电针调控少弱精子症模型大鼠“下丘脑-垂体-睾丸轴”的作用机制

doi:10.12307/2025.751

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (26): 5563-5571.doi: 10.12307/2025.751

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电针调控少弱精子症模型大鼠“下丘脑-垂体-睾丸轴”的作用机制

赵振宁1，2，3，李开颖1，2，3，杨楠1，2，3，孙文静1，2，3，魏晓歌1，2，3，穆静1，马惠昇1，2，3

宁夏医科大学，1中医学院，2宁夏少数民族医药现代化教育部重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004；3宁夏区域高发病中西医结合防治研究重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2024-06-29 接受日期:2024-08-29 出版日期:2025-09-18 发布日期:2025-02-25
通讯作者: 马惠昇，博士，教授，宁夏医科大学，中医学院，宁夏少数民族医药现代化教育部重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004；宁夏区域高发病中西医结合防止研究重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004 共同通讯作者：穆静，博士，副教授，宁夏医科大学中医学院，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:赵振宁，男，1998年生，宁夏回族自治区中卫市人，汉族，宁夏医科大学在读硕士，主要从事筋伤疾病基础与临床研究。
基金资助:
宁夏回族自治区重点研发项目(2021BEG02041)，项目名称：针灸疗法调控“下丘脑-垂体-睾丸轴”治疗男性生殖功能障碍的腧穴配伍循证评价及临床研究，项目参与人：马惠昇

Regulatory mechanism of electroacupuncture on hypothalamic-pituitary-testicular axis in oligospermic rats

Zhao Zhenning1, 2, 3, Li Kaiying1, 2, 3, Yang Nan1, 2, 3, Sun Wenjing1, 2, 3, Wei Xiaoge1, 2, 3, Mu Jing1, Ma Huisheng1, 2, 3

1College of Traditional Chinese Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2Ministry of Education Key Laboratory of Modernization of Traditional Medicine for Ethic Minorities in Ningxia, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 3Ningxia Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of High-Incidence Diseases, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2024-06-29 Accepted:2024-08-29 Online:2025-09-18 Published:2025-02-25
Contact: Ma Huisheng, PhD, Professor, College of Traditional Chinese Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Ministry of Education Key Laboratory of Modernization of Traditional Medicine for Ethic Minorities in Ningxia, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Ningxia Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of High-Incidence Diseases, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China Co-corresponding author: Mu Jing, PhD, Associate professor, College of Traditional Chinese Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Zhao Zhenning, Master’s candidate, College of Traditional Chinese Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Ministry of Education Key Laboratory of Modernization of Traditional Medicine for Ethic Minorities in Ningxia, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Ningxia Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of High-Incidence Diseases, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
Key R&D project of Ningxia Hui Autonomous Region, No. 2021BEG02041 (to MHS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
少弱精子症：是指每次射精的精子总数少于39×106个，精子密度低于15×109 L-1，前向运动精子低于32%的病症。
下丘脑-垂体-睾丸轴：指负责调控男性生殖功能的一个神经内分泌系统，主要由下丘脑、垂体、睾丸3个部分组成。

背景：电针能够通过刺激下丘脑、垂体、睾丸中的激素合成与释放治疗少弱精子症，但其作用机制复杂，并且电针疗效与穴位配伍思路关系密切。
目的：探索电针疗法能否通过调节血清相关性激素水平改善下丘脑-垂体-睾丸轴功能状态，进而治疗腺嘌呤诱导的大鼠少弱精子症。
方法：采用随机数字表法将50只成年雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、电针组、左卡尼汀组、非经非穴组，每组10只。除空白组外，其他4组大鼠给予200 mg/(kg•d)腺嘌呤灌胃，连续灌胃28 d，建立少弱精子症模型。造模结束后，电针组选取中极、关元、足三里、三阴交四穴给予电针治疗，非经非穴组选取非穴点3处进行电针治疗，左卡尼汀组给予左卡尼汀灌胃治疗，1次/d，持续治疗28 d。治疗结束后，检测各组大鼠肾脏和睾丸脏器系数，精子数量、存活率和活力率，肾脏与睾丸组织病理形态学变化，血清中睾酮、促性腺激素释放激素、卵泡刺激素、黄体生成素、雌二醇、抑制素 B、泌乳素水平。
结果与结论：①模型组大鼠肾脏脏器系数高于空白组、电针组、左卡尼汀组(P < 0.05)，非经非穴组大鼠肾脏脏器系数高于电针组(P < 0.05)，各组大鼠睾丸脏器系数比较差异无显著性意义(P > 0.05)；②与空白组比较，模型组大鼠精子数量、精子存活率与活力率均降低(P < 0.05)；与模型组比较，电针组、左卡尼汀组大鼠精子数量、精子存活率与活力率均升高(P < 0.05)；非经非穴组大鼠精子数量、精子存活率与活力率均低于电针组(P < 0.05)；③苏木精-伊红染色结果显示，模型组大鼠肾脏与睾丸组织损伤严重，电针组和左卡尼汀组大鼠肾脏与睾丸组织损伤程度轻于模型组，非经非穴组大鼠肾脏与睾丸组织损伤程度重于电针组；④与空白组比较，模型组大鼠血清中睾酮、促性腺激素释放激素、抑制素B水平均降低(P < 0.05)，卵泡刺激素、黄体生成素、雌二醇、泌乳素水平均升高(P < 0.05)；与模型组比较，电针组、左卡尼汀组大鼠血清中睾酮、促性腺激素释放激素、抑制素B水平均升高(P < 0.05)，卵泡刺激素、黄体生成素、雌二醇、泌乳素水平均降低(P < 0.05)；与非经非穴组比较，电针组大鼠血清中睾酮、促性腺激素释放激素、抑制素B水平均升高(P < 0.05)，卵泡刺激素、黄体生成素、雌二醇、泌乳素水平均降低(P < 0.05)；⑤结果表明，电针“中极、关元、足三里、三阴交”4穴可通过调控“下丘脑-垂体-睾丸轴”功能状态有效治疗大鼠少弱精子症。
https://orcid.org/0009-0001-2348-666X(赵振宁)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 电针, 少弱精子症, 下丘脑-垂体-睾丸轴, 腺嘌呤, 性激素, 工程化组织构建

Abstract: BACKGROUND: Electroacupuncture can treat oligoasthenospermia by stimulating hormone synthesis and release in the hypothalamus, pituitary gland and testis, but its mechanism is complex, and the efficacy of electroacupuncture is closely related to the idea of acupoint compatibility.
OBJECTIVE: To explore whether electroacupuncture therapy can improve the function status of hypothalamic-pituitary-testicular axis by adjusting the level of serum related sex hormones in rats, so as to treat adenine-induced oligoasthenospermia in rats.
METHODS: Fifty adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into blank, model, electroacupuncture, L-carnitine, and non-meridian and non-acupuncture point groups, with 10 rats in each group. Except for the blank group, the rats in the other four groups were given 200 mg/(kg·d) adenine via intragastric administration for 28 days to establish oligoasthenospermia models. After modeling, the rats in the electroacupuncture group were given electroacupuncture treatment at Zhongji, Guanyuan, Zusanli and Sanyinjiao acupoints, the non-acupoint group was selected for electroacupuncture treatment at three non-acupoint points, and the rats in the L-carnitine group were given oral infusion of L-carnitine, once daily, for 28 continuous days. After treatment, the kidney and testicular organ coefficients were calculated. Sperm count, survival rate and motility rate were determined. Pathological morphological changes of kidney and testicular tissues were observed. Serum sex hormones testosterone, gonadotropin releasing hormone, follicle stimulating hormone, luteinizing hormone, estradiol, statin B and prolactin levels were detected in rats of each group.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The renal organ coefficient in the model group was higher than that in the blank, electroacupuncture and L-carnitine groups (p < 0.05), the renal organ coefficient in the non-acupoint group was higher than that in the electroacupuncture group (P < 0.05), and there was no significant difference in the testicular organ coefficient among all groups (P > 0.05). (2) Compared with the blank group, sperm count, survival rate and motility rate were decreased in the model group (P < 0.05); compared with the model group, sperm count, survival rate and motility rate were increased in the electroacupuncture group and L-carnitine group (P < 0.05); compared with the non-acupoint group, sperm count, survival rate and motility rate were higher in the electroacupuncture group (P < 0.05). (3) Hematoxylin-eosin staining results indicated that the kidney and testicular tissues of rats in the model group were severely damaged, while damage to kidney and testicular tissues was less in the electroacupuncture group and L-carnitine group compared with the model group, but severer in the non-acupoint group than the electroacupuncture group. (4) Compared with the blank group, the levels of testosterone, gonadotropin releasing hormone, and inhibin B in the serum of rats in the model group were decreased (P < 0.05), and the levels of follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone, estradiol, and prolactin were increased (P < 0.05). Compared with the model group, the levels of testosterone, gonadotropin-releasing hormone, and inhibin B in the serum of rats in the electroacupuncture group and L-carnitine group were increased (P < 0.05), and the levels of follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone, estradiol, and prolactin were decreased (P < 0.05). Compared with the non-acupoint group, the levels of testosterone, gonadotropin-releasing hormone, and inhibin B in the serum of the rats in electroacupuncture group were increased (P < 0.05), and the levels of follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone, estradiol, and prolactin were decreased (P < 0.05). To conclude, electroacupuncture at Zhongji, Guanyuan, Zusanli, and Sanyinjiao acupoints can effectively treat oligoasthenospermia by regulating the functional state of the hypothalamic-pituitary-testicular axis in rats.

Key words: electric acupuncture, oligoasthenospermia, hypothalamic-pituitary-testis axis, adenine, sex hormone, engineered tissue construction

中图分类号:

赵振宁, 李开颖, 杨楠, 孙文静, 魏晓歌, 穆静, 马惠昇, . 电针调控少弱精子症模型大鼠“下丘脑-垂体-睾丸轴”的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(26): 5563-5571.

Zhao Zhenning, , , Li Kaiying, , , Yang Nan, , , Sun Wenjing, , , Wei Xiaoge, , , Mu Jing, Ma Huisheng, , . Regulatory mechanism of electroacupuncture on hypothalamic-pituitary-testicular axis in oligospermic rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(26): 5563-5571.

图/表（结果） 7

2.1 造模后大鼠一般状态观察造模结束后，非经非穴组与模型组大鼠精神萎靡，反应迟钝，毛色泛黄，饮食量少，尿量多，大便清稀不成型；电针组、左卡尼汀组大鼠较模型组精神状态好转，反应较灵敏，毛色泛黄但较光滑，饮食量恢复，尿量较模型组少且无明显异味，大便成型。
苏木精-伊红染色结果显示，空白组大鼠生精小管管腔呈空腔状态，排列清晰质密，精子细胞完整且数量较多，呈现正常睾丸组织形态；与空白组比较，模型组大鼠睾丸组织生精小管管腔较小，排列松散且不规则，生精细胞结构异常，排列紊乱，出现部分坏死，见图1。苏木精-伊红染色结果显示，空白组大鼠肾脏组织肾小球形态规则，肾小管排列整齐，未见明显病理改变；模型组大鼠肾脏组织肾小球形态异常，肾小管管腔不规则，肾间质有大量炎性细胞浸润和纤维化，见图1。
2.2 实验动物数量分析除去验证造模成功的6只大鼠，剩余50只大鼠全部进入结果分析。
2.3 治疗结束后各组大鼠脏器系数比较见表1。

2.3.1 肾脏脏器系数模型组大鼠肾脏脏器系数高于空白组(P < 0.001)，电针组、左卡尼汀组大鼠肾脏脏器系数低于模型组(P < 0.001)，非经非穴组大鼠肾脏脏器系数高于电针组(P < 0.05)，电针组大鼠肾脏脏器系数与左卡尼汀组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2。
2.3.2 睾丸脏器系数 5组大鼠睾丸脏器系数比较差异无显著性意义(P > 0.05)，原因可能是治疗周期较短未体现出统计学差异。
2.4 治疗结束后大鼠精液质量分析结果见表2。
2.4.1 精子数量模型组大鼠精子数量低于空白组(P <

0.001)，电针组、左卡尼汀组大鼠精子数量均高于模型组(P < 0.01，P < 0.05)，非经非穴组大鼠精子数量低于电针组(P < 0.01)，电针组大鼠精子数量与左卡尼汀组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。
2.4.2 精子存活率模型组大鼠精子存活率低于空白组(P < 0.001)，电针组和左卡尼汀组大鼠精子存活率均高于模型组(P均< 0.001)，非经非穴组大鼠精子存活率低于电针组(P < 0.001)，电针组大鼠精子存活率与左卡尼汀组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。
2.4.3 精子活力率模型组大鼠精子活力率低于空白组(P < 0.001)，电针组和左卡尼汀组大鼠精子活力率均高于模型组(P均< 0.001)，非经非穴组大鼠精子活力率低于电针组(P < 0.05)，电针组大鼠精子活力率与左卡尼汀组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。
2.5 治疗结束后大鼠血清性激素水平比较见表3。

2.5.1 血清睾酮水平模型组大鼠血清睾酮水平低于空白组(P < 0.001)，电针组和左卡尼汀组大鼠血清睾酮水平均高于模型组(P均< 0.001)，非经非穴组大鼠血清睾酮水平低于电针组(P < 0.01)，电针组大鼠血清睾酮水平与左卡尼汀组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图6。
2.5.2 血清卵泡刺激素水平模型组大鼠血清卵泡刺激素水平高于空白组(P < 0.001)，电针组和左卡尼汀组大鼠血清卵泡刺激素水平均低于模型组(P均< 0.01)，非经非穴组大鼠血清卵泡刺激素水平高于电针组(P < 0.01)，电针组大鼠血清卵泡刺激素水平与左卡尼汀组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图7。
2.5.3 血清黄体生成素水平模型组大鼠血清黄体生成素水平高于空白组(P < 0.001)，与模型组对比，电针组和左卡尼汀组大鼠血清黄体生成素水平均低于模型组(P均< 0.001)，非经非穴组大鼠血清黄体生成素水平高于电针组(P < 0.001)，电针组大鼠血清黄体生成素水平与左卡尼汀组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图8。
2.5.4 血清促性腺激素释放激素水平模型组大鼠血清促性腺激素释放激素水平低于空白组(P < 0.001)，电针组和左卡尼汀组大鼠血清促性腺激素释放激素水平均高于模型组(P < 0.001)，非经非穴组大鼠血清促性腺激素释放激素水平低于电针组(P < 0.001)，电针组大鼠血清促性腺激素释放激素水平与左卡尼汀组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图9。
2.5.5 血清泌乳素水平模型组大鼠血清泌乳素水平高于空白组(P < 0.001)，电针组和左卡尼汀组大鼠血清泌乳素水平均低于模型组(P均< 0.01)，非经非穴组大鼠血清泌乳素水平高于电针组(P < 0.01)，电针组大鼠血清泌乳素水平与左卡尼汀组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图10。
2.5.6 血清雌二醇水平模型组大鼠血清雌二醇水平高于空白组(P < 0.001)，电针组和左卡尼汀组大鼠血清雌二醇水平均低于模型组(P均< 0.01)，非经非穴组大鼠血清雌二醇水平高于电针组(P < 0.05)，电针组大鼠血清雌二醇水平与左卡尼汀组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图11。
2.5.7 血清抑制素B水平模型组大鼠血清抑制素B水平低于空白组(P < 0.01)，电针组和左卡尼汀组大鼠血清抑制素B水平均高于模型组(P均< 0.05)，非经非穴组大鼠血清抑制素B水平低于电针组(P < 0.05)，电针组鼠与左卡尼汀组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图12。
2.6 治疗结束后大鼠肾脏组织形态观察结果苏木精-伊红染色结果显示，空白组大鼠肾脏组织肾小球形态规则，肾小管排列整齐，未见明显病理改变；模型组大鼠肾脏组织肾小球形态异常，肾小管管腔不规则，肾间质有大量炎性细胞浸润和纤维化；与模型组相比，电针组和左卡尼汀组大鼠肾脏组织损伤明显减轻，可见大量形态较规则的肾小球，与肾小囊略有分离，肾小管与周围肾组织有明显间隙；与电针组比较，非经非穴组大鼠肾脏组织损伤较重，可见部分形态较规则的肾小球，肾小球周围存在中度炎性细胞浸润和纤维化，见图13。
2.7 治疗结束后大鼠睾丸组织形态学观察结果见图14。
苏木精-伊红染色结果显示，空白组大鼠睾丸组织结构完整，形态正常，生精细胞和生精小管排列规则，腔

内可见大量成熟精子；模型组大鼠睾丸组织损伤严重，大量生精细胞出现萎缩、变性、破裂，细胞形态不规则、排列松散且紊乱，腔内成熟精子大量减少；与模型组相比，电针组和左卡尼汀组大鼠睾丸组织损伤明显减轻，生精细胞形态规则、排列整齐，腔内成熟精子数量增多；与电针组比较，非经非穴组大鼠睾丸组织损伤较重，生精细胞排列较整齐但细胞间距较大，仍有部分细胞萎缩、破裂，成熟精子细胞较少。

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引言

少弱精子症分为“少精子症”和“弱精子症”，主要表现为睾丸中精子的数量和活力出现异常[1]，是男性不育症的常见发病类型之一，发病率约为46%[2]，严重影响了男性生殖健康，已引起了医学界的广泛关注。下丘脑-垂体-睾丸轴是男性生殖调控的主要通路，受到一系列性激素调控，其主要作用为调控性腺分化和成熟，维持男性正常生殖功能，包括睾丸内精子的发生与成熟[3]。下丘脑-垂体-睾丸轴功能紊乱会导致睾丸分泌睾酮减少，从而引起睾丸内精子数量减少和质量降低[4]。因此，治疗少弱精子症以调控下丘脑-垂体-睾丸轴发挥正常功能为主要治疗手段，达到维持相关内分泌激素水平平衡为目的，从而增加精液中精子数量、增强精子活性。
少弱精子症属于中医“无子”范畴[5]，基本病机为肾精亏虚、肾阳不足，因此，治疗少弱精子症应以补肾阳、益肾精为主。中医认为肾精的充足是人正常发育的基础，肾精化生肾气，肾气盛则天癸至。天癸受到先天之精与后天之精的滋养，藏于肾中，既促进了生殖功能的正常发育，又能够弥补肾精亏损，修复衰退的生殖功能。下丘脑-垂体-睾丸轴调控的多种性激素调节机体生长发育的功能与“天癸”相似[6]，有研究发现下丘脑-垂体-睾丸轴功能紊乱可由肾阳虚引起[7]。“中极”“关元”“足三里”“三阴交”为中医治疗生殖疾病常用穴位，其配伍能够补益肾精、肾阳，推进“天癸”的到来，体现了弥补先天、培补后天的思想，但电针“中极”“关元”“足三里”“三阴交”能否通过调控下丘脑-垂体-睾丸轴维持相关激素水平平衡，还有待实验验证。
课题组前期研究发现针刺治疗少弱精子症的疗效明显[8-9]，但不同配穴方法的针刺治疗对“下丘脑-垂体-睾丸轴”的影响程度以及对少弱精子症治疗效果有明显差异。此次实验拟建立腺嘌呤诱导的少弱精子症大鼠模型，采用远近配穴法，选取中极、关元、足三里、三阴交4个穴位，以电针为治疗方法，用左卡尼汀组以及非经非穴组作对比，探究电针对少弱精子症大鼠下丘脑-垂体-睾丸轴及相关激素水平的影响，为临床电针治疗少弱精子症提供不同思路、不同配穴方法的理论依据和实际论证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2023年 3-5月在宁夏医科大学实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 主要仪器电刺激仪(华佗牌，型号：SDZ-Ⅱ)，一次性使用无菌针灸针(汉医牌，型号：0.25 mm×13 mm)，包埋机(武汉俊杰电子有限公司，型号：JB-P5)，石蜡切片机(德国徕卡仪器有限公司，型号：LEICARM22445)，切片扫描仪(德国徕卡仪器有限公司，型号：Aperio LV1)，电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，型号：ME203E/02)，-80 ℃低温冰箱(青岛海尔，型号：V512746)，离心机(北京离心机厂，型号：LDZ5-2)，CASA计算机辅助精液分析(南宁松景天伦生物科技有限公司，型号：VICOS-SPERM)，酶标仪(Rayto，型号：RT-6100)。
1.3.2 主要试剂苏木精-伊红染液(珠海贝索生物技术有限公司，货号：BA-4041)，酶联免疫吸附法检测试剂盒(江莱生物，货号：JL13251，JL11473，JL11525，JL12505，JL13256)，腺嘌呤(北京索莱宝生物科技有限公司，货号：A8330)，左卡尼汀口服液(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，货号：H19990372)，中性树胶(北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9555)。
1.3.3 实验动物选用成年雄性SD大鼠56只，8周龄，SPF级，体质量180-220 g，购自宁夏医科大学动物实验中心，许可证号：SYXK(宁)2020-0001。所有动物均饲养于宁夏医科大学动物实验中心，实验室温度为 22-24 ℃，相对湿度为 52%-56%，12 h光照/12 h黑暗交替，自由饮水进食，隔日更换垫料，保持笼内清洁干燥。
适应性饲养1周后，采用随机数字表法将56只SD大鼠随机分为空白组(n=13)、模型组(n=13)、电针组(n=10)、左卡尼汀组(n=10)、非经非穴组(n=10)。动物实验已通过宁夏医科大学实验动物中心实验动物福利伦理委员会批准，伦理号：IACUC-NYLAC-2021-130。
1.4 实验方法
1.4.1 建立大鼠少弱精症模型除空白组外，其余4组大鼠均建立少弱精症模型。空白组大鼠给予10 mL/kg生理盐水灌胃，其余4组均给予200 mg/(kg·d)腺嘌呤灌胃[10]，连续给药28 d，建立少弱精症模型。从造模开始起，每3 d称体质量1次，每日观察并记录大鼠的外观体征、行为活动、进食、尿便、毛发光泽度和脱落情况，以及对外界刺激敏感度等。
造模成功标准：造模结束后，除空白组以外，其余4组大鼠均出现“肢体倦怠、精神萎靡、小便量增多”等一系列基本符合中医“肾阳虚”的证候表现。从空白组与模型组大鼠中各随机选取3只，腹腔注射2.5%戊巴比妥钠麻醉后处死，取肾脏与睾丸组织进行苏木精-伊红染色，显微镜下显示模型组大鼠肾脏与睾丸组织出现明显病理损伤，提示造模成功。

1.4.2 分组治疗验证造模成功后即开始进行治疗。
电针组：参考郭义的《实验针灸学》附录二《常用实验动物针灸穴位》结合中国针灸协会发布的《实验动物常用穴位名称与定位第2部分：大鼠》选取穴位，确定大鼠针灸穴位定位，选取中极、关元、足三里、三阴交。四穴定位方法如下：①关元：脐下约25 mm处；②中极：关元下，生殖器基部，腹股沟韧带上缘；③足三里：膝关节后外侧，在腓骨头下约3 mm处；④三阴交：后肢内踝尖直上10 mm处。操作时将大鼠固定在操作台上，左手固定针刺部位皮肤，右手持一次性针，迅速刺入穴位，足三里和三阴交应直刺，中极、关元向会阴方向斜刺、浅刺，以免伤及膀胱；使用岳增辉的《刺法灸法学》中的“提插补法”，操作方法：在得气处反复实行小幅度重插轻提手法，手法每次持续1 min。然后链接SDZ-Ⅱ型华佗牌电针仪，因为疏密波可以改善血液循环，组织营养状态[11]，因此电针仪采用疏密波，频率2 Hz，刺激强度为1.5 mA，以大鼠针刺部位肌肉轻微抖动为度。电针仪同时连接所有治疗穴位，同步进行电针治疗，1次/d，每次30 min，连续治疗28 d。
左卡尼汀组：给予左卡尼汀口服液10 mL/(kg•d)灌胃治疗[10]，连续治疗28 d。
非经非穴组：共选取非穴位点3个，分别标记为非穴位点1、非穴位点2、非穴位点3，操作方法和电针组完全一致。非穴点1：大鼠肘尖和腋窝连线中点；非穴点2：肱骨内上髁与尺骨腕部连线中点；非穴点3：三角肌和二头肌的交界处。非经非穴点的选取依据：按照中国针灸协会发布的《实验动物常用穴位名称与定位第2部分：大鼠》，能够治疗泌尿生殖系统疾病相关的穴位有：关元、脾俞、肾俞、京门、次髎、神阙等，这些穴位主要分布在胸腹部、背部、下肢部，因此非经非穴点选取部位应首选上肢部；考虑到肘部穴位如曲池、曲泽等在临床上常用来治疗脾胃病，按照中医脾经与肾经的作用，可能会对实验结果造成一定影响，因此，在上肢部选取远离肘部的部位作为非经非穴点。
1.4.3 取材治疗结束后，腹腔注射2.5%戊巴比妥钠麻醉(50 mg/kg)麻醉所有大鼠后于心尖处采血4 mL，1 200 r/min离心10 min，取上清液后分装，置于-80 ℃冰箱中保存，用于血清中性激素水平检测。随后处死所有大鼠，摘取肾脏和睾丸组织，称质量并记录，放入多聚甲醛中常温固定48 h。
1.4.4 计算脏器系数计算肾脏与睾丸脏器系数。脏器系数(%)=脏器质量/体质量×100%。
1.4.5 精液质量检测取大鼠一侧附睾尾，置于37 ℃生理盐水中孵育5 min；将附睾剪碎制成精子悬液，吸取10 μL精子悬液滴在提前预热的载玻片上，通过计算机辅助精子分析仪评估精子数量、存活率、活力率。精子存活率=活动精子数/总精子数×100%。
1.4.6 苏木精-伊红染色观察睾丸、肾脏组织形态结构将固定好的肾脏与睾丸组织样本用流水冲洗4 h，放入梯度乙醇中脱水、透明，包埋成蜡块，使用切片机切5 μm厚石蜡切片，在46 ℃纯水中展片，然后捞出，65 ℃烤片2 h。将切片放入苏木精染液中染色3 min，用自来水洗，用分化液分化10 s，用自来水冲洗后返蓝5 s，用流水冲洗；放入梯度乙醇中脱水，放入伊红染色液中染色5 min，二甲苯透明，中性树胶封固，置于显微镜下观察并拍照。
1.4.7 酶联免疫吸附法检测性激素水平取各组大鼠血清样品，严格按照大鼠酶联免疫吸附法试剂盒说明书进行相应操作，在反应终止5 min内使用酶标仪在450 nm波长下读取吸光度值并记录，计算标准品和样品的平均吸光度值，绘制标准曲线，计算各组大鼠血清中睾酮、促性腺激素释放激素、抑制素B、卵泡刺激素、黄体生成素、雌二醇、泌乳素水平。
1.5 主要观察指标各组大鼠肾脏和睾丸脏器系数，精子数量、存活率和活力率，肾脏与睾丸组织病理形态学变化，血清中睾酮、促性腺激素释放激素、卵泡刺激素、黄体生成素、雌二醇、抑制素 B、泌乳素水平。
1.6 统计学分析采用SPSS 27.0软件统计分析，Graphpad Prism 8.0软件进行分析作图，各组结果以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，P < 0.05时差异有显著性意义。该文统计学方法已经宁夏医科大学生物统计学专家审核。

讨论

中医的“肾”由现代医学中的泌尿系统功能所指的“内肾”及下丘脑-垂体-性腺轴系统和解剖学的外生殖器官归属所指的“外肾”组成[12]。男性精室属外肾，其组成包括睾丸、附睾、前列腺、精囊腺[13]。“肾精”包括禀受于父母的“先天之精”以及由脾胃运化水谷精微，用来灌溉五脏六腑的“后天之精”。先天之精是构成胚胎的原始物质，是生命的基础；后天之精使五脏六腑之精充盛，剩余部分藏于肾中，二者相互依存，在肾中密切组合而成为“肾精”。《素问·上古天真论》云：“丈夫八岁……二八肾气盛，天癸至，精气溢泻，阴阳和，故能有子”，男子在十六岁左右时，若肾精充足，则肾精在天癸的作用下，产生生殖之精，并在此时趋于成熟，若肾精不足，即精室不能充盈则致“少精”；生殖之精能正常疏泄，即精室得以发挥其生精、藏精、施精的功能，是肾阴敛藏之性与肾阳激发之性相互协调的结果。若肾阴不足时，相火偏旺，敛藏不及而宣发太过，则见梦遗；若肾阳虚衰，敛藏太过而宣发不及，则精冷而致“弱精”。因此，少弱精子症所表现出的少精和弱精与中医证型中的“肾精亏虚，肾阳虚弱”相符合；血液中多种性激素的相互反馈调节作用保证了下丘脑-垂体-睾丸轴功能的平衡，这与中医阴阳互根互制的性质也极为相似。中极穴属任脉，膀胱募穴，有温补肾阳的功效，常用于治疗男性不育症[14]。关元穴属任脉，为小肠募穴[15]，是元阴元阳交关之所，三焦之气之所出，肾间动气之所发，为补肾助阳第一要穴。所谓“腧穴所在，主治所在”，中极、关元位置都分布在任脉上，内应精室，二穴配伍，能够调理冲任、固本培元，使天癸至、肾精足、肾气盛、推动精子发生、使精室充盈。足三里为胃经下合穴，是常用的保健要穴，针刺足三里能健脾胃、益气血，补肾精；三阴交属足太阴脾经，能够益气健脾，补益肝肾。足三里、三阴交相配伍能够协助脾胃化生水谷精微，推进后天之精的产生，增强中极、关元补肾益精的功效。
在男性体内，下丘脑-垂体-睾丸轴通过多种性激素调控睾丸产生精子，其基本过程为：下丘脑释放促性腺激素释放激素，刺激垂体前叶释放黄体生成素和卵泡刺激素，黄体生成素刺激睾丸间质细胞促进睾酮的生成[16]，卵泡刺激素通过睾丸支持细胞维持睾丸功能[17]，与睾酮共同促进精子的发生[18]。还有研究表明，促性腺激素释放激素也可以直接作用于睾丸影响睾酮的生成[19]。
促性腺激素释放激素由下丘脑分泌，是下丘脑-垂体-睾丸轴的最关键调控因子，促性腺激素释放激素水平能够间接反映下丘脑-垂体-睾丸轴的状态与睾丸产生精子的能力[20]。此次实验中模型组大鼠血清促性腺激素释放激素水平显著降低，电针组大鼠血清促性腺激素释放激素水平明显升高，说明电针能够良好调控促性腺激素释放激素水平。睾酮是评价精子数量和质量的关键指标之一，是最能直观反映男性生殖健康水平的性激素，睾酮分泌不足时，精子数量减少、质量降低[21]。血液中睾酮的水平受到黄体生成素与卵泡刺激素的调节[22]。黄体生成素和卵泡刺激素水平过高会使睾丸细胞发生变性[23]，卵泡刺激素水平过高还会抑制精子发生过程[24]。有研究发现，抗癌药物BUS诱导小鼠少弱精子症2周后，卵泡刺激素与黄体生成素水平明显降低[25]。SARS-CoV-2感染严重程度与男性不育存在相关性，能够引起人体内性激素水平改变，康复后的患者体内黄体生成素与卵泡刺激素水平较康复前降低[26]。用麒麟丸治疗雷公藤诱导的少弱精子症大鼠第60天时，模型组卵泡刺激素与黄体生成素水平均显著升高，麒麟丸治疗组大鼠血清中这两种激素水平较模型组明显降低[27]。在上述实验中，除致病因素外，治疗周期与开始治疗时间点不同，性激素的变化趋势不同，因此，可以猜测血液中卵泡刺激素与黄体生成素水平可能与肾功能损伤时长有关。此次实验造模与治疗共经历56 d，周期较长，模型组大鼠血清黄体生成素与卵泡刺激素水平较空白组显著升高，电针组大鼠血清睾酮与促性腺激素释放激素水平较模型组显著升高，卵泡刺激素与黄体生成素水平较模型组显著降低，说明电针刺激“中极”“关元”“足三里”“三阴交”4穴能够促进睾酮的分泌、抑制卵泡刺激素与黄体生成素水平的异常升高。
泌乳素在雄性动物体内主要参与性激素间的调控作用，而对精子产生没有直接关联。有研究表明，精液参数正常男性的泌乳素水平较低，少精子症和无精子症患者血清中泌乳素水平显著升高[28]。泌乳素过高会抑制性腺轴的分泌作用，从而抑制精子的发生[29]。此次实验中模型组大鼠血清泌乳素水平升高，经过电针组大鼠血清泌乳素水平降低，说明电针能够抑制少弱精大鼠泌乳素的分泌。雌二醇是由性腺和大脑分泌、在男性体内发挥主要生物活性的雌激素[30]，对下丘脑-垂体-睾丸轴有重要调节作用[30]。雌二醇对黄体生成素和卵泡刺激素有负反馈作用，是下丘脑-垂体-睾丸轴的重要调节激素[31]。有研究发现，雌二醇水平过高会损伤支持细胞和睾丸间质细胞，引起周围结缔组织的脂肪变性，缩小男性精索小管直径，导致患者生育能力受损[32]。此次实验中模型组大鼠血清雌二醇水平升高，电针组大鼠血清雌二醇水平逐渐降低，说明电针能够抑制少弱精大鼠雌二醇的分泌。抑制素B是调节男性下丘脑-垂体-睾丸轴的重要因子，有研究发现抑制素B与睾酮水平无直接相关性，但抑制素B仍然与精子发生有高度相关性，能够反映精子质量和睾丸功能状态[33]，原因为：抑制素B在卵泡刺激素的作用下于睾丸中产生，反过来激活垂体产生卵泡刺激素并与抑制素B相互作用共同调节下丘脑-垂体-睾丸轴[34-36]。此次实验中模型组大鼠血清抑制素B水平显著降低，电针组大鼠血清抑制素B水平显著升高，说明电针能够促进抑制素B的分泌。
腺嘌呤在细胞内参与多种生理生化过程，但高剂量腺嘌呤能够引起肾小管梗阻和肾单位缺失，导致肾功能损伤，造成体内激素代谢紊乱，最终影响下丘脑-垂体-睾丸轴的调节功能[37]，肾功能损伤会引起体内氧化应激水平升高，产生大量自由基，损伤睾丸细胞[38-39]，最终引起少弱精子症。还有研究表明，腺嘌呤诱导的慢性肾衰竭通过抑制17β-羟基类固醇氧化还原酶来降低睾丸功能，该酶可将雄烯二酮转化为睾酮[40]。因此，此次实验选择使用腺嘌呤建立大鼠少弱精子症模型。左卡尼汀是哺乳动物体内天然的抗氧化剂，能够参与细胞能量代谢，减少精子的抗氧化损伤[41]。大量研究证明，左卡尼汀可以显著改善精子活力、形态和浓度，同时提高睾酮和黄体生成素水平[42]。此次实验采用左卡尼汀作为阳性药物对照组，电针组与左卡尼汀组各项指标间对比均无统计学意义，验证了左卡尼汀对少弱精子症的良好治疗效果，同时也验证了电针“中极、关元、足三里、三阴交”对少弱精子症大鼠疗效良好，且针刺具有适应范围广、操作简便、无药物毒副作用等优势，电针较普通针刺更能够增强疗效。非经非穴组大鼠由于没有遵循循经取穴的原则，各项实验数据与电针组比较差异较大，同样验证了“中极、关元、足三里、三阴交”对少弱精子症大鼠良好的治疗效果。
综上所述，电针法选取“中极、关元、足三里、三阴交”4穴能够改善“下丘脑-垂体-睾丸轴”功能、调控相关性激素水平，有效治疗腺嘌呤诱导的大鼠少弱精子症。由于资金和技术的不足，该研究存在局限性：对下丘脑-垂体-睾丸轴的研究不够透彻。在接下来的研究中将采取质谱等多种检测方法、转录组学以及蛋白组学从基因和蛋白角度进行更深入的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

电针调控少弱精子症模型大鼠“下丘脑-垂体-睾丸轴”的作用机制

Regulatory mechanism of electroacupuncture on hypothalamic-pituitary-testicular axis in oligospermic rats

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