基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠

doi:10.12307/2025.604

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (14): 2943-2950.doi: 10.12307/2025.604

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基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠

杨坤，章容，吴越，雷小平，谌云川，康兰，董文斌

西南医科大学附属医院儿童医学中心新生儿科，四川省出生缺陷临床医学研究中心，四川省泸州市 646000

收稿日期:2024-04-26 接受日期:2024-06-26 出版日期:2025-05-18 发布日期:2024-09-28
通讯作者: 董文斌，博士生导师，教授，主任医师，西南医科大学附属医院儿童医学中心新生儿科，四川省出生缺陷临床医学研究中心，四川省泸州市 646000
作者简介:杨坤，男，1987年生，四川省安岳县人，汉族，主治医师，西南医科大学在读博士，主要从事新生儿疾病的基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81571480)，项目负责人：董文斌；四川省科技计划重点研发项目(2022YFS0062)，项目负责人：董文斌；泸州市科技计划项目(2022-JYJ-122)，项目负责人：章容

Construction of a mouse model for alveolar type II epithelial cell-specific knockout of SENP1 gene based on the Cre-loxP recombinase system

Yang Kun, Zhang Rong, Wu Yue, Lei Xiaoping, Shen Yunchuan, Kang Lan, Dong Wenbin

Department of Neonatology, Children’s Medical Center, The Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Sichuan Clinical Research Center for Birth Defects, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2024-04-26 Accepted:2024-06-26 Online:2025-05-18 Published:2024-09-28
Contact: Dong Wenbin, Doctoral supervisor, Professor, Chief physician, Department of Neonatology, Children’s Medical Center, The Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Sichuan Clinical Research Center for Birth Defects, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Yang Kun, MD candidate, Attending physician, Department of Neonatology, Children’s Medical Center, The Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Sichuan Clinical Research Center for Birth Defects, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81571480 (to DWB); Sichuan Provincial Science and Technology Program Key Research and Development Project, No. 2022YFS0062 (to DWB); Luzhou Municipal Science and Technology Program, No. 2022-JYJ-122 (to ZR)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
Cre重组酶：从大肠杆菌噬菌体P1中发现的一种DNA重组酶，基因编码区序列全长1 029 bp。Cre重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的loxp位点，介导loxp位点间的基因序列删除或重组。
LoxP序列：来源于噬菌体P1中一段长度为34 bp的DNA序列，由2个13 bp的反向重复序列和1个不对称的8 bp间隔区共同组成。反向重复序列是Cre重组酶的特异识别和结合区域，而间隔区域决定了loxP位点的方向。

背景：前期在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系，在细胞水平上研究了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。
目的：基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型。
方法：将SENP1flox/-小鼠自交得到SENP1flox/flox和SENP1flox/-小鼠；将Sftpc-Cre+/+小鼠与野生型小鼠交配获得更多的Sftpc-Cre+/-小鼠。将Sftpc-Cre+/+或子代Sftpc-Cre+/-小鼠与SENP1flox/-或子代SENP1flox/flox小鼠进行杂交，获得SENP1flox/-Sftpc-Cre+/-双杂合小鼠。将SENP1flox/-Sftpc-Cre+/-小鼠与SENP1flox/flox小鼠杂交，获得SENP1flox/floxSftpc-Cre+/-小鼠。剪鼠尾提取基因组DNA，行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定小鼠基因型。取SENP1flox/flox和SENP1flox/floxSftpc-Cre+/-小鼠肺组织行免疫荧光双标实验及Western blot以验证SENP1敲除效果；取SENP1flox/flox和SENP1flox/floxSftpc-Cre+/-小鼠心、肝、肺、肾组织行苏木精-伊红染色以观察两组小鼠各脏器的组织形态。
结果与结论：琼脂糖凝胶电泳正确筛选出SENP1flox/floxSftpc-Cre+/-小鼠。免疫荧光双标实验显示，与SENP1flox/flox小鼠相比， SENP1flox/floxSftpc-Cre+/-小鼠肺组织中SENP1的平均荧光强度降低(P < 0.01)，且SENP1和Sftpc未见明显共定位(P < 0.01)。Western blot结果显示，与SENP1flox/flox小鼠相比，SENP1flox/floxSftpc-Cre+/-小鼠肺组织中SENP1蛋白表达降低(P < 0.001)。苏木精-伊红染色结果显示SENP1flox/flox和SENP1flox/floxSftpc-Cre+/-小鼠的心、肝、肺和肾脏组织形态无明显改变。该研究利用Cre-loxP重组酶系统成功构建了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠，为后续研究SENP1基因在以肺泡Ⅱ型上皮细胞为主要损伤细胞的肺疾病如支气管肺发育不良、特发性肺纤维化中的作用提供了良好的工具。
https://orcid.org/0000-0002-6252-2782(杨坤)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: SENP1, Cre-loxP重组酶系统, 肺泡Ⅱ型上皮细胞, 条件性基因敲除, 小鼠

Abstract: BACKGROUND: Previously, a SENP1 gene-silenced human alveolar epithelial cell line was successfully constructed in vitro, and the role of SENP1 in hyperoxic lung injury was investigated at the cellular level.
OBJECTIVE: To construct a mouse model of alveolar type II epithelial cell-specific knockout of SENP1 gene based on the Cre-loxP recombinase system.
METHODS: SENP1flox/- mice were self-crossed to obtain SENP1flox/flox and SENP1flox/- mice; Sftpc-Cre+/+ mice were crossed with wild-type mice to obtain more Sftpc-Cre+/- mice. Sftpc-Cre+/+ or offspring Sftpc-Cre+/- mice were crossed with SENP1flox/- or offspring SENP1flox/flox mice to obtain SENP1flox/-Sftpc-Cre+/- double heterozygous mice. SENP1flox/-Sftpc-Cre+/- mice were then crossed with SENP1flox/flox mice to obtain SENP1flox/floxSftpc-Cre+/- mice. The genomic DNA was extracted by tail clipping and amplified by PCR. The amplified product was subjected to agarose gel electrophoresis to determine the mouse genotypes. Lung tissues of SENP1flox/flox and SENP1flox/floxSftpc-Cre+/- mice were subjected to immunofluorescence double-labelling and western blot assay to verify the knockdown effect of SENP1 gene. Heart, liver, lung and kidney tissues of SENP1flox/flox and SENP1flox/floxSftpc-Cre+/- mice were stained with hematoxylin-eosin to observe the histomorphology of each organ in the two groups of mice.
RESULTS AND CONCLUSION: SENP1flox/floxSftpc-Cre+/- mice were correctly screened by agarose gel electrophoresis. Immunofluorescence double-labeling experiments showed that the mean fluorescence intensity of SENP1 was reduced in lung tissues of SENP1flox/floxSftpc-Cre+/- mice compared with that of SENP1flox/flox mice (P < 0.01) and no significant co-localization of SENP1 and Sftpc was observed (P < 0.01). Western blot results showed that SENP1 protein expression was reduced in lung tissues of SENP1flox/floxSftpc-Cre+/- mice compared with SENP1flox/flox mice (P < 0.001). Hematoxylin-eosin staining showed no significant alterations in the histomorphology of heart, liver, lung and kidney tissues in SENP1flox/flox and SENP1flox/floxSftpc-Cre+/- mice. This study successfully constructed alveolar type II epithelial cell-specific knockout SENP1 gene mice using the Cre-loxP recombinase system, which provides a good tool for the subsequent study of the role of SENP1 gene in lung diseases such as bronchopulmonary dysplasia and idiopathic pulmonary fibrosis, in which alveolar type II epithelial cells are the main damage cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: SENP1, Cre-loxP recombinase system, alveolar type II epithelial cells, conditional knockout, mouse

中图分类号:

杨坤, 章容, 吴越, 雷小平, 谌云川, 康兰, 董文斌. 基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(14): 2943-2950.

Yang Kun, Zhang Rong, Wu Yue, Lei Xiaoping, Shen Yunchuan, Kang Lan, Dong Wenbin. Construction of a mouse model for alveolar type II epithelial cell-specific knockout of SENP1 gene based on the Cre-loxP recombinase system[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(14): 2943-2950.

图/表（结果） 6

2.1 小鼠SENP1基因型鉴定在SENP1基因5′arm反应体系中，SENP1纯合子(SENP1flox/flox)小鼠在398 bp处可见条带，杂合子(SENP1flox/-)小鼠在341 bp和398 bp处可见条带，野生型小鼠在341 bp处可见条带。在SENP1基因3′arm反应体系中，SENP1纯合子小鼠在438 bp处可见条带，杂合子小鼠在384 bp和438 bp处可见条带，野生型小鼠在384 bp处可见条带，见图2。
2.2 小鼠Sftpc-Cre基因型鉴定在Sftpc-Cre基因WT反应体系中，Sftpc-Cre纯合子小鼠(Sftpc-Cre+/+)在386 bp处无条带，Sftpc-Cre杂合子小鼠(Sftpc-Cre+/-)和野生型小鼠在386 bp处有条带；在Sftpc-Cre基因3′arm反应体系中，Sftpc-Cre+/+和Sftpc-Cre+/-小鼠在352 bp处有条带，野生型小鼠在352 bp处无条带，见图3。
2.3 小鼠SENP1flox/-Sftpc-Cre+/-双杂合基因型的鉴定图4为小鼠SENP1flox/-Sftpc-Cre+/-基因型鉴定结果。根据表4判读得出311，314，317，318为SENP1flox/-Sftpc-Cre+/-双杂合小鼠。
2.4 SENP1基因肺特异性敲除小鼠(SENP1flox/floxSftpc-Cre+/-)的鉴定图5为小鼠SENP1flox/floxSftpc-Cre+/-基因型鉴定结果。根据表4判读得出411，413和416为SENP1flox/flox Sftpc-Cre+/-小鼠。
2.5 SENP1基因肺特异性敲除效果免疫荧光双标实验显示，与SENP1flox/flox小鼠相比，SENP1flox/floxSftpc-Cre+/-小鼠肺组织中SENP1的平均荧光强度显著降低(P < 0.01)。见图6A，B。与SENP1flox/flox小鼠相比，SENP1flox/flox Sftpc-Cre+/-小鼠肺组织中SENP1和Sftpc未见明显的共定位(P < 0.01)。见图6A，C。Western blot结果显示，与SENP1flox/flox小鼠相比，SENP1flox/floxSftpc-Cre+/-小鼠肺组织中SENP1蛋白表达降低(P < 0.001)。见图7。以上结果说明SENP1基因在肺泡Ⅱ型上皮细胞中的敲除效果满意。
2.6 SENP1flox/flox小鼠及SENP1flox/floxSftpc-Cre+/-小鼠各脏器组织形态学改变肺组织苏木精-伊红染色显示SENP1flox/flox 小鼠和SENP1flox/floxSftpc-Cre+/-小鼠肺泡发育均良好，无炎症渗出，肺泡腔无异常增大，肺泡间隔无断裂，见图8A。与SENP1flox/flox小鼠相比，SENP1flox/floxSftpc-Cre+/-小鼠的平均线性截距和放射状肺泡计数均无统计学意义(P > 0.05)，见图8B，C。以上结果说明在生理情况下，肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因不会对肺发育造成影响。为了进一步观察肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因对小鼠其他脏器的影响，取SENP1flox/flox小鼠和SENP1flox/flox Sftpc-Cre+/-小鼠的心、肝和肾组织，通过苏木精-伊红染色观察到两组小鼠的心、肝和肾脏器发育良好，无明显病变，见图9。Western blot结果显示，SENP1flox/flox小鼠和SENP1flox/floxSftpc-Cre+/-小鼠的心、肝和肾组织中SENP1蛋白表达无统计学意义(P > 0.05)，见图10。这些结果说明在生理情况下，肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因不会对其他脏器造成影响。

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引言

小泛素相关修饰因子(small ubiquitin-related modifier，SUMO)与底物蛋白赖氨酸残基共价结合的过程称为SUMO化修饰[1]，它参与蛋白质的稳定和定位、蛋白质到亚细胞的转运、蛋白质-DNA 和蛋白质-蛋白质的相互作用，调节包括转录、增殖、细胞凋亡和应激反应等多种细胞生物学事件[2]。SUMO特异性蛋白酶(SUMO-specific proteases，SENPs)家族是一类去SUMO化修饰的酶，同时也具有促进SUMO前体成熟的作用[3]。SENPs家族通过上述2种方式调节细胞内底物蛋白SUMO化修饰和去SUMO化修饰之间的生理平衡。SENPs家族包括SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6和SENP7 6个成员，其中SENP1是研究最为广泛的[4]。SENP1在控制小鼠遗传学表型、维持组织稳态、调控肿瘤进展等方面发挥着重要作用[5]。研究表明，敲除SENP1基因可通过抑制缺氧诱导因子1α信号来减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤[6]。值得注意的是，SENP1介导底物蛋白的去SUMO化修饰过程可能对维持肺的正常发育至关重要[7]。课题组先前研究显示，在高氧诱导的肺损伤中，SENP1降低沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)的表达并促进其核质穿梭，以此抑制SIRT1的去乙酰化活性来促进细胞凋亡[8]。临床研究表明，新生儿呼吸窘迫综合征患儿的外周血单个核细胞中SENP1蛋白高表达，而布地奈德联合猪肺磷脂注射液预防支气管肺发育不良的一个潜在分子机制可能是抑制高氧引起的外周血单个核细胞中SENP1的增加，从而减少SIRT1的核质穿梭[9]，因此以SENP1为靶点可能是干预支气管肺发育不良的重要策略。
肺泡Ⅱ型上皮细胞具有肺上皮干细胞的特性，它除了产生肺表面活性物质来稳定肺泡外，还具有免疫调节、修复和再生等多种功能[10]。由于肺泡Ⅱ型上皮细胞是很多疾病如特发性肺纤维化[11]、新冠肺炎[10]、支气管肺发育不良的主要损伤细胞[12]，因此以肺泡Ⅱ型上皮细胞为研究对象有助于了解上述疾病的发病机制及寻找潜在的治疗靶点。前期课题组在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系[13]，在细胞层面探索了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。为了进一步在动物水平验证这个结果，该研究利用Cre-loxP重组酶系统，选取SENP1flox/-小鼠与肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性表达肺表面活性蛋白C (surfactant protein C，Sftpc)的重组酶工具鼠C57BL/6JGpt-Sftpc-IRES-iCre(以下简称Sftpc-Cre 或Cre)进行数代杂交，成功构建了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠，为研究SENP1在生理或病理情况下对肺泡Ⅱ型上皮细胞功能的影响提供良好的动物模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计 SENP1基因条件性敲除小鼠模型的构建与鉴定。
1.2 时间及地点实验于2022年9月至2024年3月在西南医科大学实验动物中心和四川省出生缺陷临床医学研究中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SENP1flox/-小鼠(2雌2雄，6-8周龄，体质量20 g左右)购自上海邦耀生物科技有限公司，许可证号：SCXK(鄂)2021-0025；Sftpc-Cre+/+小鼠(1雄1雌，6-8周龄，体质量20 g左右)购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(川)2020-034。购回的小鼠立即饲养于西南医科大学动物实验中心SPF级动物间，在12 h的明暗循环、20-26 ℃的温度范围和50%-60%的湿度范围内自由进食和饮水。
该研究经西南医科大学实验动物伦理委员会批准，审批号为SWMU20240021。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。

1.3.2 主要试剂与仪器 One Step Mouse Genotyping Kit (PD101-01)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；鉴定基因鼠所用的引物分别由上海邦耀生物科技有限公司和江苏集萃药康生物科技有限公司设计，由北京擎科生物科技有限公司和生工生物工程(上海)股份有限公司合成。鉴定小鼠SENP1基因和Sftpc-Cre基因引物序列信息见表1。SENP1抗体(ab300126)购自Abcam；Sftpc抗体(10774-1-AP)购自武汉三鹰；β-actin抗体(AF7018)购自Affinity；FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(ZF-0312)和罗丹明标记山羊抗兔IgG(H+L)(ZF-0316)购自中杉金桥；DL2000 Plus DNA Marker(MD101-02)和Ultra GelRed(GR501-01)购自南京诺唯赞；PageRuler™ Prestained Protein Ladder(26616)购自赛默飞；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(P1200-2)和50×TAE 缓冲液(T1060)购自索莱宝；SignalUp™ Western检测增敏剂(P0272)和40 g/L多聚甲醛固定液(P0099)购自碧云天。

1.4 实验方法
1.4.1 SENP1基因肺特异性敲除小鼠模型的建立按照图1的方式获得SENP1flox/floxCre+/-小鼠。简单来说，先将SENP1flox/-小鼠自交得到SENP1flox/flox小鼠，然后将SENP1flox/-和Sftpc-Cre+/-小鼠交配得到SENP1flox/-Cre+/-小鼠，最后将SENP1flox/flox小鼠和SENP1flox/-Cre+/-小鼠交配得到SENP1flox/ floxCre+/-小鼠。

1.4.2 实验分组剪鼠尾行基因鉴定后，将小鼠分为对照组(SENP1flox/flox)和实验组(SENP1flox/ floxCre+/-)。取7-10 d龄对照组和实验组小鼠(n=3)心、肝、肺、肾组织，免疫荧光双标实验和Western blot方法检测SENP1基因在肺部的

敲除效果；Western blot方法检测SENP1基因在心、肝、肾脏器的表达；苏木精-伊红染色观察对照组和实验组小鼠心、肝、肺、肾的组织学形态变化。

1.4.3 小鼠DNA的提取及扩增对1周龄小鼠进行标记，剪鼠尾约3 mm，放入1.5 mL离心管。根据One Step Mouse Genotyping Kit试剂盒快速提取小鼠基因组DNA。按照说明书配制新鲜的1×裂解液。单个样品所需裂解液配制方法为Proteinase K 4 μL，1×

Mouse tissue Lysis Buffer 200 μL。取200 μL 1×裂解液加入到所需裂解的组织中，涡旋振荡后在55 ℃水浴中孵育20 min。孵育结束，将样品置于95 ℃金属浴中加热5 min灭活Proteinase K。将裂解产物涡旋振荡充分混匀后，12 000 r/min离心5 min，取上清进行PCR反应。对SENP1基因小鼠的鉴定需进行两组 PCR反应，分别为5′arm反应体系和3′arm反应体系；对Sftpc-Cre基因小鼠的鉴定需进行两组 PCR反应，分别为WT反应体系和3′arm反应体系。将2×Taq Plus Master Mix (Dye Plus)解冻完全后，上下颠倒混匀，于冰上按表2配制各反应体系。配置完成后，按照表3的条件进行PCR反应。

1.4.4 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳将5×TAE用超纯水稀释成1×TAE。称取1.2 g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入新鲜配置的1×TAE缓冲液120 mL，配制成1%琼脂糖凝胶，置于微波炉中加热至完全熔化，取出室温下降温至60 ℃左右，缓慢倒入制胶模具中，室温下静置30 min，拔出梳子，将凝胶置于电泳槽中。按照布局进行加样，每个泳道加样4 μL，设置120 V，40 min的电泳条件进行电泳。电泳结束，将凝胶置于3×Ultra GelRed染色液室温孵育15-30 min。将凝胶置于凝胶成像系统显像，记录结果。
1.4.5 小鼠基因鉴定结果判读根据上海邦耀生物科技有限公司和江苏集萃药康生物科技股份有限公司提供的鉴定方案对结果进行判读，见表4。

1.4.6 免疫荧光双标实验检测SENP1基因敲除效果取7-10 d龄SENP1flox/ flox和SENP1flox/ floxCre+/-小鼠肺组织(n=3)，40 g/L多聚甲醛固定过夜，经30%蔗糖溶液及30%蔗糖与OCT的混合溶液对肺组织进行梯度脱水，将脱好水的肺组织进行包埋，置于冰冻切片机上切片，厚度为8 µm，切片室温放置30 min，PBST洗涤切片4次，每次5 min，去除OCT，切片置于0.5% TritonX-100中室温孵育20 min，PBST洗涤切片4次，每次5 min，加入10%封闭用正常山羊血清封闭1 h，弃封闭液，加入SENP1一抗(1∶100)和Sftpc一抗(1∶100)4 ℃孵育过夜，PBST洗涤切片4次，每次5 min，加入二抗TRITC(1∶100)和二抗FITC(1∶100)，室温避光孵育2 h，弃二抗，PBST洗涤切片4次，滴加抗荧光淬灭封片液(含DAPI)，在激光共聚焦显微镜下观察并采集图像。
1.4.7 Western blot验证SENP1基因敲除效果取7-10 d龄SENP1flox/flox和SENP1flox/floxCre+/-小鼠肺组织(n=3)，在冰上提取肺组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加入5×蛋白上样缓冲液对样品进行变性，然后进行SDS-PAGE电泳，转膜，7.5%脱脂奶粉封闭70 min，PBST洗涤PVDF膜3次，每次5 min，加入一抗SENP1(1∶3 000)和β-actin(1∶5 000)，4 ℃摇床孵育过夜，PBST洗涤PVDF膜3次，每次10 min，加入二抗孵育(1∶2 000)，室温摇床1 h，PBST洗涤PVDF膜3次，每次10 min，加入ECL发光液进行曝光，用Image J软件检测SENP1和β-actin的灰度值，用SENP1灰度值除以β-actin灰度值作为SENP1蛋白的相对表达量。
1.4.8 苏木精-伊红染色取7-10 d龄SENP1flox/flox和SENP1flox/floxCre+/-小鼠的肺、心、肝、肾组织(n=3)，40 g/L多聚甲醛固定过夜，对上述各组织进行包埋，置于石蜡切片机上进行切片，厚度为4 µm，将切片置于二甲苯中脱蜡2次，每次10 min，将切片依次置于体积分数为100%，95%，70%乙醇溶液中浸泡5 min，蒸馏水洗涤切片3次，每次5 min，加入苏木精染色10 min，自来水冲洗去除多余的苏木精染色液，加入0.5%伊红染液，染色3 min，将切片依次放入体积分数为95%，100%乙醇溶液中脱水2次，每次5 min，将切片置于二甲苯中浸泡2次，每次5 min，用中性树胶封固，显微镜下观察并采集图像。使用平均线性截距和放射状肺泡计数评估肺泡有无损伤[14]。
1.5 主要观察指标 ①PCR琼脂糖凝胶电泳结果观察小鼠基因型；②免疫荧光双标观察SENP1的平均荧光强度及SENP1和Sftpc的共定位情况；③Western blot检测SENP1蛋白在心、肝、肺、肾脏器的表达水平：④苏木精-伊红染色观察小鼠肺、心、肝、肾的组织学形态变化。
1.6 统计学分析应用GraphPad Prism 8.0和Image J软件处理实验数据，SPSS 22.0软件进行统计分析。所有数据以x±s表示。两组之间的比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过西南医科大学生物统计学专家审核。

讨论

Cre-loxP重组酶系统是一种重要的基因编辑工具，通过对DNA序列进行删除、插入、易位及倒位，从而在特定的细胞类型中对目的基因进行定向改造。Cre-loxP重组酶系统具有高效、准确、快速和时空特异性等特点，在转基因动物方面得到了广泛的应用[15-17]。既往已有研究利用该系统成功构建出肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除组蛋白去乙酰化酶3基因小鼠模型[18]、胰岛β细胞特异性敲除PDHA1基因小鼠模型[19]、软骨组织特异性敲除印第安刺猬蛋白基因小鼠模型等[20]。这些结果说明Cre-loxP重组酶系统是一项成熟、安全和可行的技术。
作为一种翻译后修饰，越来越多的研究表明SUMO化修饰与肺发育或肺疾病相关。CCAAT增强子结合蛋白alpha (CCAAT enhancer binding protein alpha，C/EBPα)是一种调节细胞生长和分化的转录因子，研究发现在肺分化过程中SUMO修饰的C/EBPα水平降低，并与肺表面活性物质的分泌呈负相关，提示SUMO修饰参与了C/EBPα介导的肺分化[21]。在支气管肺发育不良模型中，大鼠肺组织中SUMO1和SUMO化修饰的C/EBPα水平增加，而敲除 SUMO1则会增加C/EBPα和肺表面活性物质来促进肺分化。从机制上讲，C/EBPα的SUMO化水平降低与糖原消耗减少有关。此外，SUMO化修饰还调节大鼠肺中 C/EBPα与转化生长因子β2的相互作用[22]。因此，研究底物蛋白的SUMO化修饰有助于了解某些肺疾病新的发病机制。
SENPs家族是重要的去SUMO化修饰的酶，它们通过介导底物蛋白的SUMO修饰和去SUMO修饰的平衡在很多肺部疾病中发挥重要作用。例如，SENP3通过缺氧诱导因子1α促进M1巨噬细胞极化和促炎细胞因子的产生来加剧脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤[23]。SENP1通过减少缺氧诱导因子1α的SUMO化修饰来增加其稳定性，从而增强肺动脉平滑肌细胞的增殖能力，这参与了缺氧性肺动脉高压所致的肺血管重构的发病机制[24]。此外，在脂多糖诱导的肺成纤维细胞中，SENP1表达上调，CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor，CTCF)和FOXA2表达下调，而敲低SENP1可促进CTCF的SUMO 化修饰，从而使CTCF的稳定性及其与FOXA2结合能力得到增强，CTCF依赖于FOXA2的活化来发挥抗炎和抗凋亡作用[25]。在缺氧条件下，SENP1调控克吕珀尔样因子15的丰度和核定位来抑制精氨酸酶2的表达而成为肺动脉内皮细胞稳态的关键调节因子[26]。此外，SENP1调控卵泡抑素结合蛋白1的去 SUMO化修饰是增强转化生长因子β1 信号通路介导的肺泡上皮细胞老化和肺纤维化的重要靶点[27]。这些研究说明SENP1在肺发育或肺疾病中发挥重要作用，以SENP1为研究靶点可能有助于深入了解肺发育或肺疾病的分子机制。重要的是，WAN等[28]发现在大鼠肺发育过程中SENP1与游离SUMO1的变化一致，为了进一步研究SENP1在肺发育中的作用，在肺泡Ⅱ型上皮细胞中敲除SENP1基因，进一步观察到肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡增加、增殖减少和分化受损，由此推测SENP1是肺发育所必需的。然而，此研究仅仅是从细胞层面上得出的结果，在动物水平上并没有很好地验证SENP1对肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响。该研究利用Cre-loxP重组酶系统构建了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型，通过苏木精-伊红染色显示构建的SENP1肺特异性敲除小鼠在生理情况下不会因为SENP1基因的敲除而出现肺发育障碍，因此有必要进一步的研究来验证SENP1在肺发育和肺疾病中的作用。
肺泡Ⅱ型上皮细胞是肺组织中最重要的细胞类型之一，它不仅调控肺结构的正常发育，而且还是很多肺疾病发病的关键靶细胞。例如，在新生大鼠支气管肺发育不良模型中，肺泡Ⅱ型上皮细胞中自噬小体-溶酶体结合所必需的蛋白Synaxin 17表达减少有助于高氧诱导的自噬通量阻断[29]。此外，肺泡Ⅱ型上皮细胞无法维持生理性肺再生而促进异常的上皮-间充质转化形成的纤维化成为近年来特发性肺纤维化新的发病机制[30]。这些结果说明以肺泡Ⅱ型上皮细胞为载体来研究特定基因的功能对认识肺疾病的分子机制意义重大。该研究选用肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性表达Sftpc蛋白的重组酶工具鼠成功对小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞中SENP1基因进行敲除。将Sftpc和SENP1进行免疫荧光双标实验来反映SENP1基因敲除效果。SENP1flox/flox小鼠SENP1在肺泡Ⅱ型上皮细胞中可见正常表达，且SENP1和Sftpc存在共定位关系，而SENP1flox/flox Sftpc-Cre+/-小鼠SENP1在肺泡Ⅱ型上皮细胞中荧光强度明显减弱，且SENP1和Sftpc未见明显的共定位关系。Western blot检测显示SENP1flox/floxSftpc-Cre+/-小鼠肺组织中SENP1蛋白表达明显低于SENP1flox/flox小鼠，说明SENP1在肺泡Ⅱ型上皮细胞中敲除效果满意。此外，对SENP1flox/flox Sftpc-Cre+/-和SENP1flox/flox小鼠的心、肺、肝和肾进行苏木精-伊红染色，结果显示各脏器发育良好，无明显的组织异常，说明肺泡Ⅱ型上皮细胞中特异性敲除SENP1是一个安全、可靠的实验动物模型。
综上所述，该研究利用Cre-loxP重组酶系统成功对小鼠SENP1基因进行打靶，利用肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性表达Sftpc的重组酶工具鼠和打靶的SENP1基因鼠进行数代杂交，成功构建了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因的小鼠模型，为后续进一步研究SENP1在支气管肺发育不良和特发性肺纤维化等肺部疾病发病中的分子调控机制提供了良好的动物模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠

Construction of a mouse model for alveolar type II epithelial cell-specific knockout of SENP1 gene based on the Cre-loxP recombinase system

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