通过运动诱导FAT/CD36向线粒体膜进一步的转运，增加了骨骼肌线粒体膜FAT/CD36的含量，继而增加骨骼肌中脂肪酸氧化。然而在运动量较大时，在甘草黄酮的干预下，骨骼肌脂肪代谢中脂肪酸氧化代谢的调控发生如何的作用机制是本课题研究的关键。

甘草是一种具有味甘、性平和解毒等作用的中草药，其有效成分黄酮类化合物——甘草黄酮(glycyrrhiza flavonoids，GF)。对机体具有抗氧化能力、抗肿瘤、降血糖和保护机体各器官系统等作用^[5-6]。该课题组在前期的实验研究还表明，甘草黄酮的干预能够改善运动大鼠血脂代谢、调控脂肪组织中酶的水平和下调脂肪组织视黄醇结合蛋白4 (RBP4)等作用^[7-8]。研究通过运动前补充甘草黄酮对力竭性运动大鼠股四头肌病理学变化及FAT/CD36表达来观察骨骼肌的损伤程度和机体能量调控的状况，为进一步深入研究甘草黄酮提供实验支持和理论依据。

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材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2016年7月在钦州学院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SD雄性健康大鼠30只，体质量(195.5±8.6) g。由广西医科大学实验教学部动物房提供(SPF级，SCXK桂2015-0002)。动物房温度标准(24±3) ℃，相对湿度为45.3%-70.5%，在饲养过程中大鼠均自由饮水和摄食，以基础饲料饲养。

1.3.2 实验用主要药物与试剂甘草黄酮(GF)提取物主要购买于西安通泽生物科技有限公司，批号20140304，纯度达到95.8%，测定股四头肌免疫组织化学用的FAT/CD36一抗体(批号：2015YU012)；Western Blot 法检测GAPDH和FAT/CD36抗体为鼠单抗(一抗体，批号2015-TE-02) ；羊抗鼠IgG-Biotin (二抗体，批号ZLE067)；BCA Protein Assay Kit蛋白定量试剂盒(批号AK098)；考马斯亮蓝(批号EY15161-7)均为上海生工生物工程有限公司产品。

1.3.3 实验用主要仪器 ZH-PT型动物跑台(正华，淮北正华生物仪器设备有限公司)；K241R型离心机(英国森特恩 Centurion公司); Keta M型化学发光系统(美国威泰克Wealtec公司)；透射电子显微镜(日立，H-7500)；凝胶成像分析系统(Dolphin-Doc，美国威泰克Wealtec公司)；Image-pro Plus 5.1图像分析系统(USA, MEDIA CYBERNETICS)；恒温摇床(HT-3112A，上海赫田科学仪器有限公司)；紫外可见分光光度计(UV-1800A，北京美析仪器)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及给药量将大鼠随机分为3组，即安静对照组、运动对照组和运动+甘草黄酮组。运动+甘草黄酮组大鼠在运动前30 min灌胃甘草黄酮，给药剂量按照2010版《中国药典》中人的用量，折算为大鼠用量，灌服剂量为200 mg/kg，对照组灌服等量生理盐水，连续灌服给药6周，1次/d，直到实验结束。

1.4.2 动物模型与取材运动对照组及运动+甘草黄酮组大鼠进行适应性运动1周后(跑台坡度为0°，速度为 15 m/min，训练时间为30 min/d)，接着进行为期6周的耐力运动训练。训练模型按Bedford^{[9]进行设计并略加调整，大鼠运动速度为19.3 m/min(相当于76%的VO_{2 max})，跑台坡度为5°，每天训练1次，每次训练的时间不少于65 min，6 d/周，对于短时间内不运动的大鼠，休息5 min后，再进行耐力训练，使训练时间在65 min以上。6周训练结束后，大鼠禁食12 h以上，于次日8时经20%乌拉坦溶液(3 mL/kg)麻醉，并迅速取出大鼠股四头肌并称质量，用预冷生理盐水清洗，滤纸吸干，包裹后放入-80 ℃冰箱中待测。}

1.4.3 光镜观察股四头肌样本的制备从-80 ℃冰箱中取股四头肌组织1块(每组随机取两只即可)，放入40 g/L中性多聚甲醛固定24 h，PBS 清洗(清洗3次，每次5 min)，再按常规进行梯度乙醇脱水(1 min)、二甲苯透明(1 min)、常规石蜡包埋包埋和组织切片(切片厚度为8-10 μm)；对切片进行脱蜡、复水、heidenhain苏木精染色(5 min)、分色处理和中性树胶封固等步骤进行苏木精-伊红染色)，然后拍照观察组织细胞学分析。

1.4.4 免疫组织化学染色将上述制备的股四头肌组织切片，脱蜡、复水、抗原修复、双氧水封闭；滴加一抗(抗体稀释度均为1∶100)，4 ℃孵育过夜，PBS浸洗(4次，每次5 min) ，滴加二抗(即用型)30 min；室温DAB显色，显微镜下观察，观察目标出现阳性后，蒸馏水洗终止反应；苏木精复染，盐酸乙醇分化，氨水返蓝；脱水透明及中性树胶封固。

染色后，在光学显微镜下观察，采用图像采集系统读片并拍照。将采集的图像应用Image-pro Plus 5.1图像分析系统进行分析。所得数据作免疫组织化学染色阳性信号累积吸光度(IOD)，以累积吸光度值作为表达定量标准，即累积吸光度=平均吸光度×阳性面积。

1.4.5 Western Blot法检测FAT/CD36蛋白表达水平取股四头肌组织150 mg，经剪碎后液氮研磨，加裂解液充分裂解后，离心，取上清液。BCA法进行蛋白定量。取50 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜(电流14 V，100 mA，转印2 h)、封闭过夜后转入PVDF膜上。加GAPDH和FAT/CD36抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。加二抗(羊抗鼠IgG-Biotin，1∶1 000)孵育1 h，PBST 洗膜，化学发光法(ECL)显示，并进行曝光、显影和定影后用凝胶成像系统对FAT/CD36与β-Actin蛋白条带的灰度扫描并用比值表示。

1.5 主要观察指标 ①大鼠组织病理形态学观察；②大鼠股四头肌FAT/CD36表达。

1.6 统计学分析对实验结果的数据均用SPSS 20.0统计，计量资料用x(_)±s表示，采用单因素方差分析，组间比较采用多重比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

甘草是一味中药，为豆科植物甘草、胀果甘草和光果甘草的干燥根茎，主要分布于中国东北、西北和华北地区。甘草黄酮类成分的化学分子结构是是具有C6-C3-C6的基本母核的天然产物^[10-11]。但到目前为止，从甘草中分离出来的有150多种化合物，可分为甘草黄酮醇、黄酮类、三萜皂苷、糖类、异黄酮类、查尔酮类和双氢查尔酮类等。其中黄酮类化合物和三萜皂苷是其主要有效活性成分^[11-12]。甘草黄酮类化合物根据各类黄酮的化合物结构不同，其药理作用也有所不同。甘草属植物中的黄酮类成分具有抑菌、抗肿瘤、抗真菌、抗病毒、抗氧化、保肝等药理作用^[10]。景晶等^[13]研究发现，甘草总黄酮具有抗硫代乙酰按诱导大鼠慢性肝纤维化的作用，其作用主要是下调肝脏中转化生长因子-和半胱天冬酶-3的蛋白表达。张佳莹等^[14]研究发现，甘草黄酮能够保护LPS诱导小鼠的急性肺损伤，其结果显示甘草黄酮能够降低了小鼠白细胞介素Ⅰ，白细胞介素6和肿瘤坏死因子α等炎症因子水平，表明甘草黄酮对急性肺损伤小鼠具有较好的抗炎作用。近年来有研究者发现，甘草黄酮及其有效成分能够调节糖尿病大鼠血脂代谢紊乱、抗氧化能力、抗动脉粥样硬化和降糖的作用，对大鼠的多个脏器具有保护作用^[15-18]。阳毅等^[19]通过运动前补充甘草黄酮观察力竭运动后大鼠肝组织抗氧化能力和肝细胞凋亡调控基因P53表达发现，补充甘草黄酮对力竭运动大鼠有抗自由基氧化能力、减轻脂质过氧化和抑制肝细胞的凋亡，从而达到保护肝脏的作用。杨衍滔等^[20]研究发现，通过对大鼠灌注甘草黄酮后进行大强度运动训练，能够降低大鼠的睾酮、血脂、皮质酮水平和骨骼肌内的脂肪氧化能力，从而提高了大鼠的运动能力。

FAT/CD36属于B类清道夫受体家族，是一个M_r88 000的膜糖蛋白和含有471个氨基酸残基单链跨膜蛋白。是由长细胞外结构和两个短的细胞内片段的两个跨膜结构域组成，胞外段是质膜内的疏水区、脯氨酸半胱氨酸和N末端连接的糖基化位点，而在胞内结构域的N末端和C末端都棕搁酰化的半胱氨酸，参与脂筏内蛋白的定位过程，值得注意的是FAT/CD36在细胞膜内还存在2个较短的自由端^[21-24]。Stewart等^[25]研究证明，人体中FAT/CD36基因的的结构，最终是由15个外显子编码构成，主要是分布于人体染色体的7q11.2的区域，长32 kb的范围之内。一般认为，不同的配体与FAT/CD36相结合后，能够激活相关的信号分，从而调控机体的生理病理过程。FAT/CD36是一种广泛表达于骨骼肌、脂肪、小肠、心肌、平滑肌细胞和脾脏等多种组织细胞中，是脂肪酸跨膜转运的关键转运体，具有转运、摄取机体的脂肪酸能力和识别细胞炎症反应的关键蛋白^[26-28]。

张艳艳等^[29]通过对6周龄雄性C57BL/6J小鼠进行为期14周的普通饮食组和高脂饮食后发现，高脂饮食能增强C57BL/6J 小鼠脂肪组织的FAT/CD36 及炎症/趋化因子的表达，促进巨噬细胞在脂肪组织的浸润。Sundaresan 等^[30]研究发现，FAT/CD36在机体内可以通过不同的机体部位调控感测营养物质，这些调控机制在长链脂肪酸特别敏感，能够诱导触发机体内其他器官信号调控反应。Liw等^[31]研究发现，FAT/CD36能够调节机体的能量三磷酸腺苷结合转运体和上调胆固醇和脂肪酸外流。FAT/CD36在心肌细胞中受PPARa的表达调控，特别是在机体内的骨骼肌中受到突变时，PPARa能够很明显的降低了FAT/CD36在骨骼肌中的表达调控^[32-35]。此外，最新研究发现，FAT/CD36在机体内受到长链脂肪酸的抑制，从而影响了机体内的脂肪酸代谢的调节，但FAT/CD36受到特异性介导时，能够抑制肝脏脂肪酸的摄取和三酰甘油在肝脏中的积累^[36-38]。因此，FAT/CD36在机体内的表达调节对机体细胞内代谢物质的运输及利用发挥着重要的调控作用。

目前关于运动中影响FAT/CD36表达的观点尚未保持一致，这可能是与运动的时间、强度和干预等运动因素有关。Hoshino等^[39]研究发现，高强度间歇训练能够提高了骨骼肌脂肪酸氧化代谢能力，但与FAT/CD36表达量无关。Hrometz等^[40]研究发现，长时间的游泳训练，能够增加大鼠脂肪组织FAT/CD36的表达。Talanian等^[41]研究发现，6周的大强度训练，女性骨骼肌FAT/CD36的活性显著增加。齐洁等^[42]研究发现，高脂运动大鼠FAT/CD36的表达低于高脂饮食大鼠。Yoshida等^[43]研究发现，长时间的运动诱导了FAT/CD36的高表达，致使小鼠骨骼肌中脂肪酸氧化速率增加了44%，加大了小鼠的能量消耗，而线粒体密度及线粒体相关酶的含量均未发生变化。本研究发现，在病理状态下，运动对照组大鼠股四头肌FAT/CD36表达高于安静对照组。而这时候安静组大鼠股四头肌纤维形态规整，排列整齐，大小较一致，无结缔样组织，运动对照组大鼠股四头肌纤维有肿胀、破裂和坏死的现象，进一步通过Western Blot 法检测还发现，运动对照组大鼠股四头肌FAT/CD36蛋白表达高于安静对照组。提示，长时间的耐力训练引起FAT/CD36表达升高，这与Smith和Jain等^[4，44]研究的相一致。认为运动诱导FAT/CD36向线粒体膜进一步的转运，加强了骨骼肌中脂肪酸转运能量代谢效率的提高，但随着长时间的运动，出现积累的效应，影响了脂质代谢的调控，引起脂质代谢紊乱和自由基的产生，加大了肌肉组织的病变。通过补充甘草黄酮后发现，在病理状态下，运动+甘草黄酮组大鼠股四头肌FAT/CD36表达略高于安静组，但低于运动对照组。从病理形态观察还发现，运动+甘草黄酮组股四头肌纤维细胞排列较紧密，肌纤维边缘完整，与安静组比较无明显的差异。通过Western Blot 法检测还发现，运动+甘草黄酮组大鼠股四头肌FAT/CD36蛋白表达高于安静组，但低于运动组。这与Lee等^[45]研究的结果一致。认为FAT/CD36可能通过甘草黄酮协同增加脂肪酸的运输效率，从而维持骨骼肌脂质中的能量代谢稳态在一定的水平上，从而保护了股四头肌细胞膜的完整性及流动性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

甘草黄酮对运动大鼠股四头肌病理学变化及FAT/CD36表达的影响

Effects of Glycyrrhiza Flavone on the pathological changes of quadriceps and expression of fatty acid translocase/CD36 in training rats

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[1]	杨雪清，程亮. 篮球运动员躯干和下肢等速肌力分析[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(12): 1835-1840.
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